N端攜帶HBGAs受體結合表位的兔出血癥病毒嵌合VP60蛋白的表達及其免疫原性

摘要：將HBGAs受體結合表位插入兔出血癥病毒（RHDV）衣殼蛋白VP60的N端，分析嵌合VP60蛋白的表達及病毒樣顆粒（VLPs）形成情況，并研究N端HBGAs受體結合表位的插入對嵌合VP60 蛋白免疫原性的影響。通過VP60蛋白N端起始位點HBGAs受體結合表位的插入，獲得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系統構建桿狀病毒重組質粒，命名為Bacmid-VP60-CR，轉染Sf9昆蟲細胞后，得到重組桿狀病毒rBac-VP60-CR，經HA、IFA和Western Blot鑒定，結果顯示，重組蛋白VP60-CR在Sf 9昆蟲細胞中得到高效表達，電鏡觀察顯示其可形成與VP60類似的VLPs結構。將重組蛋白免疫2月齡RHDV血清陰性的新西蘭兔，200 μg/只，免疫后每周采血檢測HBGAs表位抗體水平，同時在免疫后14 d，以RHDV WF株攻毒觀察VP60-CR重組蛋白的免疫保護效果。結果顯示，與VP60對照相比，VP60-CR蛋白可產生更高水平的針對HBGAs表位的抗體水平，且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV強毒的攻擊。本研究構建了一種N端插入HBGAs受體結合表位的嵌合VP60蛋白，為研究高免疫原性兔出血癥基因工程疫苗抗原奠定了基礎。

關鍵詞：兔出血癥病毒；VP60蛋白；HBGAs；病毒樣顆粒；免疫原性

中圖分類號：S855.3；S852.4 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0183-04

兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的高發病率和死亡率的烈性傳染病［1］，可分為GI.1（RHDV1）和GI.2（RHDV2）2種基因型，分別引起兔出血癥1型和兔出血癥2型，2種基因型病毒間無法產生有效交叉保護［2-4］。研究發現，RHDV的衣殼蛋白VP60可在體外自組裝成不含核酸的病毒樣顆粒（VLPs），與天然的RHDV病毒粒子在物理形態上高度相似且具有良好的免疫原性。

VP60蛋白是RHDV的主要結構蛋白，主要分為NTA區（N端臂，1～65 aa）、S結構域（66～229 aa）、P結構域（238～579 aa）和鏈接S與P結構域的鉸鏈區（Hinge，230～237aa）。NTA區和S結構域形成VLPs的內殼，P結構域位于VLPs的外表面，形成刺突結構［5］。據報道，VP60 NTA區和S結構域的抗原性較強，是P結構域的10～100倍［6］。組織血型抗原（Histo-blood group antigens，HBGAs）是兔出血癥病毒的結合受體，與兔對病毒感染的敏感性相關［7］。筆者所在實驗室前期已鑒定出1個HBGAs受體結合位點為VP60蛋白的326～331位氨基酸（NPISQV）［8］，其抗原性的高低對于抵抗病毒感染可能具有重要作用。本研究在VP60 N端起始位點插入該表位，構建了N端攜帶HBGAs受體結合表位的兔出血癥病毒嵌合VP60蛋白，并研究其VLPs形成能力和免疫原性，可為研究高免疫原性兔出血癥基因工程疫苗抗原奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒、菌種和細胞 pFastbac1-VP60重組質粒（GI.1型VP60）、Sf9昆蟲細胞由筆者所在實驗室保存；大腸桿菌 DH10 Bac，購自南京酶普利斯生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL 2 000、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒、ECL顯色試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；胎牛血清，購自GIBCO公司；FITC標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG，購自Biosharp公司；VP60單克隆抗體1D4由筆者所在實驗室制備保存；Taq高保真酶、脂質體Lipofectamine 3 000和Grace培養基，購自invitrogen公司；1.1×PCR mix，購自南京擎科生物科技有限公司；人O型紅細胞取自南京某醫院；其他試劑均為國產分析純化。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 擴增和鑒定的特異性引物見表1。

1.2.2 HBGAs受體結合表位插入的重組轉移載體的構建 筆者所在本實驗室保存的重組質粒pFastbac1-VP60為模板，以VP60 CR-F/R引物進行PCR反應，擴增N端插入HBGAs受體結合表位的VP60基因。PCR反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 7 min，30個循環；72 ℃ 5 min。將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行鑒定，120 V電泳30 min后，回收PCR陽性產物，使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒對PCR產物進行連接、轉化后，獲得的陽性菌液經pFastBac-F/R引物鑒定陽性后進行測序鑒定，獲得正確插入的桿狀病毒重組轉移載體pFastBac1-VP60-CR。

1.2.3 HBGAs受體結合表位插入的重組質粒的構建 將重組轉移載體pFastBac1-VP60-CR轉化DH10Bac感受態細胞，涂布LB平板（含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環霉素、100 μg/mL X-gal和40 μg/mL IPTG），37 ℃培養48 h后，挑取白色單菌落培養后提取質粒。以 M13-F/R通用引物進行PCR鑒定，獲得重組穿梭質粒Bacmid-VP60-CR。

1.2.4 細胞轉染 參照轉染試劑Lipofectamine 3000 說明書，將重組穿梭質粒Bacmid-VP60-CR轉染Sf9昆蟲細胞，轉染后每日觀察細胞形態，待細胞出現直徑變大、變圓、脫落等明顯病變時收獲細胞培養物，以1 000 r/min離心5 min收獲上清即為重組桿狀病毒（F1代病毒），命名為rBAC-VP60-CR。將F1代病毒液以1%體積比接種Sf9昆蟲細胞，接毒后48～72 h收獲細胞培養物，離心取上清獲得F2代病毒液。

1.2.5 間接免疫熒光檢測（IFA） 在24孔細胞培養板上，將重組桿狀病毒rBAC-VP60-CR接種到對數生長期的Sf9細胞，同時以感染野生型桿狀病毒的Sf9 細胞作陰性對照。在感染Sf9細胞24 h后，棄去培養液，PBS洗滌2次，加入-20 ℃預冷的甲醇-丙酮固定液，4 ℃作用1 h；PBS洗滌3次，加入1 ∶200倍稀釋的1D4單抗，37 ℃作用1 h；PBS洗滌3次后，加入1 ∶100倍稀釋的FITC標記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃下避光作用1 h；PBS洗滌3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 SDS-PAGE和Western Blot檢測 將重組桿狀病毒rBAC-VP60-CR接種Sf9細胞，72 h后收獲細胞培養物，反復凍融3次后進行SDS-PAGE電泳，然后轉印至PVDF膜上，經5%脫脂乳封閉過夜，TBST洗滌3次后，以1D4單抗（1 ∶1 000）為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1 ∶10 000）為二抗，進行Western Blot鑒定。

1.2.7 血凝效價測定 在96孔“U”形血凝板中每孔加入50 μL滅菌生理鹽水，然后在第1孔內分別加入50 μL感染重組病毒的細胞培養物，混勻后，吸取50 μL加入至第2孔中，如此連續稀釋至第15孔，第15孔吸取50 μL液體棄掉；第16孔為滅菌生理鹽水對照，同時以感染野生型桿狀病毒的Sf9 細胞作陰性對照；然后每孔加入50 μL 1%人O型紅細胞懸液，混勻，37 ℃下作用30 min后觀察結果。

1.2.8 電鏡觀察 對獲得的重組蛋白表達產物以紅細胞吸附釋放法［9］進行純化并超速離心，蛋白樣品VP60-CR經生理鹽水重懸后取少量置于銅網靜置2 min，加入2%磷鎢酸染液，利用投射電鏡觀察重組蛋白樣品并拍照。

1.2.9 免疫原性研究 參照筆者所在實驗室前期建立的間接ELISA法［10］檢測免疫兔血清中HBGAs受體結合位點特異性抗體水平。以8 μg/mL谷胱甘肽磁珠純化的HBGAs表位蛋白作為包被抗原，5%脫脂乳為封閉液。每孔加入100 μL 1 ∶100倍稀釋的待檢兔血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL 1 ∶10 000倍稀釋的羊抗鼠HRP-IgG，37 ℃ 避光孵育1.5 h，PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL TMB顯色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液終止反應，并于450 nm波長處檢測吸光度。

1.2.10 免疫保護性研究 將純化的VP60-CR蛋白稀釋至200 μg/mL，免疫兔出血癥病毒抗原和抗體均陰性的2月齡新西蘭兔5只，每只頸部皮下注射1 mL，同時以5只接種生理鹽水的新西蘭兔作為對照組。免疫后14 d，分別頸部皮下注射1 mL LD50的兔出血癥病毒，攻毒后連續觀察7 d，記錄家兔死亡情況。

2 結果與分析

2.1 重組轉移載體和重組穿梭載體的鑒定

以重組質粒pFastbac1-VP60為模板擴增得到HBGAs表位插入的桿狀病毒重組轉移載體pFastbac1-VP60-CR。經測序驗證后將重組轉移載體pFastbac1-VP60-CR轉化DH10Bac感受態細胞，挑取白色單菌落培養后提取質粒，經M13通用引物進行PCR鑒定，由圖1可知，擴增產物大小約為 4 000 bp，而陰性對照的擴增產物大小約為 300 bp，表明成功獲得重組穿梭載體Bacmid-VP60-CR。

2.2 間接免疫熒光檢測（IFA）

將重組桿狀病毒感染Sf9細胞，感染24 h后，以RHDV單抗1D4為一抗，FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行IFA鑒定。由圖2可知，感染重組桿狀病毒的細胞具有很強的特異性熒光，而感染野生型桿狀病毒的Sf9昆蟲細胞無特異性熒光出現，說明VP60 CR 蛋白得到有效表達。

2.3 SDS-PAGE和Western-Blot鑒定

對感染重組桿狀病毒的Sf9 細胞樣品進行 SDS-PAGE，轉印至PVDF膜后，以RHDV單抗1D4為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行Western Blot鑒定。由圖3可知，在約60 ku處出現明顯的蛋白條帶，與預期大小一致，表明VP60-CR蛋白得到有效表達。

2.4 表達蛋白的血凝效價測定

將重組桿狀病毒感染Sf9細胞，感染96 h后，以96孔“U”形血凝板對表達產物進行血凝效價測定。由表2可知，表達的重組蛋白能凝集人O型紅細胞，血凝效價為1 ∶4 096，表明VP60-CR蛋白得到高效表達。

2.5 電鏡觀察

由電鏡觀察結果（圖4）可知，表達蛋白可形成大小為35～40 nm、形態和結構與兔出血癥病毒VP60蛋白類似的VLPs，說明HBGAs表位的插入不影響VP60蛋白病毒樣顆粒的組裝。

2.7 免疫原性檢測

參照前期建立的間接ELISA檢測方法，采用HBGAs蛋白包被板檢測兔血清中中和表位HBGAs抗體水平變化，結果（圖5）表明，VP60-CR重組蛋白可在兔體內引發高水平抗HBGAs表位抗體，且抗體水平在21 d和28 d時顯著高于VP60對照組（Plt;0.05）。

2.8 免疫保護性檢測

將VP60-CR蛋白以紅細胞吸附釋放法進行純化后，以200 μg/只的劑量免疫RHDV血清陰性的2月齡新西蘭兔，14 d后進行攻毒，檢驗重組蛋白對家兔的免疫保護作用。由表3可知，以RHDV WF株攻毒，免疫組家兔獲得100%保護，而注射生理鹽水的對照組家兔全部死亡，表明表達的重組蛋白VP60-CR具有良好免疫保護性。

3 討論與結論

VP60作為RHDV的衣殼蛋白，可以自組裝成VLPs。因此，本研究對經典RHDV VP60基因進行表位改造后，利用BEVS系統，成功構建了表位插入的重組桿狀病毒，經IFA、SDS-PAGE、Western Blot、ELISA以及血凝試驗鑒定顯示，HBGAs表位插入的重組蛋白VP60-CR在Sf9細胞中得到了高效表達，電鏡觀察顯示可形成VLPs結構，重組蛋白VP60-CR在兔體內可產生高水平的抗HBGAs抗體，且能完全抵抗RHDV強毒的攻擊。

兔出血癥病毒VP60蛋白可自行組裝成VLPs，能準確模仿病毒粒子的幾何形狀，是優秀和安全的免疫原。VP60 NTA區和S結構域組成VLPs的內部區域，而P結構域形成VLPs外部刺突結構，該刺突結構與免疫保護性直接相關，但抗原性較弱。前期研究顯示，VP60氨基酸的部分改變不影響VLPs的形成［5，11-12］，據此，本研究構建了VP60 N端起始位點HBGAs表位插入的重組桿狀病毒，以該重組桿狀病毒感染 Sf9 細胞后表達的HBGAs表位插入的VP60 蛋白可自組裝成VLPs，表明該表位的插入不影響病毒樣顆粒的形成。經間接ELISA檢測顯示，與VP60蛋白相比，VP60-CR重組蛋白可在兔體內引發更高水平的抗HBGAs中和表位抗體，表明HBGAs受體結合表位的插入提高了抗原免疫的高效性和精準性，同時也說明VP60蛋白的N端是高效的表位插入位置。此外，重組蛋白免疫的新西蘭兔能夠100%抵抗RHDV強毒的攻擊，表明HBGAs表位插入的VP60蛋白仍然具有良好的免疫保護性。

本研究構建了N端攜帶HBGAs受體結合位點的兔出血癥病毒嵌合VP60蛋白，在形成VLPs結構的基礎上，可引發更高水平的針對HBGAs表位的抗體水平，為研究高免疫原性兔出血癥基因工程疫苗抗原奠定了基礎。

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收稿日期：2023-08-17

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金［編號：CX（23）1028］；現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-43-C-1）。

作者簡介：董文宇（2000—），男，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事畜禽疫病防控研究。E-mail：m18722279527@163.com。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疾病的病原學、快速診斷、流行病學、致病機理、疫苗研制、綜合防控技術等方面的研究，E-mail：rwangfang@126.com；熊富強，博士，副教授，主要從事大學生思想政治教育研究，E-mail：xiongfuqiang@njau.edu.cn。