基于BSA-seq的一個(gè)苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體基因定位

摘要：葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所，葉色突變往往制約水稻具有充足的源，研究葉色突變體對(duì)選育高光效品種以及進(jìn)一步解析葉色調(diào)控的分子機(jī)制均具有重要意義。以育種中間材料苗期葉片黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry為對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀分析，并對(duì)其突變性狀進(jìn)行遺傳分析、基因定位。結(jié)果顯示，該突變體3葉期前植株呈淡黃色至白色，4葉期變綠，除成熟期株高顯著高于野生型以外，其他主要農(nóng)藝性狀均無顯著差異。通過遺傳分析確定該突變體的黃化轉(zhuǎn)綠表型受隱性單基因控制。利用gry突變體與野生型的F2群體構(gòu)建混池，通過BSA-seq的ΔSNP-index和ED 2種算法進(jìn)行基因定位，結(jié)果顯示gry基因被定位在22.23～26.77 Mb區(qū)間內(nèi)。在該區(qū)間內(nèi)開發(fā)KASP標(biāo)記對(duì)62個(gè)F2黃化轉(zhuǎn)綠單株進(jìn)行驗(yàn)證與連鎖分析，驗(yàn)證gry基因在21.18～25.30 Mb區(qū)間內(nèi)。基于定位區(qū)間，結(jié)合基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)與水稻基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)候選基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os03g40020，測(cè)序表明該基因在第1 768位發(fā)生單堿基T缺失，導(dǎo)致編碼的氨基酸大量改變而產(chǎn)生功能變化。

關(guān)鍵詞：苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體；BSA-seq；ΔSNP-index算法；ED算法

中圖分類號(hào)：S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）12-0053-07

水稻是全球主要的糧食來源。水稻產(chǎn)量形成主要受“源、庫(kù)、流”及其相互之間的協(xié)調(diào)關(guān)系影響［1］。水稻葉片是主要的源性狀，它是植物進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所，水稻產(chǎn)量的90%以上來自葉片的光合作用，葉色突變往往制約水稻具有充足的源，并且葉色突變體是研究葉綠體發(fā)育、葉綠素生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用機(jī)制的理想材料，葉色突變的分子機(jī)制又是復(fù)雜多樣的［2］。因此，水稻葉色突變體研究不僅可以為選育強(qiáng)源的高光效品種提供理論依據(jù)，還可以進(jìn)一步解析葉色調(diào)控的分子機(jī)制。

有關(guān)水稻葉色突變體的研究是廣泛而持續(xù)的，水稻葉色突變體包括黃化、斑馬、斑點(diǎn)、類病斑、滯綠、白化、紫色、白化轉(zhuǎn)綠等不同類型的表型［3-8］。目前已經(jīng)克隆了100多個(gè)相關(guān)基因，如參與葉綠體發(fā)育的SPP（編碼基質(zhì)加工肽酶，表型為白化）、AL1（編碼質(zhì)體核糖體L12蛋白，表型為白化致死）、ClpP（編碼Clp蛋白酶水解亞基，表型為黃化轉(zhuǎn)綠）、OsALBL（編碼三角狀五肽蛋白，表型為白化），參與光捕獲的OsLIL3（編碼捕光色素蛋白，表型為黃綠葉）和DYE1（編碼光系統(tǒng)Ⅰ中捕光復(fù)合物Ⅰ的一個(gè)亞基Lhca4，表型為持綠）；參與葉綠素生物合成的OsCAO1（編碼葉綠素a加氧酶，表型為淡綠葉）、OsCHLD（編碼鎂螯合酶的CHLD亞基，表型為黃化葉）和YGL1（編碼葉綠素合成酶，表型為黃化轉(zhuǎn)綠）；參與葉綠素降解的OsSGR（編碼鎂離子去螯合酶，表型為持綠）、YPD1（編碼LRR-Like1蛋白，表型為黃化）和NYC1（編碼葉綠素b還原酶，表型為滯綠）［9-18］。其中PPR（pentatricopeptide repeat，PPR）基因表達(dá)受阻易形成白化表型，該基因編碼的五肽蛋白在真核生物中無處不在，在原核生物中也有報(bào)道［19-20］。大多數(shù)植物三角狀五肽蛋白被定位在線粒體、質(zhì)體（葉綠體）上，也有研究將PPR定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核。在水稻中，大約每1.6 Mb就存在一個(gè)PPR基因，目前水稻中有400多個(gè)非冗余的PPR蛋白，并且不同位置的PPR蛋白具有不同的功能。例如位于線粒體的PPR（FLO18）可以調(diào)控線粒體功能和水稻胚乳發(fā)育，位于細(xì)胞質(zhì)中的PPR（OsCPPR1）有助于花粉發(fā)育，位于葉綠體的PPR（YSA）缺失對(duì)不同溫度和光照條件下雄性不育性不產(chǎn)生影響，并對(duì)雜種F1的產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀沒有負(fù)面影響［21-24］。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，BSA-seq已經(jīng)逐漸成熟，并且準(zhǔn)確性有了明顯提高、成本也大幅降低［25-26］。將BSA-seq與傳統(tǒng)定位方法相結(jié)合可以快速、有效地獲得/縮小定位區(qū)間［27-28］。本研究利用該方法，將苗期黃化轉(zhuǎn)綠基因快速定位在22.23～26.77 Mb，并推測(cè)候選基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os03g40020，該基因編碼1個(gè)與葉綠體發(fā)育相關(guān)的三角狀五肽重復(fù)蛋白，以期為選育高光效品種及解析葉色調(diào)控的分子機(jī)制提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

gry是鎮(zhèn)稻18號(hào)中間材料的一個(gè)自然突變，經(jīng)過多代種植表明黃化轉(zhuǎn)綠表型可以穩(wěn)定遺傳。gry與9311構(gòu)建的F2群體作為分析群體，gry與野生型構(gòu)建的F2群體作為定位群體。試驗(yàn)材料均種植于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所行香創(chuàng)新基地，5月10日播種，6月15日移栽，單本種植，株行距 13.3 cm×25.0 cm。在拔節(jié)孕穗期取葉片提取DNA用于 BSA-seq。在成熟期，分別選取gry與野生型各20株進(jìn)行農(nóng)藝性狀測(cè)定，包括株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、千粒重。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BSA-seq混池構(gòu)建及測(cè)序

播種后10 d，用掛牌區(qū)分gry與野生型構(gòu)建的F2群體中黃化與正常表型個(gè)體，移栽時(shí)分開種植。根據(jù)Takagi等的方法，在拔節(jié)孕穗期取gry與野生型親本各20株，F(xiàn)2群體突變與正常個(gè)體各40株，提取DNA并檢測(cè)其濃度，分別等量混合構(gòu)建P1池（gry）、P2池（鎮(zhèn)稻18號(hào)中間材料）、R池（黃化轉(zhuǎn)綠型F2）、D池（正常表型F2）［29］。然后對(duì)應(yīng)構(gòu)建文庫(kù)，并采用Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組重測(cè)序，測(cè)序深度30×。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

首先利用FastQC 0.11.5對(duì)測(cè)序結(jié)果（Raw reads）進(jìn)行質(zhì)量控制得到Cleaned reads。再利用BWA 0.7.9將有效數(shù)據(jù)（Cleaned reads）比對(duì)到參考基因組（http：//plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index）上［30］。然后利用SAMtools 1.0比對(duì)對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，利用Picard 1.120標(biāo)記重復(fù)reads［31］。利用Picard V4.0局部重新比對(duì)與堿基質(zhì)量校正。最后利用重復(fù)標(biāo)記后的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行覆蓋度、深度等統(tǒng)計(jì)。利用SAMtools 1.0檢測(cè)、過濾SNP及InDel信息；利用VEP 4.3注釋單核苷核多態(tài)性（SNP）及InDel結(jié)果。基于以上獲得的信息，利用MutMap pipeline進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算SNP在R池和D混池出現(xiàn)的頻率，對(duì)ΔSNP-index （2個(gè)子代池的SNP-index 的差值）進(jìn)行滑窗作圖后，出現(xiàn)1個(gè)峰，該處就是連鎖區(qū)域，即可得到和突變表型連鎖的染色體區(qū)段和可能的突變位點(diǎn)［32］。同時(shí)，本研究還采用ED（euclidean distance）算法，通過計(jì)算不同混池間各突變型的頻率距離，采用距離差異來反映標(biāo)記與目標(biāo)區(qū)域的連鎖強(qiáng)度［33］。

1.2.3 定位區(qū)間分析驗(yàn)證

基于BSA-seq區(qū)間，結(jié)合基因注釋與RiceVarMap2 （ncpgr.cn）公布的 4 726 個(gè)水稻品種的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，推測(cè)候選基因。然后選取候選基因內(nèi)的變異位點(diǎn)與高峰兩側(cè)的變異位點(diǎn)各1個(gè)，設(shè)計(jì)引物開發(fā)KASP標(biāo)記，選取62個(gè)F2單株進(jìn)行驗(yàn)證。引物利用SNPWay（http：//www.snpway.com/）進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物信息見表1，KASP檢測(cè)委托武漢市景肽生物科技有限公司進(jìn)行。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 21對(duì)突變體與野生型、秈稻93-11相互雜交的F2群體進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，對(duì)突變體與野生型的株高、有效穗數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等表型數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型分析

突變體葉子在三葉期前植株呈淡黃色至白色（圖1-A），四葉期變綠（圖1-B），成熟期與野生型一樣呈綠色（圖1-C）。成熟期對(duì)突變體與野生型進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果顯示突變體株高顯著高于野生型，穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株有效穗數(shù)無顯著差異（表2）。

2.2 gry突變性狀的遺傳分析

gry突變體分別與綠色野生型（粳稻）、93-11（秈稻）雜交，F(xiàn)1代均表現(xiàn)為綠色，F(xiàn)2代均出現(xiàn)黃化轉(zhuǎn)綠表型與綠色表型分離現(xiàn)象。經(jīng)卡方（χ2）檢驗(yàn)，黃化轉(zhuǎn)綠植株與綠色植株數(shù)量符合3 ∶1的分離比（表3）。遺傳分析結(jié)果表明，gry突變體的黃化轉(zhuǎn)綠表型是隱性的，受單基因控制。

2.3 測(cè)序質(zhì)量分析

對(duì)來自gry×野生型的F2群體極端個(gè)體及雙親分別構(gòu)建的P1池（gry）、P2池（鎮(zhèn)稻18號(hào)中間材料）、R池（黃化轉(zhuǎn)綠型F2）、D池（正常表型F2）進(jìn)行全基因組重測(cè)序，共獲得23.05 Gbp數(shù)據(jù)量，過濾后數(shù)據(jù)22.85 Gbp，并且過濾后數(shù)據(jù)質(zhì)量主要分布在Q30≥88%以上，GC含量在40%～41%。另外，P1、P2、R池、D池中分別有98.00%、99.00%、98.73%、98.63%的Clean Reads數(shù)比對(duì)到參考基因組（表4），這說明測(cè)序數(shù)量與質(zhì)量均合格，可用于后續(xù)分析。

2.4 SNP和InDel多態(tài)性分析

經(jīng)過檢驗(yàn)、過濾，如表5所示，共鑒定出4 266個(gè)SNPs、435個(gè)InDels在雙親間有多態(tài)性。其中，SNP和InDel標(biāo)記在12條染色體上的平均密度分別為11.43 SNP/Mb和1.17 InDel/Mb，每條染色體都有充分多、高質(zhì)量的標(biāo)記可以用于BSA-seq分析。

2.5 基因定位及候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)ΔSNP-index方法分析，以95%置信區(qū)間作為閾值，在第3號(hào)染色體上鑒定出1個(gè)候選區(qū)間；根據(jù)ED方法分析，在第3號(hào)、第9號(hào)染色體上共鑒定到2個(gè)區(qū)間。由于黃化轉(zhuǎn)綠表型由單基因控制，結(jié)合2種算法，本研究將2種方法重疊的1個(gè)區(qū)間（22.23～26.77 Mb）認(rèn)為是最終的候選區(qū)間（圖2）。

根據(jù)BSA-seq測(cè)序結(jié)果分析，候選區(qū)間內(nèi)共有684個(gè)SNP變異位點(diǎn)和156個(gè)Indel變異，這些變異位于58個(gè)基因。結(jié)合MSU-RGAP和RAP-DB 2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因注釋篩選出LOC_Os03g40020、LOC_Os03g44850、LOC_Os03g44880、LOC_Os03g44890、LOC_Os03g44900 5個(gè)基因。然后通過RiceVarMap2 （ncpgr.cn）公布的4 726個(gè)水稻品種的變異位點(diǎn)與5個(gè)初篩基因中的變異位點(diǎn)的對(duì)比分析，排除了4個(gè)基因中的變異位點(diǎn)，推測(cè)候選基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os03g40020［33］。該基因編碼1個(gè)與葉綠體發(fā)育相關(guān)的三角狀五肽重復(fù)蛋白，該基因僅由1個(gè)外顯子組成，通過突變體與野生型的測(cè)序比對(duì)表明：該基因在第1 768位發(fā)生單堿基T缺失，突變位點(diǎn)位于外顯子上，屬于移碼突變，導(dǎo)致該基因編碼的742個(gè)氨基酸中153個(gè)發(fā)生改變（圖3），從而影響其功能。因此將該基因確定為本研究的候選基因。

2.6 目標(biāo)區(qū)間及變異位點(diǎn)驗(yàn)證

本研究選取候選基因LOC_Os03g40020內(nèi)的變異位點(diǎn)與高峰兩側(cè)的變異位點(diǎn)各1個(gè)，設(shè)計(jì)KASP標(biāo)記3-2223、3-2118、3-2530，基因分型結(jié)果顯示，3個(gè)標(biāo)記可以用于區(qū)分不同基因型。然后利用F2群體中的突變表型單株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記3-2118處有1個(gè)交換株，標(biāo)記3-2223處有0個(gè)交換株，標(biāo)記3-2530處有27個(gè)交換株，并且左右兩邊交換株不同，這表明gry基因位于3-2118（21.18 Mb）和3-2530（25.30 Mb）之間，且3-2118為共分離標(biāo)記（圖4）。結(jié)合標(biāo)記3-2118所在變異位點(diǎn)為基因LOC_Os03g40020內(nèi)引起的功能變異，本研究認(rèn)為，黃化轉(zhuǎn)綠表型是由LOC_Os03g40020基因突變引起的。

3 討論

水稻葉片是水稻最主要的源器官，提高源器官的光合效率能有效提高水稻單產(chǎn)。水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多葉色相關(guān)的基因，但是多數(shù)葉色相關(guān)基因會(huì)伴有葉片早衰、生育期延遲、產(chǎn)量降低等不良性狀［8，34］。因此，挖掘不影響水稻綜合農(nóng)藝性狀的葉色相關(guān)基因具有重要意義。本研究的突變體除幼苗期表現(xiàn)明顯白化外，后期產(chǎn)量性狀與野生型相比無顯著差異，具有潛在利用價(jià)值。因此，本研究的目的是研究苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體的遺傳基礎(chǔ)，并通過BSA-seq分析確定候選基因，助力解析高光效品種強(qiáng)源機(jī)制及葉色調(diào)控的分子機(jī)制，同時(shí)為設(shè)計(jì)育種選育強(qiáng)源、高光效的高單產(chǎn)品種奠定基礎(chǔ)。

與傳統(tǒng)基因定位相比，BSA-seq更高效，但是分析過程中使用不同的計(jì)算方式、置信區(qū)間閾值等會(huì)使定位區(qū)間產(chǎn)生波動(dòng)，所以還需要結(jié)合傳統(tǒng)定位方式確定候選基因。例如，qFLT9通過BSA-seq方法被定位在9號(hào)染色體19.10～20.03 Mb區(qū)域，并通過連鎖圖譜分析將候選區(qū)域縮小到0.928 Mb的區(qū)間［35］。郭微利用BSA-seq中的ED算法將耐堿QTL定位在5條染色體上，InDel-index 算法將該QTL定位在第2號(hào)染色體，綜合這2種方法與傳統(tǒng)QTL定位結(jié)果進(jìn)一步確定了候選區(qū)域［36］。本研究中，利用ΔSNP-index方法分析，以95%置信區(qū)間作為閾值，在第3號(hào)染色體上鑒定出1個(gè)候選區(qū)間；利用ED方法分析，以95%置信區(qū)間作為閾值，在第3號(hào)染色體、第9號(hào)染色體上鑒定到2個(gè)區(qū)間。由于黃化轉(zhuǎn)綠表型由單基因控制，本研究將2種方法重疊的一個(gè)區(qū)間認(rèn)為是最終的候選區(qū)間。這也說明，若利用BSA-seq進(jìn)行QTL鑒定需要通過傳統(tǒng)方式驗(yàn)證，以排除算法等分析造成的影響。

另外，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量數(shù)據(jù)庫(kù)被發(fā)布，一些包含大量水稻基因組序列或者表型序列的數(shù)據(jù)庫(kù)為水稻相關(guān)研究提供了便利。本研究利用RiceVarMap2 （ncpgr.cn）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過查詢數(shù)據(jù)庫(kù)中堿基在指定位置的出現(xiàn)頻率排除變異位點(diǎn)。例如LOC_Os03g44850基因在25 304 267 bp處有A（突變型）、G（野生型）2種類型，通過數(shù)據(jù)查詢，4 726 個(gè)水稻品種中56.10%為A型，43.30%為G型，說明這個(gè)位點(diǎn)是一個(gè)常見變異位點(diǎn)。而本研究的黃化轉(zhuǎn)綠自然突變表型是一個(gè)非常規(guī)表型，因此可以將該位點(diǎn)排除。該數(shù)據(jù)庫(kù)的利用促進(jìn)了本研究的進(jìn)行，為普通水稻功能基因組研究者和水稻育種者提供了便捷有效的途徑。

本研究利用BSA-seq定位了1個(gè)隱性苗期黃化轉(zhuǎn)綠突變體基因gry，并利用KASP標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證，將區(qū)間確定在21.18～25.30 Mb區(qū)間內(nèi)。通過基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)與水稻基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)候選基因?yàn)長(zhǎng)OC_Os03g40020，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)gry基因與前人克隆的ysa基因［24］等位。但是通過對(duì)DNA序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，gry基因?yàn)?個(gè)堿基缺失，ysa基因?yàn)? bp缺失，并且缺失位置不同，ysa基因突變導(dǎo)致更多氨基酸的改變（圖3）。因此，本研究定位的gry基因是一個(gè)具有新的變異位點(diǎn)的LOC_Os03g40020等位基因。

參考文獻(xiàn)：

［1］邵奎添. 水稻庫(kù)源基因NAL1的生理功能研究［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

［2］賀治洲，尹 明，謝振宇，等. 水稻轉(zhuǎn)綠型葉色突變體研究進(jìn)展［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，34（8）：30-36，42.

［3］楊顏榕，黃纖纖，趙亞男，等. 水稻葉色基因克隆與分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2020，21（4）：794-803.

［4］王 豐. 水稻類病斑突變體lrd25的基因定位及特征特性分析［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

［5］廉院訓(xùn)，韋子蕓，張 強(qiáng)，等. 水稻斑馬葉突變體zl7的鑒定與基因的精細(xì)定位［J］. 中國(guó)水稻科學(xué)，2023，37（2）：113-124.

［6］劉亞萍. 水稻深綠穗基因DGP1的克隆與功能研究［D］. 金華：浙江師范大學(xué)，2017.

［7］李洋洋. 微型紫葉觀賞水稻新種質(zhì)“紫薇” 的創(chuàng)制［D］. 重慶：西南大學(xué)，2020.

［8］胡婷婷，何彎彎，王友霜，等. 水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體al14的表型分析及基因定位［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，37（6）：1361-1369.

［9］Yue R Q，Wang X F，Chen J Y，et al. A rice stromal processing peptidase regulates chloroplast and root development［J］. Plant and Cell Physiology，2010，51（3）：475-485.

［10］趙冬生. 水稻幼苗白化致死基因AL1和粒形基因GS9的克隆與功能分析［D］. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2016.

［11］Li W，Wu C，Hu G C，et al. Characterization and fine mapping of a novel rice narrow leaf mutant nal9［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2013，55（11）：1016-1025.

［12］李家飛. 水稻白化突變體albl和alblhc2的光合特性和基因克隆［D］. 上海：上海師范大學(xué)，2011.

［13］李春梅. 兩個(gè)水稻黃綠葉突變基因的圖位克隆及功能分析［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

［14］Yamatani H，Kohzuma K，Nakano M，et al. Impairment of Lhca4，a subunit of LHCI，causes high accumulation of chlorophyll and the stay-green phenotype in rice［J］. Journal of Experimental Botany，2018，69（5）：1027-1035.

［15］Yang Y L，Xu J，Huang L C，et al. PGL，encoding chlorophyllide a oxygenase 1，impacts leaf senescence and indirectly affects grain yield and quality in rice［J］. Journal of Experimental Botany，2016，67（5）：1297-1310.

［16］Deng X J，Zhang H Q，Wang Y，et al. Mapped clone and functional analysis of leaf-color gene Ygl7 in a rice hybrid （Oryza sativa L.ssp.indica）［J］. PLoS One，2014，9（6）：e99564.

［17］Wu Z M，Zhang X，He B，et al. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis［J］. Plant Physiology，2007，145（1）：29-40.

［18］Shin D，Lee S，Kim T H，et al. Natural variations at the Stay-Green gene promoter control lifespan and yield in rice cultivars［J］. Nature Communications，2020，11：2819.

［19］Pusnik M，Small I，Read L K，et al. Pentatricopeptide repeat proteins in Trypanosoma brucei function in mitochondrial ribosomes［J］. Molecular and Cellular Biology，2007，27（19）：6876-6888.

［20］李景芳，王寶祥，劉 艷，等. PPR蛋白在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能研究進(jìn)展［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2022，23（2）：358-367.

［21］Li S B，Sun Q P，Hu M H，et al. Phylogenetic genomewide comparisons of the pentatricopeptide repeat gene family in indica and japonica rice［J］. Biochemical Genetics，2012，50（11）：978-989.

［22］Yu M Z，Wu M M，Ren Y L，et al. Rice FLOURY ENDOSPERM 18 encodes a pentatricopeptide repeat protein required for 5′ processing of mitochondrial nad5 messenger RNA and endosperm development［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（5）：834-847.

［23］Zheng S Y，Dong J F，Lu J Q，et al. A cytosolic pentatricopeptide repeat protein is essential for tapetal plastid development by regulating OsGLK1 transcript levels in rice［J］. New Phytologist，2022，234（5）：1678-1695.

［24］Su N，Hu M L，Wu D X，et al. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production［J］. Plant Physiology，2012，159（1）：227-238.

［25］李輝平，駱 昕，侯子強(qiáng)，等. 基于BSA-seq技術(shù)挖掘糙皮側(cè)耳抗螨候選基因［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，202 8（6）：1648-1656.

［26］Liang T M，Chi W C，Huang L K，et al. Bulked segregant analysis coupled with whole-genome sequencing （BSA-seq） mapping identifies a novel pi21 haplotype conferring basal resistance to rice blast disease［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（6）：2162.

［27］Xin W，Liu H L，Yang L M，et al. BSA-seq and fine linkage mapping for the identification of a novel locus （qPH9） for mature plant height in rice （Oryza sativa）［J］. Rice，2022，15（1）：26.

［28］Kaur G，Yadav I S，Bhatia D，et al. BSA-seq identifies a major locus on chromosome 6 for root-knot nematode （Meloidogyne graminicola） resistance from Oryza glaberrima［J］. Frontiers in Genetics，2022，13：871833.

［29］Takagi H，Abe A，Yoshida K，et al. QTL-seq：rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations［J］. The Plant Journal，2013，74（1）：174-183.

［30］Li H，Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform［J］. Bioinformatics，2009，25（14）：1754-1760.

［31］Abe A，Kosugi S，Yoshida K，et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap［J］. Nature Biotechnology，201 0（2）：174-178.

［32］Hill J T，Demarest B L，Bisgrove B W，et al. MMAPPR：mutation mapping analysis pipeline for pooled RNA-seq［J］. Genome Research，2013，23（4）：687-697.

［33］Zhao H，Li J C，Yang L，et al. An inferred functional impact map of genetic variants in rice［J］. Molecular Plant，2021，14（9）：1584-1599.

［34］姚曉云，藍(lán)海軍，鄧 偉，等. 水稻淡白葉突變體的葉綠素含量測(cè)定及農(nóng)藝性狀比較分析［J］. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，32（12）：12-15.

［35］Chen D G，Zhou X Q，Chen K，et al. Fine-mapping and candidate gene analysis of a major locus controlling leaf thickness in rice （Oryza sativa L.）［J］. Molecular Breeding，2022，42（2）：6.

［36］郭 微. 利用QTL定位和BSA-seq分析鑒定堿脅迫下水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的候選基因［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

收稿日期：2023-06-30

基金項(xiàng)目：句容市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：ZA32221）；鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金（編號(hào)：QNJJ2018002）。

作者簡(jiǎn)介：杜燦燦（1989—），女，江蘇徐州人，碩士，助理研究員，主要從事水稻遺傳育種及推廣應(yīng)用研究。E-mail：20162804@jaas.ac.cn。

通信作者：龔紅兵，碩士，研究員，主要從事水稻新品種選育及推廣應(yīng)用研究。E-mail：hongbinggong973@sina.com。