電針調節P2X7R介導的細胞焦亡途徑對骶上脊髓損傷后尿潴留型神經源性膀胱大鼠膀胱排尿功能的影響

〔摘要〕 目的 觀察電針對骶上脊髓損傷后尿潴留型神經源性膀胱大鼠排尿功能的影響，并探討電針調節嘌呤能離子通道型受體7（purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor， P2X7R）介導的細胞焦亡途徑在其中的潛在效應機制。方法 從48只雌性SD大鼠中隨機抽取12只納入假手術組，剩余大鼠以T8完全性脊髓橫斷法建立尿潴留型神經源性膀胱大鼠模型，將已成模的27只大鼠二次隨機分為模型組與電針組，每組12只，剩余3只模型大鼠用于實驗候補。電針組于術后第19天開始干預，連續10 d，其余兩組僅予以捆綁。干預結束后，各組大鼠先行尿流動力學檢測，隨后快速分離膀胱組織待檢，應用HE染色觀察膀胱組織形態學變化，透射電鏡觀察膀胱組織超微結構變化，TUNEL染色檢測膀胱組織中細胞損傷情況，ELISA檢測膀胱組織中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）水平，免疫組織化學法和Western blot法檢測膀胱組織中P2X7R、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1， Caspase-1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）蛋白表達情況。結果 與假手術組比較，模型組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量顯著升高（Plt;0.01），以膀胱體積增大伴尿潴留為主要表現;模型組大鼠膀胱組織存在明顯的炎性反應且病理改變顯著，膀胱組織超微結構可見明顯腫脹、變形等細胞損傷，膀胱組織細胞損傷率顯著增加（Plt;0.01），膀胱組織中ATP含量、P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的陽性表達及蛋白表達水平均顯著升高（Plt;0.01）。與模型組比較，電針組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量降低（Plt;0.05），尿潴留癥狀較輕，膀胱排尿功能改善;電針組大鼠膀胱組織的炎性反應及病理損傷減輕，膀胱組織超微結構變化明顯改善，膀胱組織細胞損傷率顯著減少（Plt;0.01），膀胱組織中ATP含量、P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的陽性表達及蛋白表達水平均顯著降低（Plt;0.01）。結論 電針可有效改善骶上脊髓損傷后尿潴留型神經源性膀胱大鼠的膀胱排尿功能，緩解尿潴留癥狀，減輕膀胱組織病理損傷程度及其炎癥反應，其機制與抑制膀胱組織中P2X7R/NLRP3信號通路焦亡蛋白的表達有關。

〔關鍵詞〕 骶上脊髓損傷;神經源性膀胱;尿潴留;電針;嘌呤能離子通道型受體7;細胞焦亡

〔中圖分類號〕R245.9" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.08.006

Effects of electroacupuncture on bladder voiding function in rats with neurogenic bladder featuring urinary retention after suprasacral spinal cord injury through regulation of P2X7R-mediated pyroptosis pathway

XIANG Jing1， ZHUO Yue1， AI Kun1， DENG Shifeng1， XU Ming1， LIU Qiong1，

XIONG Mingyue2*， ZHANG Hong1*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Department of Rehabilitation Medicine，

Yongzhou Central Hospital， Yongzhou， Hunan 425000， China

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture on bladder voiding function in rats with neurogenic bladder （NB） featuring urinary retention after suprasacral spinal cord injury （SCI）， and to explore the potential mechanisms of electroacupuncture in regulating the pyroptosis pathway mediated by purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7 （P2X7R）. Methods Twelve from 48 female SD rats were randomly selected as the sham-operated group. The remaining rats were used to establish a rat model of NB featuring urinary retention by T8 complete spinal cord transection. Of the 27 successfully modeled rats， 24 were randomized into model group and electroacupuncture group， with 12 rats in each group， and the remaining three model rats were reserved for experimental backups. The electroacupuncture group received intervention on the 19th day after operation for 10 consecutive days， while the other two groups were only restrained. After the intervention， urodynamic tests were first performed on the rats in each group， followed by rapid separation of bladder tissue for examination. HE staining was used to observe the morphological changes in bladder tissue; transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of bladder tissue; TUNEL staining was used to examine cell damage in bladder tissue; ELISA was used to check the level of adenosine triphosphate （ATP） in bladder tissue; immunohistochemistry and Western blot were used to examine the protein expression levels of P2X7R， NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 （NLRP3）， cysteinyl aspartate specific proteinase-1 （Caspase-1）， and interleukin-1β （IL-1β） in bladder tissue. Results Compared with the sham-operated group， the bladder leak point pressure， maximum bladder pressure， and maximum bladder capacity in the model group significantly increased （Plt;0.01）， with bladder volume increase accompanied by urinary retention as the main manifestations. The model group rats showed significant inflammatory reaction and pathological changes in bladder tissue， with obvious swelling， deformation， and other signs of cell damage in the ultrastructure of bladder tissue， and a significantly increased cell damage rate （Plt;0.01）. The ATP content， the positive expression and protein expression levels of P2X7R， NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in bladder tissue significantly increased （Plt;0.01）. Compared with the model group， the bladder leak point pressure， maximum bladder pressure， and maximum bladder capacity of the rats in the electroacupuncture group decreased （Plt;0.05）， with milder symptoms of urinary retention and improved bladder voiding function. The electroacupuncture group showed alleviated inflammatory reaction and pathological damage， significantly improved ultrastructural changes， significantly reduced cell damage rate （Plt;0.01）， and significantly reduced ATP content， positive expression and protein expression levels of P2X7R， NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in the bladder tissue （Plt;0.01）. Conclusion Electroacupuncture can effectively improve the bladder voiding function in rats with NB featuring urinary retention after suprasacral SCI， alleviate the symptoms of urinary retention， and reduce the degree of pathological damage and inflammatory response in bladder tissue. Its mechanism is related to the inhibition of the expression of pyroptosis protein in P2X7R/NLRP3 signaling pathway in bladder tissue.

〔Keywords〕 suprasacral spinal cord injury; neurogenic bladder; urinary retention; electroacupuncture; purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7; cell pyroptosis

神經源性膀胱（neurogenic bladder， NB）是由于神經系統病變引起膀胱和尿道功能障礙，繼而導致各種下尿路癥狀的疾病總稱[1]。流行病學資料顯示，全球約80%的NB患者是因脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）所致，其中又以骶上SCI最為常見[2-3]。T8椎體下SCI后，由于低位脊髓交感-副交感排尿中樞與高位皮質-腦橋排尿中樞之間協同支配出現異常，導致膀胱逼尿肌與膀胱括約肌反射亢進伴逼尿肌-括約肌協同失調，病理表現以儲尿期內膀胱高內壓、排尿期內逼尿肌收縮過程中括約肌舒張不能導致殘余尿量增多、排尿功能下降為主，即尿潴留型NB[4]。該類NB易于引發上尿路損害以及泌尿系感染，成為臨床上影響這類患者生存及生活質量的主要因素[5-6]。

目前研究表明，焦亡與膀胱排尿功能障礙的發生發展密切相關，T8 SCI所致的尿潴留型NB由于膀胱過度充盈、膀胱內壓增加，當膀胱細胞應激增加超過其代償反應的能力，就會激活細胞焦亡，引起膀胱平滑肌細胞變性、死亡，膀胱組織形態結構受到損害，最終影響膀胱排尿功能[7]。研究表明，焦亡在膀胱重塑中有著重要作用，是一種與炎癥密切相關、新的細胞程序性死亡方式[8]。組織細胞在受到高壓作用下引發損傷細胞釋放高含量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP），在病理條件下，ATP可作為一種損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns， DAMPSs）。嘌呤能離子通道型受體7（pur?inergic ligand-gated ion channel 7 receptor， P2X7R）是一種離子受體，P2X7R在平滑肌和尿路上皮表達豐富，膀胱在尿液充盈不斷被機械擴張時，尿路上皮釋放大量的ATP和P2X7R相結合產生寡聚化反應，使離子通道開放，激活NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3），進而將無活性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1， Caspase-1）轉化為裂解的Caspase-1，引發細胞焦亡，釋放炎癥因子白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）[9-10]。膀胱組織過度焦亡造成細胞損傷，同時加劇膀胱內的炎癥反應，炎癥亦是骶上SCI后NB排尿功能障礙的重要因素，可刺激鄰近膀胱平滑肌增生、肥大及細胞死亡，導致膀胱組織發生纖維化和去神經化，影響膀胱平滑肌收縮，進一步加重膀胱功能障礙，形成惡性循環[11]。

目前，針對SCI后NB患者尚缺乏完全滿意的治療及康復方法，如藥物治療、手術治療、導尿術等均存在一定的毒副作用或風險性。臨床上，電針治療膀胱功能障礙疾病因其療效可觀、綠色安全的優勢而被廣泛關注。本課題前期研究已發現，T8椎體下脊髓完全性橫斷后NB大鼠以尿潴留為主要表現，電針干預可減輕膀胱病理損害程度、改善膀胱平滑肌的舒縮協調能力，從而促進膀胱功能恢復[12]。故本研究以此為基礎，以電針調節P2X7R介導的細胞焦亡途徑為切入點，以期證實電針改善骶上SCI后尿潴留型NB大鼠膀胱排尿功能的治療效應，并為其效應機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1" 實驗動物及分組

由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供并分籠飼養的SPF級健康成年Sprague-Dawley雌性大鼠48只（由前期研究[4]成模率72.2%以上計算所得），體質量（220±20） g，湖南中醫藥大學倫理審批號：LL2021091504，許可證號：SYXK（湘）2019-0004?？刂苿游镲曫B的溫度24～26 ℃、濕度50%～70%。術前喂養1周，根據隨機數字表法將大鼠分為假手術組12只和造模組36只，造模成功的大鼠再隨機分為模型組與電針組，每組不低于12只，整個實驗過程嚴格遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2" 主要試劑與儀器

異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號：R510-22）;青霉素鈉（哈藥集團有限公司，批號：220106）;乳酸鈉林格注射液（安徽環球藥業股份有限公司，批號：20211218-2）;葡萄糖注射液（貴州天地藥業有限公司，批號：20080802）;β-actin抗體、 NLRP3抗體、Caspase-1抗體、IL-1β抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：AF7018、DF7438、AF4005、AF4006）;P2X7R抗體、山羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：28207-1-AP、SA00001-2）;ECL發光液（美國Advansta公司，批號：K-12045-D50）;大鼠ATP酶聯免疫吸附法檢測試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號：LCSJJZF30726）。

MP-150多通道生理記錄儀（美國BIOPAC公司，型號：MP150-WSW）;微量注射泵（浙江史密斯醫學儀器有限公司，型號：WZ-50C6）;包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）;病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）;烤箱（天津市萊玻瑞儀器設備有限公司，型號：GFL-230），正置光學顯微鏡（日本尼康，型號：Nikon Eclipse E100）;酶標分析儀（美國Thermo公司，型號：Rayto RT-6100）。

1.3" 模型制備、術后護理及模型評估

1.3.1" 模型制備" 采用Hassan Shaker脊髓橫斷法[13]并結合本團隊前期研究[4]制備T8椎體下脊髓完全性橫斷尿潴留型NB大鼠模型。本實驗脊髓完全性橫斷為T8椎體下，約對應脊髓T10節段[14]。異氟烷麻醉大鼠并備皮，沿大鼠脊柱棘突向下觸摸到明顯寬大凸出的棘突為T10棘突，以此為骨性標志向上定位2個棘突的椎體為T8。分離T8/T9椎體兩側皮膚及肌肉，直至其兩側棘突及椎弓完全暴露，咬斷T8棘突及椎弓根，完整暴露椎管內脊髓后用眼科剪快速地橫斷脊髓，確保無殘留的神經纖維后，止血清創與縫合。假手術組大鼠僅暴露T8椎體棘突及椎弓，后立即縫合。

1.3.2" 術后護理" 將手術完成的大鼠置于電熱毯上復溫，復溫后蘇醒的大鼠轉移至籠內喂養10 mL葡萄糖注射液，補充能量的同時減輕腸道及膀胱負擔。術后第1～3天，給予少量飼料及葡萄糖注射液喂養，第4天恢復常規喂養。術后第1～3天，預防術后大鼠感染，給予腹腔注射青霉素鈉（20萬U/只）;避免術后大鼠電解質紊亂，給予皮下注射乳酸鹽林格溶液（20 mL/kg）;每天將大鼠的下肢噴涂Grannick苦蘋果噴霧，預防其自殘。術后每天每隔8 h（早、中、晚）進行人工手法輔助排尿。

1.3.3" 模型評估" （1）成模時間評估：SCI平面越高其脊髓休克期就越長，休克期內的大鼠間模型有較大差異且各項體征情況不穩定。前期研究發現，術后1周左右模型大鼠度過脊髓休克期，術后第18天模型趨于穩定[4]。故剔除成模不標準大鼠，成模大鼠于術后第19天行電針干預。（2）后肢運動功能評估：脊髓休克期內的大鼠后肢運動功能處于完全喪失狀態，進行BBB評分（Basso， Beattie amp; Bresnahan locomotor rating scale， BBB scale）[15]為0分，大鼠呈現雙下肢拖動狀態，則造模成功;反之，說明造模不成功，應剔除。（3）膀胱排尿功能評估：脊髓休克期，大鼠膀胱顯著脹大并觸之緊張，出現自行排尿困難，需手法輔助排尿;脊髓休克期結束后，大鼠膀胱脹大程度雖有所減輕，但無法自行排尿，大鼠雙下肢、尿道口周圍或籠內墊料偶有潮濕現象，呈尿潴留為主的表現，則造模成功，納入為本實驗的研究對象。

1.3.4" 造模結果" 假手術組12只大鼠生命體征穩定;36只造模組大鼠因手術期死亡、術后感染、腹脹、自噬或不符合成模標準等原因予以剔除9只，剩余27只造模成功的大鼠二次隨機分為模型組、電針組各12只，剩余3只模型大鼠用于實驗候補，各組大鼠均存活至實驗結束。

1.4" 腧穴定位與電針方法

前期研究發現，術后1周左右模型大鼠度過脊髓休克期，術后第18天模型趨于穩定，故成模大鼠于術后第19天行電針干預。假手術組、模型組大鼠僅捆綁20 min。電針組選取次髎、中極和三陰交行電針干預，參考國家“十三五”規范統編教材《實驗針灸學》中大鼠標準穴圖譜定位。電針組大鼠仰臥位固定于鼠板上，使用無菌針灸針斜刺中極5 mm、直刺三陰交5 mm，中極和三陰交為一組電針穴位，并每天交替干預三陰交左右兩穴，設置電針儀參數為疏密波（10 Hz/50 Hz），以大鼠雙下肢輕度震顫并耐受為適宜電流強度;大鼠再行俯臥位固定，直刺兩側次髎10～15 mm，兩穴連接電針，參數同前。以上電針干預時間均各為20 min，1次/d，連續干預10 d。

1.5" 觀察指標

干預結束后，選取每組6只大鼠進行尿流動力學檢測，待檢完畢后迅速取膀胱組織凍存，用于本實驗酶聯免疫吸附法檢測及Western blot檢測。取材當天剩余每組6只大鼠，取新鮮膀胱組織用于HE染色、TUNEL染色、透射電鏡及免疫組織化學檢測。

1.5.1" 尿流動力學檢測" 手法排空大鼠膀胱內尿液并仰臥位固定麻醉大鼠，經三通管將MP-150的壓力換能器與微量注射泵、F3導尿管相連接。打開麻醉后大鼠的腹腔并暴露膀胱，膀胱穹窿處剪開小口后，插入F3導管并固定，靜置30 min后以6.0 mL/h的速度灌注生理鹽水。使用電腦記錄并計算膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量等各項指標。

1.5.2" HE染色觀察各組大鼠膀胱組織形態學變化

用4%多聚甲醛固定剪取的膀胱組織48 h，通過梯度濃度的乙醇脫水、浸蠟包埋后行HE染色，最后置于100倍光學顯微鏡下觀察。

1.5.3" 透射電鏡觀察各組大鼠膀胱組織超微結構變化" 取材時切下大小為1 mm3的新鮮膀胱組織，置于裝有預冷電鏡固定液的EP管中，4 ℃保存，PBS洗3次，各15 min。置于1%鋨酸避光室溫固定2 h，PBS洗3次，經乙醇梯度脫水、滲透包埋、聚合、80 nm的超薄切片，用2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色，最后置于透射電子顯微鏡下觀察。

1.5.4" TUNEL染色檢測各組大鼠膀胱組織中細胞損傷情況" 依次將膀胱石蠟切片脫蠟、蛋白酶K修復、破膜、室溫平衡。反應液取TUNEL試劑盒內適量TdT酶、dUTP、buffer按1∶5∶50比例混合，覆蓋組織并放于濕盒內，37 ℃孵育1 h，經DAPI復染細胞核后封片。每張切片置于熒光顯微鏡下200倍視野拍照觀察并采集圖像，細胞損傷率=（陽性細胞數÷活細胞數）×100%。

1.5.5" ELISA檢測各組大鼠膀胱組織中ATP含量" 膀胱組織稱重后，按混合比例1∶9加入提取液。置于離心機3 000 r/min半徑8 cm離心10 min后，取上清液，-80 ℃儲存，按照ELISA試劑盒操作說明檢測樣本ATP。

1.5.6" 免疫組織化學法檢測各組大鼠膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達水平" 先將膀胱石蠟切片放入脫蠟液脫蠟，抗原修復，加入3%過氧化氫溶液室溫孵育，加入3%BSA封閉。隨后滴加P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗片，滴加IgG抗體，37 ℃孵育50 min后PBS洗片。最后滴加DAB顯色液、復染、脫水封片，置于顯微鏡（×400）觀察結果。應用Image J軟件分析結果，陽性染色為棕黃色或褐色，分析 P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白平均吸光度值。

1.5.7" Western blot法檢測各組大鼠膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達水平" 先稱取-80 ℃保存的膀胱組織，加裂解液提取組織總蛋白并測定蛋白濃度;上樣行電泳，SDS-PAGE分離蛋白P2X7R（65 kDa）、NLRP3（110 kDa）、Caspase-1（20 kDa）、IL-1β（18 kDa）、β-Actin（42 kDa）轉至PVDF膜轉膜90 min，脫脂奶粉封閉90 min，分別加入P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、β-Actin的一抗，4 ℃下孵育過夜，漂洗后常溫下用二抗孵育90 min，最后洗膜、顯影。使用Image J軟件分析P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、β-Actin的灰度值，以目的蛋白與內參兩者灰度比值作為P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的相對表達量，其結果做均一化處理。

1.6" 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件行各項實驗數據的統計學分析。計量資料以“x±s”表示：若數據服從正態性和方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析;若不符合正態分布或方差不齊，則采用非參數檢驗。以Plt;0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1" 各組大鼠尿流動力學的比較

與假手術組比較，模型組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量均顯著升高（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量均降低（Plt;0.05）。詳見圖1。

2.2" 各組大鼠膀胱組織形態表現

假手術組大鼠膀胱組織無固有層充血、水腫，無炎性細胞浸潤，肌纖維排列清晰、緊密;與假手術組比較，模型組大鼠膀胱組織出現明顯的炎性反應，固有層充血、水腫，平滑肌肌層明顯增厚、肥大，肌纖維排列紊亂;與模型組比較，電針組膀胱組織炎性反應減少，固有層充血、水腫減少，平滑肌肌層增厚減少，肌纖維排列較整齊。詳見圖2。

2.3" 各組大鼠膀胱組織超微結構變化

假手術組膀胱組織平滑肌細胞排列平行，細胞核為長梭形，占整個細胞的大部分，核膜完整且界限分明，線粒體呈圓形或橢圓形且未見腫脹;與假手術比較，模型組膀胱組織平滑肌細胞排列紊亂，細胞核大體呈橢圓形，核膜邊界斷裂、染色質邊聚，線粒體損傷、腫脹變形、嵴被破壞，出現空泡樣改變;與模型組比較，電針組膀胱組織平滑肌細胞排列較整齊，細胞核為梭形，核膜完整但局部有內陷，線粒體輕度腫脹、嵴完整但模糊。詳見圖3。

2.4" 各組大鼠膀胱組織中細胞損傷情況

與假手術組比較，模型組大鼠膀胱組織中損傷細胞增多，細胞損傷率顯著增加（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組大鼠膀胱組織中損傷細胞減少，細胞損傷率顯著減少（Plt;0.01）。詳見圖4—5。

2.5" 各組大鼠膀胱組織中ATP含量表達

與假手術組比較，模型組大鼠膀胱組織中ATP含量顯著增加（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組大鼠膀胱組織中ATP含量顯著減少（Plt;0.01）。詳見圖6。

2.6" 各組大鼠膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的陽性表達情況

假手術組膀胱組織中可見P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β少量的淺陽性表達。與假手術組比較，模型組膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β平均光密度值相對表達量顯著增高（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β平均光密度值相對表達量顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖7—8。

2.7" 各組大鼠膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達情況

與假手術組比較，模型組的膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著上調（Plt;0.01）;與模型組比較，電針組的膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著下調（Plt;0.01）。詳見圖9。

3 討論

尿液的儲存和定期排出取決于膀胱逼尿肌與括約肌的協調活動，其過程是高位皮質-腦橋中樞協調低位脊髓交感神經、副交感神經和軀體神經系統活動共同作用的結果。膀胱平滑肌和尿道內括約肌受T11-L2的交感神經和S2-S4的副交感神經共同支配，當膀胱平滑肌感受到骶髓副交感神經核傳遞的神經沖動時，促發逼尿肌收縮，引起排尿。高位皮質-腦橋中樞抑制胸腰段（T11-L2）交感中樞，使尿道內括約肌松弛，促進尿液排空[16]。T8的SCI后，骶部排尿反射弧失去了高位排尿中樞的抑制作用，排尿期逼尿肌收縮過程中括約肌舒張不能，從而導致尿液排出受阻及殘余尿量增多，排尿功能下降，呈現尿潴留型NB[14]。隨著病情進一步發展，還會導致上尿路損傷甚至腎衰竭等嚴重后果。

T8椎體下SCI所致尿潴留型NB，因其膀胱逼尿肌-括約肌的高興奮性及尿液排出障礙和大量殘余尿的存在，導致膀胱呈持續性高內壓狀態。相關研究表明，膀胱組織承受高壓力而過度伸展時會加劇細胞焦亡，并使膀胱組織形態結構發生病變，如膀胱組織內大量炎性細胞浸潤、平滑肌肌層明顯增厚肥大及肌纖維排列紊亂等，進而影響膀胱平滑肌舒縮，最終損害膀胱排尿功能[17]。焦亡是一種促炎性的程序性細胞死亡方式，其特點包括細胞膜破裂、細胞器腫脹、TUNEL染色陽性，導致膀胱組織纖維化、炎癥反應顯著、組織肥大及膀胱重塑，這些都是影響膀胱功能的重要原因[7，18]。有研究表明，線粒體損傷與焦亡的發生密切相關[19]。本研究HE染色結果顯示，模型組大鼠膀胱組織炎性反應顯著;透射電鏡結果顯示，模型組大鼠膀胱組織中部分線粒體腫脹破壞;TUNEL染色結果顯示，模型組大鼠膀胱組織中細胞損傷顯著增高。這些均表明膀胱組織可能發生了焦亡，為進一步驗證，故本研究選取了P2X7R/NLRP3/Caspase-1焦亡通路進行驗證。

P2X7R屬于P2X嘌呤受體家族，是ATP門控陽離子通道，廣泛分布在膀胱組織之中。ATP是一種反應化合物，受機械牽拉釋放參與激活P2X7R，而 P2X7R是NLRP3炎癥小體的有效刺激因子之一，NLRP3炎癥小體可促進Caspase-1成熟轉化，引發細胞焦亡，釋放炎癥因子IL-1β[9-10]。相關研究發現，NB模型大鼠膀胱組織中焦亡相關因子NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平明顯上升，膀胱損傷細胞會產生炎癥因子IL-1β，通過刺激平滑肌細胞增殖影響膀胱排尿功能[11，20]。下調焦亡相關因子的表達水平，可明顯改善大鼠膀胱組織中細胞損傷程度、降低膀胱組織炎性細胞浸潤程度、減輕膀胱平滑肌異常增生與肥大、提高膀胱排尿效率。因此，通過影響焦亡減輕膀胱組織病理損傷、減輕膀胱組織炎癥、減輕膀胱組織增生與肥大、修復膀胱排尿結構、改善膀胱尿潴留癥狀，是保護骶上SCI后膀胱功能的重要措施。

本研究尿流動力學檢測結果顯示，模型組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量顯著升高，電針組大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量相對降低，提示電針可部分提高NB大鼠的排尿效率，這與其他相關研究的結果一致。本研究HE染色及透射電鏡結果顯示模型組大鼠膀胱組織形態結構受到損害，結合TUNEL染色顯示模型組大鼠膀胱組織中細胞損傷顯著增高，Western blot法檢測及免疫組織化學法結果顯示模型組大鼠膀胱組織中P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β相對表達量均明顯升高，提示模型組大鼠膀胱組織發生了細胞焦亡，其炎性反應刺激膀胱組織明顯增厚、肥大及肌纖維紊亂，是影響膀胱排尿功能的重要原因之一[21-22]。電針組膀胱組織中細胞損傷顯著降低，P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達下調，且與本次研究的電針組大鼠膀胱尿流動力學結果、膀胱組織形態學檢測結果一致，提示調節P2X7R介導的細胞焦亡途徑是電針改善骶上SCI大鼠膀胱排尿功能的機制之一。有臨床研究和動物試驗證明，電針能減輕膀胱組織病理損傷，改善膀胱排尿功能[23-24]。本次實驗也證明，骶上SCI后NB與焦亡聯系緊密，激活焦亡相關因子表達的同時又會進一步加重膀胱組織炎癥和膀胱組織結構損害，從而限制膀胱排尿功能及效率。因此，通過影響焦亡，能有效保護膀胱排尿功能的結構基礎，提高膀胱排尿效率。

中醫學認為，骶上SCI后所致尿潴留型NB屬于“癃閉”范疇，該病主要由于經脈受損、氣滯血瘀、腎氣虧虛所致。次髎常用于臨床治療尿潴留，是膀胱經分布于腰骶部的重要腧穴，針法以深刺為主，具有調理膀胱的作用。次髎深層有第2骶神經根通過，刺激該穴可調節膀胱平滑肌與內括約肌有節律的運動，改善膀胱排尿困難[25-26]。三陰交是次髎的優勢配穴，具有益腎利水的作用。中極是膀胱的募穴，具有補腎、清熱利濕的作用。中極和三陰交為一組遠近配伍取穴，中極與自主神經的傳入神經有關，三陰交位于L4～S3神經節段支配區域內，給予電刺激可調節神經的興奮性，調節膀胱活動[27-28]。相關研究表明，電刺激應用于臨床治療膀胱障礙疾病的療效可觀[29-31]。故本研究以電針為干預手段，發現電針能相對減輕膀胱的病理損傷程度，延緩本病的發展進程，減低模型大鼠膀胱漏尿點壓力、膀胱最大壓力、膀胱最大容量，減輕尿潴留程度，提高其排尿效率，部分重建膀胱的排尿功能。

綜上所述，電針次髎、中極、三陰交可有效改善骶上SCI后尿潴留型NB大鼠的膀胱排尿功能，緩解尿潴留癥狀，減輕膀胱組織病理損傷程度及其炎癥反應，其機制與抑制P2X7R介導的細胞焦亡途徑上P2X7R、ATP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達有關。該研究為電針治療本病的效應機制研究提供了部分科學依據，有助于應用電針治療該病的進一步臨床推廣。然而，本研究也存在一定不足，如實驗樣本量尚小、電針干預觀察時間尚短以及對于P2X7R介導的細胞焦亡途徑上下游信號通路激活機制研究還可繼續深入等，可在后續研究中進一步探索。

參考文獻

[1] GINSBERG D. The epidemiology and pathophysiology of neurogenic bladder[J]. The American Journal of Managed Care， 2013， 19（10 Suppl）： s191-s196.

[2] TRUZZI J C， DE ALMEIDA F G， SACOMANI C A， et al. Neurogenic bladder-concepts and treatment recommendations[J]. International Braz j Urol， 2022， 48（2）： 220-243.

[3] POWELL C R. Not all neurogenic bladders are the same： A proposal for a new neurogenic bladder classification system[J]. Translational Andrology and Urology， 2016， 5（1）： 12-21.

[4] 卓" 越， 許" 明， 鄧石峰， 等. 大鼠骶上不同節段脊髓損傷后神經源性膀胱模型比較及尿流動力學分析[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2022， 42（9）： 1426-1433.

[5] EVES F J， RIVERA N. Prevention of urinary tract infections in persons with spinal cord injury in home health care[J]. Home Healthcare Nurse， 2010， 28（4）： 230-241.

[6] HU H Z， GRANGER N， JEFFERY N D. Pathophysiology， clinical importance， and management of neurogenic lower urinary tract dysfunction caused by suprasacral spinal cord injury[J]. Journal of Veterinary Internal Medicine， 2016， 30（5）： 1575-1588.

[7] LI Q， HONG Y F， CHEN J， et al. Hypoxia-induced HIF-1α expression promotes neurogenic bladder fibrosis via EMT and pyroptosis[J]. Cells， 2022， 11（23）： 3836.

[8] HOU J W， HSU J M， HUNG M C. Molecular mechanisms and functions of pyroptosis in inflammation and antitumor immunity[J]. Molecular Cell， 2021， 81（22）： 4579-4590.

[9] ROSSATO M， VINCENZO A D， PAGANO C， et al. The P2X7 receptor and NLRP3 axis in non-alcoholic fatty liver disease： A brief review[J]. Cells， 2020， 9（4）： 1047.

[10] SVENNERSTEN K， HALLéN-GRUFMAN K， DE VERDIER P J， et al. Localization of P2X receptor subtypes 2， 3 and 7 in human urinary bladder[J]. BMC Urology， 2015， 15： 81.

[11] HALDAR S， DRU C， BHOWMICK N A. Mechanisms of hemorrhagic cystitis[J]. American Journal of Clinical and Experimental Urology， 2014， 2（3）： 199-208.

[12] 卓" 越， 艾" 坤， 許" 明， 等. 電針對骶上脊髓損傷后大鼠神經源性膀胱及血清外泌體miRNA差異表達的影響[J]. 中國康復醫學雜志， 2023， 38（5）： 577-588.

[13] SHAKER H， MOURAD M S， ELBIALY M H， et al. Urinary bladder hyperreflexia： A rat animal model[J]. Neurourology and Urodynamics， 2003， 22（7）： 693-698.

[14] INSKIP J A， RAMER L M， RAMER M S， et al. Autonomic assessment of animals with spinal cord injury： Tools， techniques and translation[J]. Spinal Cord， 2009， 47（1）： 2-35.

[15] 陳向榮， 游思維， 金大地. BBB評分評估脊髓損傷大鼠后肢運動功能的探討[J]. 中國脊柱脊髓雜志， 2004， 14（9）： 547-549.

[16] PEREZ N E， GODBOLE N P， AMIN K， et al. Neurogenic bladder physiology， pathogenesis， and management after spinal cord injury[J]. Journal of Personalized Medicine， 2022， 12（6）： 968.

[17] WANG K， CHEN L， YANG J， et al. Urethral meatus stricture BOO stimulates bladder smooth muscle cell proliferation and pyroptosis via IL-1β and the SGK1-NFAT2 signaling pathway[J]. Molecular Medicine Reports， 2020， 22（1）： 219-226.

[18] CHEN J， LI Q， HONG Y F， et al. Inhibition of the NF-κB signaling pathway alleviates pyroptosis in bladder epithelial cells and neurogenic bladder fibrosis[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2023， 24（13）： 11160.

[19] 曹子彤， 陳彥君， 談世銘， 等. 氧化型脂蛋白（a）通過抑制細胞色素b表達促進血管內皮細胞焦亡[J]. 中國動脈硬化雜志， 2024， 32（7）： 558-566.

[20] 王" 岳. NLRP3炎癥小體在糖尿病膀胱粘膜細胞凋亡的作用研究[D]. 烏魯木齊： 新疆醫科大學， 2020.

[21] 劉玲玲， 梅繼林， 李" 諾， 等. 夾脊電針調控P2X7R/NLRP3信號通路相關因子改善脊髓損傷大鼠微環境炎癥反應的作用機制研究[J]. 針灸臨床雜志， 2021， 37（3）： 72-79.

[22] 匡靜之， 張" 泓， 艾" 坤， 等. 電針對骶上脊髓損傷后神經源性膀胱大鼠膀胱最大容量和組織形態的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2014， 34（1）： 47-50.

[23] 張偉娜， 陳" 歡， 劉志順. 電針減少復發性膀胱炎發作次數： 1 例病例報告[J]. 世界針灸雜志： 英文版， 2021， 31（4）： 251-253.

[24] 李" 煬， 張潤寧， 劉" 欣. 電針次髎穴治療脊髓損傷后神經源性膀胱作用機制的實驗研究[J]. 山東中醫雜志， 2020， 39（2）： 171-176.

[25] 劉叢叢. 電針次髎/中髎穴興奮逼尿肌效應及其傳入和傳出神經調控機制[D]. 北京： 中國中醫科學院， 2014.

[26] 龍子臨， 劉志順. 基于數據挖掘淺析次髎穴主治病癥及配伍規律[J]. 中國針灸， 2022， 42（4）： 459-463.

[27] 李" 丹， 吳" 霞， 肖四旺. 針灸治療產后尿潴留的選穴規律分析[J]. 中醫藥導報， 2021， 27（2）： 151-154， 159.

[28] 徐建文， 張永臣， 賈紅玲. 基于數據挖掘技術的針刺治療術后尿潴留選穴規律探析[J]. 遼寧中醫雜志， 2023， 50（9）： 1-4.

[29] 郭" 文， 冷" 軍， 田" 夢， 等. 電刺激治療神經源性膀胱研究現狀[J]. 現代中西醫結合雜志， 2020， 29（21）： 2386-2389.

[30] 王舟怡， 黃桂曉， 楊亞梅， 等. 經皮穴位電刺激聯合藥物治療膀胱過度活動癥的療效觀察及對患者焦慮抑郁的影響[J]. 上海針灸雜志， 2023， 42（2）： 153-157.

[31] 郭" 艷， 鮑以嘉， 顧志娟. 三陰交穴位按摩聯合低頻脈沖反饋電刺激對產后壓力性尿失禁患者盆底功能、尿失禁次數的影響[J]. 世界中西醫結志， 2023， 18（9）： 1826-1830，1835.

〔收稿日期〕2024-02-08

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（82274666）;湖南省自然科學基金項目（2022JJ30036，2023JJ50425）。

〔通信作者〕*張" 泓，男，教授，博士研究生導師，E-mail：zh5381272@sina.com;熊明月，女，副主任技師，E-mail：xiongmingyue2182@163.com。