葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉小鼠腸道機械屏障的影響

〔摘要〕 目的 探討葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉模型小鼠腸道機械屏障的作用機制。方法 選取15只SPF級雄性昆明小鼠，隨機分為正常組5只和模型組10只。采取“高糖高脂+高溫高濕+白酒稀釋液+冰水法”復制腸道濕熱證泄瀉小鼠模型，造模成功的10只小鼠隨機分為自愈組和治療組，每組5只。治療組灌胃5.07 g/（kg·d）葛根芩連湯水煎液，正常組和自愈組給予等容積無菌水，連續灌胃4 d后無菌提取各組小鼠十二指腸、空腸和回腸腸段。觀察各組小鼠一般狀態;HE染色觀察各組腸段形態;采用Image J圖像處理軟件測量各組絨毛長度（villus height， VH）、隱窩深度（crypt depth， CD），計算VH與CD的比值（絨隱比，V/C）、杯狀細胞數目和緊密連接蛋白平均光密度值（average optical density value， AOD）;采用二步法免疫組織化學法分析各腸段密封蛋白1（Claudin 1）、閉合蛋白（Occludin）和緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1， ZO-1）的表達。結果 正常組小鼠毛發有光澤，精神狀態佳，飲水量、肛溫和二便均正常;治療組小鼠毛發潔白、精神狀態良好、大便顆粒飽滿、肛溫恢復正常、泄瀉癥狀消失;自愈組小鼠毛發暗淡、肛溫高、大便含水量較多、擠壓不成型。與正常組相比，自愈組十二指腸、空腸和回腸腸黏膜結構部分受損，小腸腺出現萎縮，出現炎性癥狀。與自愈組相比，治療組腸黏膜結構較清晰，腸上皮細胞和固有層細胞排列緊密，炎癥情況明顯改善。與正常組相比，自愈組十二指腸CD升高（Plt;0.01），十二指腸V/C和杯狀細胞數降低（Plt;0.05，Plt;0.01）;治療組十二指腸V/C降低（Plt;0.05）。與正常組相比，自愈組空腸、回腸VH和V/C均明顯降低（Plt;0.05，Plt;0.01）。與自愈組相比，治療組十二指腸CD顯著降低（Plt;0.01），十二指腸、回腸V/C升高（Plt;0.05，Plt;0.01）。十二指腸腸段，與正常組相比，自愈組和治療組Claudin 1、Occludin、ZO-1 AOD值降低（Plt;0.05，Plt;0.01）;與自愈組相比，治療組Claudin 1、Occludin、ZO-1 AOD值顯著升高（Plt;0.01）。與正常組比較，自愈組空腸、回腸腸段Occludin AOD值明顯降低（Plt;0.01）。與自愈組比較，治療組空腸腸段Claudin 1 AOD值升高（Plt;0.05），回腸腸段Occludin AOD值明顯升高（Plt;0.01）。結論 葛根芩連湯可改善腸道濕熱證泄瀉小鼠腸道炎癥水平、促進緊密連接蛋白Claudin1、Occludin和ZO-1的表達，其機制可能與修復腸道機械屏障功能有關。

〔關鍵詞〕 泄瀉;腸道濕熱證;葛根芩連湯;機械屏障;腸道形態;緊密連接蛋白

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.08.001

Effects of Gegen Qinlian Decoction on the intestinal mechanical barrier in diarrhea mice with intestinal dampness-heat pattern

WU Chongmei1， PAN Kun2， XIE Guozhen1， ZHENG Tao1， HUI Huaying1*

1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Gegen Qinlian Decoction on the intestinal mechanical barrier in diarrhea mice with intestinal dampness-heat pattern. Methods Fifteen SPF male Kunming mice were randomized into normal group （n=5） and model group （n=10）. The diarrhea model with intestinal dampness-heat pattern was replicated by the method of \"high sugar and high fat + high temperature and high humidity + liquor dilution + ice water\"， and 10 successfully modeled mice were randomized into self-healing group and treatment group， with five mice in each group. The treatment group was administered with 5.07 g/（kg·d） Gegen Qinlian Decoction， and the normal group and self-healing group were given equal volumes of sterile water. The duodenum， jejunum， and ileum segments of mice in each group were aseptically extracted after 4 d of gavage. The general condition of the mice was observed; HE staining was used to observe the morphology of each intestinal segment. Image J processing software was used to measure the villus height （VH） and crypt depth （CD） in each group， and the ratio of VH to CD （V/C）， the number of goblet cells， and the average optical density （AOD） value of tight junction protein were calculated. Two-step immunohistochemistry was used to analyze the expressions of Claudin 1， Occludin， and zonula occluden-1 （ZO-1）. Results The normal group of mice had shiny hair， good mental state， normal water intake and rectal temperature， and normal stool and urine. The treatment group of mice had white hair， good mental state， full stool particles， normally recovered rectal temperature， and disappearance of diarrhea symptoms. The self-healing group of mice had dull hair， high rectal temperature， stool with high water content， and the stool did not hold shapes when squeezed. Compared with the normal group， the mucosal structure of the duodenum， jejunum， and ileum in the self-healing group was partially damaged， with atrophy of the intestinal glands and inflammatory symptoms. Compared with the self-healing group， the mucosal structure in the treatment group was clearer， with tightly arranged intestinal epithelial cells and lamina propria cells， and the inflammatory condition was significantly improved. In comparison to the normal group， the CD of the duodenum in the self-healing group was higher （Plt;0.01）， and the V/C and the number of goblet cells were lower （Plt;0.05， Plt;0.01） in the duodenum; the V/C in the treatment group was lower （Plt;0.05）. Compared with the normal group， the VH and V/C of the jejunum and ileum in the self-healing group were significantly reduced （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the self-healing group， the CD of the duodenum in the treatment group was significantly lower （Plt;0.01）， while the V/C of the duodenum and ileum were significantly higher （Plt;0.05， Plt;0.01）. In the duodenal segment， compared with the normal group， the AOD values of Claudin 1， Occludin， and ZO-1 proteins were lower in both the self-healing and treatment groups （Plt;0.05， Plt;0.01）; compared with the self-healing group， the AOD value of Claudin 1， Occludin， and ZO-1 proteins in the treatment group were significantly higher （Plt;0.01）. Compared with the normal group， the AOD value of Occludin protein in the jejunum and ileum was significantly lower in the self-healing group （Plt;0.01）. Compared with the self-healing group， the AOD value of Claudin 1 protein in the jejunum was higher in the treatment group （Plt;0.05）， and the AOD value of Occludin protein in the ileum was significantly elevated （Plt;0.01）. Conclusion Gegen Qinlian Decoction can improve the level of intestinal inflammation in diarrhea mice with intestinal dampness-heat pattern and promote the expression of tight junction proteins Claudin 1， Occludin， and ZO-1. Its mechanism may be related to its repairing function on intestinal mechanical barrier.

〔Keywords〕 diarrhea; intestinal dampness-heat pattern; Gegen Qinlian Decoction; mechanical barrier; intestinal morphology; tight junction protein

腸道濕熱證泄瀉是泄瀉中常見的中醫證型，其主要由外感濕熱或內傷飲食致脾失健運，濕熱蘊結于腸內所引起[1-2]。臨床中引起腹瀉的誘因較多，包括病毒及細菌感染、腸道菌群、飲食等，對于腹瀉的治療通常使用抗生素、微生態制劑、益生菌或補充電解質等方法[3]，但癥狀反復出現，且抗生素的使用對身體有潛在的損害。研究發現，腸道濕熱證泄瀉的發病機制與腸道屏障密切相關，腸道濕熱證泄瀉可引起腸道屏障受損，腸道通透性增加[4]。小腸是消化吸收食物的重要場所，也是機體重要的免疫器官，腸道功能的完整性對機體健康極為重要。腸道屏障包括機械屏障、生物屏障、化學屏障和免疫屏障[5]，其中機械屏障是腸道第一防線[6]，具有選擇透過性，既可轉運身體所需物質，又能有效阻止細菌、毒素和炎癥介質等進入腸內[7]。機械屏障主要由上皮細胞和細胞間緊密連接構成，細胞間緊密連接包括密封蛋白1（Claudin 1）、閉合蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1， ZO-1）和連接黏附蛋白分子，是機械屏障發揮作用的關鍵結構[8]。輪狀病毒引發的濕熱證泄瀉可導致Occludin、Claudin1和ZO-1的蛋白表達降低、緊密連接功能喪失和腸黏膜通透性紊亂[9]。研究表明，腸道濕熱證泄瀉可致使新生仔豬的十二指腸、空腸和回腸的形態結構受損，增加炎癥反應，給予加味葛根芩連湯治療后濕熱證泄瀉得到改善[10]。本課題組前期研究證實，腸道濕熱證泄瀉模型小鼠存在腸道炎癥反應[11]。

葛根芩連湯出自東漢著名醫學家張仲景撰著的《傷寒雜病論·太陽篇》，由葛根、黃芩、黃連和炙甘草組成，為解表清里方劑，主治協熱下利證[12]。方中葛根辛甘而涼，歸脾、胃經，既能解表退熱，又能升脾胃清陽之氣而治下利，故為君藥;黃連、黃芩清熱燥濕、厚腸止利，故為臣藥;炙甘草甘緩和中，調和諸藥，為佐使藥，全方共奏解肌透表、清熱解毒、利濕止瀉之功。葛根芩連湯在臨床上常用于治療急性腸炎、細菌性痢疾、胃腸型感冒等表證未解、里熱甚者[13]。研究表明，葛根素可促進Occludin的表達，重建腸道機械屏障，并抑制炎癥細胞因子的表達，減輕腸易激綜合征泄瀉大鼠的泄瀉和結腸炎癥反應[14]。加味葛根芩連湯可上調緊密連接蛋白ZO-1、Claudin 1和Occludin的表達，改善小鼠葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎[15]。既往研究表明，葛根芩連湯可在一定程度上改善腸道濕熱證泄瀉，但具體機制有待深入研究，故本研究旨在探討葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉模型小鼠腸道形態和細胞間緊密連接的影響，進一步明確葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉的作用機制，為臨床葛根芩連湯的臨床使用提供科學依據。

1 材料

1.1" 動物來源

選取4周齡SPF級雄性昆明小鼠15只，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002]，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心[實驗單位使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009]，環境室溫為23～25 ℃，相對濕度為50%～70%。實驗方案經湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（倫理批準號：SLBH202207050001）。

1.2" 主要試劑與儀器

葛根、黃芩、黃連、炙甘草（生產批號分別為NG21050606、HH21050603、HH21042702、210402）購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。56度紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司，規格：50 mL）;4%多聚甲醛組織固定液（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：BL?539A）;PBS磷酸緩沖液（上海博湖生物科技有限公司，批號：20201119）;Claudin 1抗體、Occludin抗體、ZO-1抗體、PV9000通用二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：AF0127、DF7504、AF5145、R1510-33）。

PRX-280C型人工氣候箱（江蘇天翎儀器有限公司）;BCD220WP3CX型超低溫冰箱（合肥美菱股份有限公司）;徠卡RM2235型輪轉石蠟切片機[徠卡顯微系統（上海）有限公司];金迪YD-A生物組織攤片機（浙江省金華科迪儀器有限公司）;Motic BA410研究型顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）。

1.3" 葛根芩連湯水煎液的制備

葛根芩連湯制備過程[11]：先將葛根加水浸泡30 min，再將黃芩、黃連和炙甘草浸泡30 min，葛根武火煮沸后轉文火繼續煎煮20 min，加入剩余藥味，沸騰后繼續煎煮30 min，三層紗布過濾;往濾渣中繼續加水200 mL，大火煮沸后轉小火煎煮30 min過濾，合并兩次所得濾液，小火濃縮得到含生藥量為0.25 g/mL的水煎液，4 ℃冰箱保存備用。

2 方法

2.1" 動物分組、造模及給藥

小鼠適應性飼養3 d后隨機分為正常組5只和模型組10只。模型組采用“高糖高脂+高溫高濕+白酒+冰水法”復制腸道濕熱證泄瀉小鼠模型。15 d后出現飲水量增加、肛溫升高、毛發變暗、精神狀態差、小便短黃、糞便黃褐臭穢，則提示造模成功[11]。造模成功后，模型組小鼠分為治療組和自愈組，每組5只。根據課題組前期研究結果，治療組小鼠每天給藥劑量為5.07 g/kg[11]，灌胃葛根芩連湯水煎液體積為20 mL/（kg·d），2次/d，連續治療4 d。正常組和自愈組給予等量無菌蒸餾水。

2.2" 小鼠一般狀態觀察

根據《泄瀉中醫診療專家共識意見（2017）》[16]中腸道濕熱證泄瀉癥狀，每天觀察小鼠的大便性狀、飲水量、體質量、肛溫、小便、毛發、精神狀態、活動程度等情況。

2.3" HE染色法檢測小鼠腸道形態

無菌條件下采集各組小鼠十二指腸、空腸和回腸的腸段，每個腸段約3 cm，放入4%多聚甲醛中固定。十二指腸、空腸和回腸組織用乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋，切成4 μm厚薄片，采用HE染色在光學顯微鏡下觀察各腸段的病理變化。并用ImageJ Pro Plus 6.0圖像處理軟件測量各組絨毛長度（villus height， VH）、隱窩深度（crypt depth， CD），計算VH與CD的比值（絨隱比，V/C）和杯狀細胞數，每個樣本隨機測量5組讀數取平均值。VH為小腸固有層和上皮共同凸向腸腔形成的長度，CD為小腸上皮在絨毛根部下陷至固有層而形成的管狀腺的距離。

2.4" 二步法免疫組織化學法檢測Claudin1、Occludin和ZO-1蛋白表達情況

首先將各組織石蠟切片進行脫蠟和水化，然后用3%過氧化氫去離子水孵育10 min，PBS沖洗3次，每次2 min。接著分別滴加一抗Claudin 1（1∶200）、Occludin（1∶200）和ZO-1（1∶200），4 ℃過夜，PBS沖洗。隨后，滴加Polymer Helper室溫孵育20 min，PBS洗滌。再滴加二抗HRP標記山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育20 min，用PBS沖洗。DAB溶液顯色，最后用自來水充分沖洗、蘇木素復染、脫水、透明、封片。使用顯微鏡觀察并拍攝IHC染色的結果，運用Image J軟件計算緊密連接蛋白Claudin 1、Occludin和ZO-1的平均光密度（average optical density， AOD）值，在200倍視野下每組選取5個樣本測定AOD值。AOD值包含表達面積和表達濃度信息，在選定的面積一定時，AOD值越大，表示緊密連接蛋白Claudin1、Occludin和ZO-1的表達越強，表示其相對表達量越高。

2.5" 統計學分析

各組所得數據采用“x±s”表示，利用SPSS 26.0進行組間差異分析。服從正態分布的數據組間比較采用單因素方差分析，非正態分布采用Kruskal-Wallis H檢驗。以Plt;0.05表示差異有統計學意義。

3" 結果

3.1" 小鼠一般狀態觀察

治療前，正常組小鼠精神狀態良好，活潑靈敏，飲水量、肛溫和二便均正常，模型組小鼠出現毛發暗淡無光澤，活動減少，爪甲抓握力差，大便稀黃，肛門污穢，飲水量增加。治療4 d后，治療組小鼠毛發潔白有光澤，活躍好動，精神狀態佳，大便顆粒飽滿，肛溫恢復正常，泄瀉癥狀消失;自愈組小鼠大便含水量較多，擠壓不成型。

3.2" 各組小鼠腸道形態的情況比較

3.2.1" 各組小鼠十二指腸形態的情況比較" 正常組微絨毛邊緣整齊，黏膜結構完整，腸上皮細胞緊密有序排列。自愈組腸黏膜結構部分受損，淺層黏膜部分壞死，腸上皮細胞數目減少，小腸腺伴有一定程度萎縮，絨毛頂端脫落，肌層可見部分炎癥細胞浸潤，中央乳糜管擴張。與自愈組相比，治療組小鼠腸黏膜結構較清晰，腸上皮細胞和固有層細胞排列緊密，絨毛頂端部分壞死脫落，肌層炎癥消退。詳見圖1。

與正常組相比，自愈組CD升高（Plt;0.01），V/C和杯狀細胞數降低（Plt;0.05，Plt;0.01）;治療組V/C降低（Plt;0.05）。與自愈組相比，治療組CD顯著降低（Plt;0.01），V/C顯著升高（Plt;0.01）;各組間的VH無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見表1。

3.2.2" 各組小鼠空腸形態的情況比較" 正常組空腸黏膜結構完好，絨毛長而完整，固有層細胞和上皮細胞排列緊密，形態結構規則。與正常組比較，自愈組腸黏膜出現斷裂，絨毛部分受損，微絨毛邊緣參差不齊，腸上皮細胞減少較為嚴重，且固有層分離水腫及出現炎性癥狀;與自愈組對比，治療組腸黏膜結構清晰，固有層結構完整，腸絨毛部分松脫，空腸炎癥得到改善。詳見圖2。

與正常組相比，自愈組VH和V/C均明顯降低（Plt;0.01）。與自愈組相比，治療組VH、CD、V/C和杯狀細胞數差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見表2。

3.2.3" 各組小鼠回腸形態的情況比較" 正常組小鼠回腸黏膜結構清晰，上皮細胞排列緊密，形態規則，杯狀細胞較多，微絨毛排列緊密整齊;自愈組小鼠黏膜顯著變薄、壞死，部分脫落，部分黏膜皺襞消失，小腸腺萎縮，肌層淋巴細胞增多，脫落的絨毛中炎性細胞聚集;與自愈組比較，治療組可見一定程度的改善，上皮細胞排列緊密，腸黏膜和小腸腺恢復完整，微絨毛排列整齊，炎癥得到一定程度減輕。詳見圖3。

與正常組相比，自愈組、治療組VH、V/C均降低（Plt;0.05，Plt;0.01），治療組CD降低（Plt;0.05）。與自愈組相比，治療組V/C升高（Plt;0.05）。各組間杯狀細胞數差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見表3。

3.3" 各組小鼠各腸段緊密連接蛋白的表達水平比較

3.3.1" 各組小鼠各腸段Claudin 1的表達水平比較

十二指腸腸段，與正常組相比，自愈組和治療組AOD值降低（Plt;0.05，Plt;0.01）;與自愈組相比，治療組AOD值顯著升高（Plt;0.01）。空腸腸段，與自愈組相比，治療組AOD值升高（Plt;0.05）。回腸腸段，各組之間差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見圖4、表4。

3.3.2" 各組小鼠各腸段Occludin蛋白的表達水平比較" 十二指腸腸段，與正常組比較，自愈組和治療組AOD值顯著降低（Plt;0.01）;與自愈組比較，治療組AOD值顯著升高（Plt;0.01）。與正常組比較，自愈組空腸、回腸腸段AOD值明顯降低（Plt;0.01）;與自愈組比較，治療組回腸腸段AOD值明顯升高（Plt;0.01）。詳見圖5、表5。

3.3.3" 各組小鼠各腸段ZO-1蛋白的表達水平比較

十二指腸腸段，與正常組比較，自愈組和治療組AOD值顯著降低（Plt;0.01）;與自愈組比較，治療組AOD值顯著升高（Plt;0.01）。詳見圖6、表6。

4 討論

隨著生活方式改變，腸道濕熱證泄瀉的發病率呈增長趨勢[17]。中醫學認為腸道濕熱證泄瀉的發病機制為濕熱傷及中焦，津為熱迫而下注[18]，其臨床表現為腹痛腹瀉、瀉下急迫、便稀臭穢，其發展和惡化的主要原因之一為腸道屏障受損[19]。葛根芩連湯為解表清里的經典方劑，臨床主要用于治療濕熱泄瀉等胃腸道疾病[20]。

腸道機械屏障是腸道屏障的一個重要組成部分，而腸道形態是評估腸道屏障完整性的重要指標，指標包括VH、CD、V/C和杯狀細胞數[21]。腸絨毛作為腸黏膜的重要組成部分，不但吸收營養物質、幫助物質運輸，還能通過蠕動排出定植腸道內的有害物質。VH增加，有利于增強腸道物質吸收功能。CD反映小腸上皮細胞的成熟程度，CD越淺表明腸上皮細胞成熟率越高，分泌功能增強[22]。V/C值可用于評價腸絨毛的萎縮程度及腸道功能狀態，V/C值增加意味著腸黏膜吸收功能增強[23]。在HE染色中，杯狀細胞為空泡狀，其主要功能是分泌黏蛋白，維持腸道屏障穩態及發揮潤滑作用[24]。杯狀細胞能分泌黏蛋白形成腸道黏液層，保護腸上皮，在腸黏膜損傷后的重建過程中起重要作用[25]。本研究中發現，采用葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉小鼠進行干預后，由腸道HE染色圖片可以看出，治療組小鼠腸道微絨毛恢復到排列整齊狀態，炎性浸潤程度降低，且治療后的小鼠腸道十二指腸和回腸的V/C值較自愈組增加，十二指腸的CD變淺。本研究結果提示，葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉小鼠十二指腸、空腸和回腸的腸道形態具有一定改善作用，可促進腸道吸收、屏障和免疫功能的恢復。

機械屏障主要由腸上皮細胞和細胞間緊密連接組成，為腸道抵抗外界環境的首要防線，能有效阻止病原體的侵襲和有害物質的進入[26]。細胞間緊密連接蛋白是腸黏膜上皮細胞的關鍵結構，在調控腸道黏膜通透性和維持細胞內環境穩定中起到重要作用[27]。Claudin 1和Occludin屬于跨膜蛋白，ZO-1為細胞質蛋白，可與一些跨膜蛋白結合發揮選擇性屏障保護作用[28]。ZO-1蛋白表達減少，將導致其他緊密連接蛋白的表達下調，使得緊密連接結構完整性遭到破壞，引起腸黏膜屏障功能下降[29]。Occludin的缺乏，會導致腸黏膜屏障功能障礙，腸道通透性增加，引起腹瀉[14]。本研究分析了正常組、自愈組和治療組小鼠腸道中Claudin 1、Occludin和ZO-1的蛋白表達情況，其中二步法免疫組織化學結果顯示腸道濕熱型泄瀉致使自愈組小鼠十二指腸組織中Claudin 1、Occludin、ZO-1及空腸和回腸段Occludin的表達減少，腸道機械屏障遭受破壞。采用葛根芩連湯治療后，小鼠十二指腸中Claudin 1、Occludin、ZO-1的AOD值，空腸中Claudin 1的AOD值以及回腸中Occludin的AOD值均增加，提示蛋白表達上調，說明葛根芩連湯可能通過調控腸道緊密連接蛋白促進受損傷的腸道機械屏障修復。

綜上所述，葛根芩連湯可改善腸道濕熱證泄瀉小鼠的腸道炎癥狀態，調控緊密連接蛋白Claudin 1、Occludin和ZO-1的表達水平。本研究從腸道形態和緊密連接蛋白的角度探討了葛根芩連湯對腸道濕熱證泄瀉的作用機制，明確了葛根芩連湯對腸道機械屏障的作用。腸道濕熱證泄瀉的治療具有多靶點、多方面等特點，后續將從化學屏障、免疫屏障等方面進一步擴展研究范圍，提供更加充實的實驗依據闡釋葛根芩連湯的療效機制。

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〔收稿日期〕2024-05-15

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（81703985）;湖南省衛生健康委員會科研計劃項目（D202303038538）。

〔通信作者〕*惠華英，女，博士，副教授，碩士研究生導師，E-mail：huihuaying2003@126.com。