一種新型負載淫羊藿苷的普魯蘭納米粒制備及其性能研究

〔摘要〕 目的 設計一種新型淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物，通過化學連接和物理包埋的方式高效裝載淫羊藿苷，制備一種具有緩釋性的納米球形載體，并對其性能進行初步探討。方法 淫羊藿苷通過丁二酸酐作為連接臂接枝親水性普魯蘭形成淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物，通過傅里葉紅外光譜對終產物鑒定。采用透析法制備負載淫羊藿苷的普魯蘭納米粒。測量空白納米粒和載藥納米粒的粒徑和Zeta電位，利用透射電鏡觀察其形貌，并測定其在不同pH條件下的體外藥物釋放行為。結果 納米粒具有規則的形態、均勻的尺寸。空白納米粒電位為+2.23 mV，載藥納米粒電位為+3.98 mV;空白納米粒平均粒徑為122 nm，載藥納米粒粒徑為190 nm。納米粒能明顯延長淫羊藿苷的緩釋作用時間，在pH 6.8的酸性條件下更有利于淫羊藿苷的釋放。結論 通過兩親性聚合物自組裝行為，成功制備了尺寸均勻的納米粒。通過聚合物化學連接方式丁二酸將中藥單體淫羊藿苷連接普魯蘭制備為納米遞送系統，淫羊藿苷的普魯蘭納米遞送系統該系統能使疏水性藥物成為納米型的水溶性藥物，藥物具有緩釋性，并在弱酸度環境下可以定向釋放。

〔關鍵詞〕 淫羊藿苷;普魯蘭多糖;納米遞送系統;藥物釋放;化學連接;缺血性心肌病

〔中圖分類號〕R283.6" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.08.005

Preparation and performance study of a novel icariin-loaded

pullulan nanoparticle

HE Yanjuan1， CHEN Lifeng2， LEI Yucheng2， HE Yukang2， CAO Zhi2， ZOU Deng1， DENG Fawen1，

ZHONG Zini2， YUAN Liming2*， LI Xiang2

1. Department of Pediatrics， The Fourth Hospital of Changsha， Changsha， Hunan 410006， China;

2. School of Medicine， Hunan Normal University， Changsha， Hunan 410000， China

〔Abstract〕 Objective To design and preliminarily explore a novel icariin-modified pullulan polymer for efficient loading of icariin via chemical linkage and physical encapsulation， so as to prepare a nanospherical carrier with sustained release properties and investigate its performance. Methods Icariin was grafted onto hydrophilic pullulan via succinic anhydride as a linker arm to form icariin-modified pullulan polymers， and the end products were identified by Fourier infrared spectroscopy. The dialysis method was used to prepare icariin-loaded pullulan nanoparticles. The particle size and zeta potential of the blank and drug-loaded nanoparticles were measured， and their morphology was observed using transmission electron microscopy， and their in vitro drug release behavior was determined under different pH conditions. Results The nanoparticles had regular morphology， uniform size， and homogeneous dimensions. The potential of blank nanoparticles was +2.23 mV， and that of drug-loaded nanoparticles was +3.98 mV; the average particle size of blank nanoparticles was 122 nm， and that of drug-loaded nanoparticles was 190 nm. The nanoparticles could significantly prolong the sustained release time of epimedium glycosides， and it was more favorable for icariin release in the acidic condition of pH 6.8. Conclusion Nanoparticles with uniform size were successfully prepared by amphiphilic polymer self-assembly behavior. The Chinese medicine monomer icariin connected with pullulan was prepared as a nano-delivery system through the polymer chemical linkage mode of succinic acid， and the pullulan nano-delivery system loaded with icariin could make the hydrophobic drug into a nano type of water-soluble drug， and the drug had a slow-release and could be directed to be released under the environment of weak acidity.

〔Keywords〕 icariin， pullulan polysaccharide， nanodelivery system， drug release， chemical connection， ischemic heart disease

缺血性心臟病是一種需要長期治療的慢性疾病，因此，藥物治療是一種關鍵的治療方法[1]。缺血性心臟病是全球主要死因，根據世界衛生組織的估計，2016年有gt;900萬人死亡[2]。淫羊藿苷是從中藥植物淫羊藿中提取的單體（圖1），研究發現，淫羊藿苷對缺血性心臟病有顯著作用[3]，可增加心血管血流量，促進造血功能，擴張血管以降低血壓[4-5]。在臨床實踐中常用于治療動脈粥樣硬化、腦缺血等疾病[6-7]。研究表明，淫羊藿苷通過改善炎癥反應和氧化應激、調節細胞增殖和凋亡、抑制血管內皮細胞損傷和細胞衰老以及動員干細胞分化和遷移等方式，對心血管疾病具有廣泛的保護作用[8]。由于淫羊藿苷的首過效應和水溶性差，導致其生物利用度低，在臨床應用中受到限制[9]。因此，將淫羊藿苷納米化制備成水溶性的淫羊藿苷納米藥物，能夠提高其在體內的遞送效率，是提高其生物利用度的理想選擇[10]。

普魯蘭由重復的麥芽三糖單元組成。麥芽三糖的每個吡喃糖環通過α-（1，4）糖苷鍵連接，一個麥芽三糖單元通過α-（1，6）糖苷鍵連接到另一個麥芽三糖單元[11]。每個麥芽三糖單元有9個OH基團，可以用具有不同官能團的基團代替[12]。普魯蘭具有生物可降解性、無毒、易修飾等特性，作為藥物載體有廣泛的研究[13]。丁二酸酐是常用的連接臂，將疏水性的淫羊藿苷通過丁二酸酐連接臂和親水性的普魯蘭接枝形成兩親性的聚合物（圖2）。兩親性聚合物可以在自組織過程中形成納米粒，納米粒在疏水性藥物負載及定位遞送方面具有獨特的優勢[14]。與腫瘤組織相似，心肌缺血區具有類似的通透性和滯留功能增強的通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR），由于納米級的小尺寸效應，納米粒可以通過被動靶向將藥物遞送到心肌缺血組織[15-16]。因此，將淫羊藿苷包載到普魯蘭納米遞送系統中可以通過靶向作用提高生物利用度，更好地發揮其治療心肌缺血病的作用。

兩親性聚合物納米粒子屬于納米膠體體系，是一種新型的藥物載體，具有較高的載藥能力和獨特的體內靶向作用[17]。聚合物納米粒由于其兩親性可以自組裝形成核殼結構;核部分可以用作疏水藥物的容器，外殼可以保護藥物，提高藥物的穩定性，并形成水溶性的懸浮顆粒，并達到緩釋效果[18-19]。提高基于蛋白質和基因的生物治療藥物的穩定性，并降低化療藥物的全身毒性[20]。心肌缺血病灶組織缺血缺氧，是弱酸性環境，淫羊藿苷納米遞送系統被動靶向病灶組織，可以加速在病灶組織心肌細胞外釋放，增強疏水性藥物淫羊藿苷進入細胞的效率。因此，本研究設計了淫羊藿苷的疏水改性普魯蘭多糖聚合物，自組裝負載淫羊藿苷，通過化學連接和物理包埋的方式提高其載藥能力，通過納米技術提高其組織靶向和心肌細胞聚集效力，提高淫羊藿苷的治療效力。

1 材料與方法

1.1" 試劑和儀器

丁二酸酐（純度99%，貨號：S24348，上海源葉生物科技有限公司）;4-二甲氨基吡啶（純度99%，貨號：D109207）、普魯蘭（純度99%，貨號：P121048）均購自阿拉丁控股集團;淫羊藿苷（純度95%，貨號：S24348，上海麥克林生化科技）;Malvem激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）;紫外可見分光光度計（北京萊伯特科儀器有限公司）;傅里葉紅外光譜儀NEXUS670（美國尼力高公司）。

1.2" 普魯蘭的羧化

稱取3.20 g普魯蘭、0.50 g琥珀丁二酸酐、0.60 g 4-二甲氨基吡啶于250 mL圓底燒瓶中，加入35 mL二氯甲烷，在50 ℃的圓底燒瓶中冷凝回流，反應2 h。將反應物置于旋轉蒸發儀中，溫度調至40 ℃，放置12 h，得到白色固體。將白色固體轉移至透析袋中，隨后用去離子水透析兩天，白天每2 h換去離子水1次。將濾液冷凍干燥得到羧基化的普魯蘭，稱重。

1.3" 淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物的合成

分別稱取3份0.4 g羧化普魯蘭、0.03 g N-羥基琥珀酰亞胺、0.03 g 4-二甲氨基吡啶，加至250 mL圓底燒瓶中，并向其加入10 mL二甲基亞砜，恒溫加熱（30 ℃），磁力攪拌器充分攪拌12 h;取100 mg淫羊藿苷標準品放置于15 mL試管中，加入5 mL二甲基亞砜充分溶解，將溶解混合物倒入圓底燒瓶中，室溫下攪拌反應48 h。透析，每2 h換1次水，直至無任何氣味。然后將透析得到的溶液倒入培養皿，冷凍干燥成粉末，得到產物。

1.4" 傅里葉紅外光譜

將淫羊藿苷、普魯蘭、羧化普魯蘭和淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物樣品在研磨碗中研磨成粉末，并與干燥的KBr粉末混合;將每一種都壓制成薄膜進行紅外掃描，掃描的范圍設定為400～4000 cm-1。

1.5" 淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒的制備

稱取20 mg淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物于小燒杯中，再稱取5 mg淫羊藿苷溶于適量二甲亞砜中，放入小燒杯中，將燒杯置于恒溫加熱磁力攪拌器上，混合攪拌5 min后，加入5 mL蒸餾水，在25 ℃下攪拌15 min后停止攪拌。然后將反應物盛于3 kDa透析袋中，于去離子水中透析24 h，每2 h換1次水，直至無二甲亞砜氣味，得到物理包埋淫羊藿苷的納米粒。20 mg淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物通過上述方法透析得到淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒。

1.6" 動態光散射

取納米粒樣品2 mL，用微孔濾膜過濾，用超聲波清洗機超聲分散，將其倒入燒杯中，打開動態光散射儀，將樣品放置于樣品池中，并將其放入散射儀中，用動態光散射儀測定納米粒子樣品的粒徑和電位。

1.7" 透射電鏡

將納米粒子溶解于去離子水中，濃度為1 mg/mL，取制成的納米粒子溶液1 mL滴在涂銅網上，放置于烘箱中干燥至無水珠，然后通過Tecnai F20透射電子顯微鏡觀察其形態特征。

1.8" 體外藥物釋放量

本實驗利用PBS模擬人體內生理環境，取納米粒子5 mg，溶于10 mL的PBS中，將其平均分為兩份，每份5 mL，裝入截留量為3 000 Da透析袋，再將透析袋分別放入50 mL pH=7.4的PBS緩沖液中，在預定時間間隔取樣（Tn，n=0、1、2、4、8、12、24、48、72 h），每次取樣3 mL溶液，同時加入同等3 mL的PBS緩沖液。然后用紫外分光光度計在最大吸收波長處測量溶液的吸光度，測得淫羊藿苷濃度，然后將其帶入下列公式中，計算藥物釋放百分率（Q%）：

Q%=

其中，Wnp—納米粒子的重量，Cn—Tn時的樣品濃度，V—釋放介質的總體積;Vn—樣品取樣量;Ci—Ti處的樣品濃度（i=0、1、2、4、5、12、24、48 h，V0和C0均等于零）。

1.9" 納米粒中淫羊藿苷的釋放

精確量取載藥納米粒溶液放入透析袋（4～8 kDa，截取分子量）中，并分別置于37 ℃的pH 7.4、pH 6.8的25 mL的PBS（釋放介質）中透析，在預定的時間間隔（Tn，n=0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h）取2 mL的釋放介質進行采樣，并補充等量的溶液，用紫外分光度法測定在270 nm波長處溶液吸光度值，淫羊藿苷釋放百分比（Q%）按前述公式計算。

2 實驗結果

2.1" 納米材料紅外分析

普魯蘭與淫羊藿苷結合制成納米粒：一方面，從淫羊藿苷標準樣品的紅外光譜來看，主要特征峰出現在3 440、2 960、2 840、1 650、1 600、1 350、1 260、1 180 cm-1。3 440 cm-1是淫羊藿苷中酚羥基的伸縮振動峰。由于分子中含有大量的羥基，出現了締合現象，產生了一個強而寬的吸收峰。2 960、2 840 cm-1是淫羊藿苷中甲基的伸縮振動峰。光譜1 650 cm-1是淫羊藿苷中的C=C伸縮振動峰值，1 600 cm-1是C=O拉伸振動峰，因C=C和C=O的共軛效應使其峰值有所降低;1 260 cm-1是酚C—O伸縮振動峰值。上述峰在淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物光譜中有所體現。另一方面，聚合物與羧化普魯蘭相比多了碳碳雙鍵與酚羥基。從淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物光譜來看，與普魯蘭羧化紅外光譜相比，在1 650 cm-1處存在過量的C=C伸縮振動峰，1 260 cm-1是酚C—O伸縮振動峰值。淫羊藿苷修飾的普魯蘭光譜中有特征官能團的波峰，碳碳雙鍵與酚羥基的波峰，淫羊藿苷修飾的普魯蘭合成是成功的。詳見圖3。

2.2" 納米粒的尺寸與形態

通過動態光散射儀測得，如圖4所示，淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒電位為2.23 mV（圖4A），物理負載淫羊藿苷納米粒電位為3.98 mV（圖4D）;淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒尺寸為122 nm（圖4B），物理負載淫羊藿苷納米粒電位為190 nm（圖4E）。因為載藥的緣故，物理包埋藥物后，納米粒尺寸增大。采用透射電鏡觀察納米粒形態。如圖4F所示，兩種納米粒納米形狀規則，呈現為均勻的球形，分散均勻。

2.3" 72 h藥物釋放率

由圖5可知，游離淫羊藿苷在12 h內釋放率達到了78.67%，淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒在72 h內釋放率為20.84%，物理負載淫羊藿苷納米粒在72 h內釋放率達到52.80%，由于物理負載淫羊藿苷納米粒內層負載淫羊藿苷藥物，可以使納米粒的釋藥量增加，與游離藥物相比，物理負載淫羊藿苷納米粒能明顯延長淫羊藿苷的緩釋作用時間，增強治療效果。淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒，由于化學連接，藥物釋放更加緩慢。

2.4" 不同pH下納米粒在72 h內藥物釋放率

如圖6所示，在pH 6.8的緩沖溶液中物理負載淫羊藿苷納米粒72 h內累積藥物釋放量達到了68.55%，淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒藥物釋放量30.56%，在pH 7.4的緩沖溶液中物理負載淫羊藿苷納米粒的藥物釋放量為52.80%，淫羊藿苷修飾的普魯蘭納米粒藥物釋放量20.84%。由此說明在pH 6.8的酸性條件下更有利于淫羊藿苷的釋放，化學連接方式負載的藥物釋放呈現長效緩釋性。

3 討論

負載淫羊藿苷的聚合物納米顆粒可以提高藥物的載藥量，通過化學連接和物理包埋顯著提高了藥物包埋效率。淫羊藿苷是疏水性藥物，體內遞送效力低，通過制備納米遞送系統可以顯著提高其遞送效率。本項目通過疏水性的淫羊藿苷對普魯蘭進行疏水化修飾，得到雙親性的負載淫羊藿苷的普魯蘭聚合物。淫羊藿苷在連接到親水性的普魯蘭上后，可以顯著提高淫羊藿苷的水溶性，提高其遞送效率，并且淫羊藿苷修飾普魯蘭聚合物的合成路線簡單易行，紅外驗證了其結構。使用透析法使其自組裝聚合物納米粒，納米粒是由親水性的普魯蘭多糖為骨架作為納米粒的外殼，疏水性藥物淫羊藿苷為內核的殼-核球形結構，透視電鏡下展示均勻的球形。淫羊藿苷修飾的普魯蘭聚合物自組裝形成納米粒出現疏水性空腔，空腔可以進一步裝載淫羊藿苷，可以提高藥物負載效率，通過載藥量的測定，顯示了較高的包封率和載藥量。物理包埋和化學連接兩種方式負載淫羊藿苷形成的納米粒，在藥物釋放過程中展現不同的釋放特征。納米粒在病灶的藥物釋放，對于心肌缺血病而言，病灶的弱酸性環境，對于遞送到病灶的納米粒中物理包埋的藥物可以促使其在細胞外釋放，藥物以游離的方式通過擴散進入細胞內發揮作用。化學連接的藥物在到達病灶，有少量藥物釋放，在病灶時間的延長，材料逐步降解后，持續發揮作用。納米粒負載的藥物具有緩釋性，在血漿循環過程中較少釋放，特別是化學連接的藥物組織的納米載體，在血漿運行過程中不釋放，從而高效的節約了用藥成本。在病灶酸性環境中，物理包埋的藥物快速釋放，化學連接的藥物緩慢釋放，實現定位釋放藥物，從而提高治療效率，節約藥物成本的目標。本項實驗內容驗證了淫羊藿苷納米遞送系統的高載藥量和獨特的釋放特點。因此，本研究設計的納米粒針對心肌缺血病的治療藥物淫羊藿苷，主要是提高其遞送效率，及維持其長效作用。該納米遞送系統是一種在心肌缺血性疾病新型的中藥單體運輸系統，一種新型的治療策略。

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〔收稿日期〕2023-10-24

〔基金項目〕長沙市自然科學基金項目（kq2202021）;湖南省大學生創新創業訓練計劃項目（S202212652014）;湖南師范大學樹達學院教學改革項目（院行發教務字〔2022〕35號6）。

〔通信作者〕*袁立明，男，碩士，副教授，E-mail：yuanlimingtian@163.com。