水稻矮稈多分蘗突變體st1的表型特征與遺傳分析

摘要：分蘗發(fā)育相關(guān)的水稻突變體是水稻分蘗分子調(diào)控機(jī)制研究的理想材料。水稻矮稈多分蘗突變體st1之前由輻射誘變獲得，通過田間調(diào)查突變體st1的主要農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)與野生型SIPI的單株有效分蘗數(shù)比較，突變體st1的分蘗數(shù)顯著增加，達(dá)到野生型SIPI的3倍以上。將突變體st1與野生型SIPI雜交獲得F1代，種植后發(fā)現(xiàn)F1代植株的株高和分蘗數(shù)均接近野生型SIPI，收獲F1代植株上自交的種子即F2代種子，種植后發(fā)現(xiàn)存在株高和分蘗數(shù)差異顯著的2種表型植株，分別有矮稈多分蘗植株和接近野生型SIPI表型的植株。分別統(tǒng)計(jì)這2種表型植株在群體中的數(shù)量并通過卡方測驗(yàn)檢測。結(jié)果表明，F(xiàn)2代群體中矮稈多分蘗植株與接近野生型SIPI表型的植株數(shù)量比符合1 ∶3。利用BSA（bulked segregant analysis）測序分析方法定位ST1候選基因，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)主峰，但都沒有顯著的候選位點(diǎn)。通過qRT-PCR方法檢測10個(gè)已報(bào)道的矮稈多分蘗相關(guān)基因在突變體st1中的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)在突變體st1中D53、D3和TE的表達(dá)水平都顯著下降。

關(guān)鍵詞：水稻；矮稈多分蘗；突變體st1；表型特征；遺傳分析

中圖分類號(hào)：S511.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）12-0075-05

水稻在人類糧食安全保障中具有不可替代的作用［1］。土地資源不足、土壤鹽漬化、人口數(shù)量遞增等問題使得水稻產(chǎn)量近年來面臨更大的挑戰(zhàn)。株型改良一直是水稻育種專家考慮的重要指標(biāo)。Jiao等認(rèn)為，株型達(dá)到理想狀態(tài)可以顯著提高水稻產(chǎn)量［2］。水稻株型受株高、分蘗角大小、分蘗數(shù)以及穗形態(tài)特征等因素影響，其中分蘗數(shù)對(duì)水稻生產(chǎn)尤為重要，因此有必要挖掘和鑒定水稻分蘗相關(guān)的調(diào)控基因、分析其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為水稻株型改良進(jìn)而提升產(chǎn)量的育種目標(biāo)提供理論依據(jù)和生產(chǎn)指導(dǎo)。近年來，很多文獻(xiàn)報(bào)道了通過分離鑒定分蘗數(shù)減少、矮化叢生等分蘗數(shù)發(fā)生改變的水稻突變體，克隆調(diào)控水稻分蘗的基因［3-9］。通過對(duì)雙子葉植物和單子葉植物中已克隆的基因同源性比較，發(fā)現(xiàn)它們雖然在形態(tài)上有不同的分枝發(fā)育方式，但在分枝發(fā)育調(diào)控上存在一定的保守性和獨(dú)特性［3，10］。植物分蘗及分枝的調(diào)控機(jī)制主要有LS/LAS/MOC1途徑［3］、LAX/BA1 通路［5-6］、SPL 類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑［11-12］以及獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)途徑［7-8］。Kohlen等認(rèn)為，腋芽的生長過程受生長素、細(xì)胞分裂素以及獨(dú)腳金內(nèi)酯等不同植物激素相互調(diào)控［13］。典型的水稻分蘗突變體tillering and dwarf 1（tad1）/ tiller enhancer（te）、田間的植株形態(tài)是株高明顯矮化以及分蘗數(shù)顯著增加的主要原因。分子生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，TAD/TE在MOC1的上游起作用，同時(shí)作為多亞基E3泛素連接酶APC/CTAD/TE的重要成員，介導(dǎo)了其泛素化的降解，進(jìn)而發(fā)揮它在水稻分蘗芽起始過程中的調(diào)控作用［14］。很多獨(dú)腳金內(nèi)酯合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的突變體植株形態(tài)為株高矮化且分蘗數(shù)顯著增多。獨(dú)腳金內(nèi)酯與水稻分蘗有關(guān)，其信號(hào)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子是D53，可以與獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)途徑其他基因（D14、D3）形成蛋白復(fù)合體，在D14和D3存在的前提下，經(jīng)過蛋白酶體途徑，誘導(dǎo)D53蛋白發(fā)生降解，抑制其活性，從而影響水稻分蘗［15］。TB1基因可能是一類關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)途徑的下游發(fā)揮作用。僅存在于植物中的一類轉(zhuǎn)錄因子SQUAMOSA promoter binding protein-like（SPL），參與植物多個(gè)方面的生產(chǎn)發(fā)育過程，且扮演重要角色。OsSPL14/OsSPL17在水稻分蘗過程中起抑制作用，但正調(diào)控穗分枝的形成，過表達(dá)這2個(gè)基因中的任意一個(gè)，對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出分蘗數(shù)顯著減少，穗分枝數(shù)顯著增加。相反，干擾OsSPL14/OsSPL17的轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)均出現(xiàn)植株矮化、分蘗數(shù)增加的現(xiàn)象［12］。水稻分蘗突變體的利用使得在水稻分蘗分子調(diào)控機(jī)制方面獲得顯著的進(jìn)展，但仍然存在很多有待進(jìn)一步闡明的問題，如已報(bào)道的幾個(gè)不同水稻分蘗調(diào)控途徑存在的關(guān)系、LAX/BA1途徑在側(cè)芽發(fā)生及側(cè)芽生長過程中的調(diào)控機(jī)理等還不清楚，因此挖掘新的水稻分蘗相關(guān)突變材料，有利于更全面地了解水稻分蘗機(jī)理，進(jìn)而為水稻株型的改造和產(chǎn)量提高提供理論依據(jù)。筆者所在課題組將尼日利亞的農(nóng)家栽培品種SIPI種子在 60Co-γ射線下輻照處理，隨后連續(xù)自交多代篩選，篩選出1個(gè)水稻矮稈多分蘗突變體st1，表型穩(wěn)定遺傳。本研究鑒定突變體st1的表型，并對(duì)其基因的遺傳模式進(jìn)行分析，利用BSA測序分析方法定位ST1候選基因，進(jìn)而通過qRT-PCR分析10個(gè)已報(bào)道的矮稈多分蘗相關(guān)基因在突變體st1中的表達(dá)量，為后期ST1基因精細(xì)定位、克隆以及功能分析奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為水稻株型改良提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

突變體st1是輻射誘變的突變體，具體委托浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所操作，輻射對(duì)象是秈稻品種SIPI，來自尼日利亞。通過 60Co-γ 射線對(duì)SIPI干燥種子進(jìn)行輻照，輻射劑量為300 Gy。在M2代，田間篩選出矮稈多分蘗突變表型的單株，分單株收種并種植多代，獲得水稻矮稈多分蘗突變體材料，暫命名為st1，其突變性狀穩(wěn)定遺傳。2020年春季在位于海南省儋州市那大鎮(zhèn)寶島新村十隊(duì)的中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地種植突變體st1和野生型SIPI。種植行距20 cm、株距 13.5 cm，每穴插秧苗數(shù)為單株，田間灌水、施肥、防治病蟲害等依照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)的稻田進(jìn)行管理。

1.2 測定方法

1.2.1 突變體st1和野生型SIPI的農(nóng)藝性狀調(diào)查

2020年1月將突變體st1和野生型SIPI材料進(jìn)行播種種植，用五點(diǎn)取樣法對(duì)突變體st1和野生型SIPI的植株各隨機(jī)選取10株，分別調(diào)查株高、分蘗數(shù)、單株有效分蘗數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等農(nóng)藝性狀。

1.2.2 構(gòu)建F2代遺傳群體

在突變體st1和野生型SIPI的抽穗期，將突變體st1作為母本，野生型SIPI作為父本，人工去雄，套袋授粉雜交，經(jīng)過25 d左右即可獲得雜交種子F1代。2020年夏季種植F1代突變體st1和野生型SIPI，調(diào)查F1代植株的表型，將可能的假雜株全部排除后自交收獲F2代種子。2021年春季種植F2代突變體st1和野生型SIPI，構(gòu)建成遺傳分離群體，抽穗期觀察群體中植株的分離情況，并記錄不同表型植株的數(shù)量用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 突變體st1的BSA測序分析

抽穗期時(shí)在F2代分離群體中分別隨機(jī)挑選出30株矮化多分蘗表型極端單株和30株野生型表型極端單株，委托江蘇英德爾生物技術(shù)有限公司分別構(gòu)建2個(gè)DNA混池，通過二代測序（next-generation sequencing，NGS）的方法進(jìn)行基因組測序，測序深度為30倍。隨后計(jì)算2個(gè)混池的ΔSNP-index值和滑動(dòng)窗口作圖，結(jié)合基因注釋定位ST1候選基因。

1.2.4 10個(gè)已報(bào)道的矮稈多分蘗相關(guān)基因在突變體st1和野生型SIPI中的表達(dá)量分析

在苗期分別取突變體st1和野生型SIPI的葉片。采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的RNA提取純化試劑盒提取葉片總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit （D6110A）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在總體積為20 μL的體系中加入1 μL cDNA 模板、終濃度為0.2 μmol/L的擴(kuò)增引物以及熒光反應(yīng)混合液（SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa），使用熒光定量 PCR 儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分析已報(bào)道的矮稈多分蘗相關(guān)基因D53、D3、D14、D10、D17、D27、SPL14、SPL17、TB1、TE等10個(gè)基因在突變體st1和野生型SIPI中的表達(dá)量分析，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻矮稈多分蘗突變體st1的主要農(nóng)藝性狀分析

由圖1和表1可知，野生型SIPI的總分蘗數(shù)和單株有效分蘗數(shù)均只有10個(gè)左右，而突變體st1的總分蘗數(shù)約有39個(gè)，單株有效分蘗數(shù)約有32個(gè)，達(dá)野生型的3倍以上，顯著高于野生型。在生育期上，突變體st1的抽穗期比野生型晚6 d，其株高只有（49.03±0.63） cm，顯著矮于野生型。成熟期時(shí)，突變體st1的一級(jí)枝梗數(shù)和二級(jí)枝梗數(shù)均顯著少于野生型，但其結(jié)實(shí)率和千粒重?zé)o明顯變化（表1）。可見，突變體st1是一個(gè)典型的矮稈多分蘗突變體。

2.2 水稻矮稈多分蘗突變體st1的遺傳模式分析

種植并觀察由突變體st1與野生型雜交獲得的F1代種子，發(fā)現(xiàn)其株高和分蘗數(shù)均接近野生型SIPI。播種F1代植株上收獲的種子，構(gòu)建F2代群體，觀察發(fā)現(xiàn)存在株高和分蘗數(shù)差異顯著的2種表型植株，分別有矮稈多分蘗植株和接近野生型SIPI表型的植株，統(tǒng)計(jì)這2種表型植株的數(shù)量，利用卡方測驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。矮稈多分蘗植株和接近野生型SIPI表型的植株在F2代群體中的數(shù)量比符合1 ∶3，說明該突變性狀受1對(duì)隱性單基因控制。

2.3 水稻矮稈多分蘗突變體st1的BSA測序分析

為了獲得突變體st1中控制矮稈多分蘗的ST1候選基因，本研究在突變體st1與野生型SIPI雜交構(gòu)建獲得的F2代群體中挑選出2個(gè)子代混池，即隨機(jī)挑選出與野生型SIPI表型一致的30株子代單株，構(gòu)建成子代DNA混池1；隨機(jī)挑選出與矮稈多分蘗表型一致的30株子代單株，構(gòu)建子代DNA混池 2， 通過混池基因組測序進(jìn)行 BSA分析，" 結(jié)果如圖2所示。突變體st1在BSA分析中的ΔSNP-index散點(diǎn)圖顯示有3個(gè)主峰，但經(jīng)查詢主峰位置附近的 ΔSNP-index值均低于0.5，遠(yuǎn)低于0.66的閾值標(biāo)準(zhǔn)，沒有找到顯著性候選位點(diǎn)。

2.4 10個(gè)已報(bào)道的矮稈多分蘗相關(guān)基因在突變體st1中的表達(dá)量分析

為了解部分已報(bào)道的矮稈多分蘗相關(guān)基因在突變體st1中的表達(dá)是否有變化，本研究對(duì)D53、D3、D14、D10、D17、D27、SPL14、SPL17、TB1和TE進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果表明，與野生型SIPI相比，在突變體st1中D10、D17、D27、SPL14、TB1的表達(dá)水平都顯著上調(diào)，而D53、D3、TE的表達(dá)水平都顯著下降，D14和SPL17的表達(dá)水平在兩者之間，無顯著差異（圖3）。

3 討論與結(jié)論

迄今為止，水稻分蘗突變體的利用使得水稻分蘗的分子調(diào)控機(jī)制獲得了非常明顯的進(jìn)展，但還存在很多需進(jìn)一步闡明的問題。獨(dú)腳金內(nèi)酯是一類萜類植物激素，雖然在植物中普通存在，但在近些年才被發(fā)現(xiàn)，它在植物根部合成，然后運(yùn)輸?shù)街参锴o中［16］。已報(bào)道被命名為dwarf（d）的水稻分蘗相關(guān)突變體一般都是與獨(dú)腳金內(nèi)酯合成或信號(hào)途徑有關(guān)，它們的植物形態(tài)為矮化多分枝，如d3/d10/d17/d14/d27/d53［17-22］。突變體st1也是一個(gè)典型的矮稈多分蘗突變體，其總分蘗數(shù)是野生型SIPI的3倍以上，且其株高接近野生型SIPI的一半。ST1基因也參與獨(dú)腳金內(nèi)酯合成或?yàn)槠湫盘?hào)傳導(dǎo)途徑中的因子，還有待進(jìn)一步研究。F2代分離遺傳群體卡方測驗(yàn)結(jié)果表明，突變體st1的突變性狀是隱性性狀，由1對(duì)單基因控制。利用BSA測序分析方法定位ST1候選基因，發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)主峰，理論上候選基因位點(diǎn)處的ΔSNP-index值應(yīng)該趨近于0.66［23］，但本研究的ΔSNP-index值均小于0.5，沒有顯著的候選位點(diǎn)。導(dǎo)致這種情況的原因可能包括：構(gòu)成DNA混池的樣本量過小，需要增加更多的極端表型單株；本研究制作混池時(shí)先等量混合植株葉片，再抽DNA和測序，可能導(dǎo)致一些單株的DNA濃度過高或過低，從而導(dǎo)致ΔSNP-index值異常，應(yīng)該采用分單株抽DNA再等量混合的方法進(jìn)行測序；測序深度不夠，測序位置沒有覆蓋到突變基因處。下一步研究將在此基礎(chǔ)上優(yōu)化試驗(yàn)方法，繼續(xù)定位ST1候選基因。

Wang等認(rèn)為，與獨(dú)腳金內(nèi)酯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的D3、D14、D10、D17、D27、D53，以及SPL類轉(zhuǎn)錄因子OsSPL14/OsSPL17，這些基因負(fù)調(diào)控水稻的分蘗數(shù)［12］。OsMADS57抑制OsD14的表達(dá)，而OsTB1通過與OsMADS57發(fā)生互作，減弱這種抑制作用，實(shí)現(xiàn)經(jīng)過獨(dú)腳金內(nèi)酯的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)影響水稻的分蘗發(fā)育過程［24］。通過qRT-PCR分析突變體st1中D53、D3、D14、D10、D17、D27、SPL14、SPL17、TB1、TE的表達(dá)量水平，發(fā)現(xiàn)只有D53、D3、TE的表達(dá)水平顯著下降，說明D53、D3、TE等3個(gè)基因可能與突變體st1的矮稈多分蘗表型有關(guān)，但ST1基因是位于這些基因上游還是下游還有待進(jìn)一步確定，其與這些基因是如何相互作用的機(jī)制也需進(jìn)一步深入研究。這些結(jié)果為后期ST1基因的定位克隆和功能分析奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為水稻株型改良提供更多的理論依據(jù)。

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收稿日期：2023-08-17

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目（編號(hào)：322RC775、320RC727）；海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：321QN323）。

作者簡介：林秋云（1987—），女，海南海口人，博士，助理研究員，主要從事水稻種質(zhì)資源研究。E-mail：17889838484@163.com。

通信作者：賀治洲，博士，副研究員，主要從事水稻育種研究。E-mail：hzzdata@163.com。