基于網絡藥理學和SIRT1/PGC-1α信號通路探究青光安Ⅱ號方的視神經保護作用

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學和實驗研究探討青光安Ⅱ號方對青光眼視神經的保護作用機制。方法 通過TCMSP數據庫篩選青光安Ⅱ號方成分靶點，在GeneCards、Disgenet、CTD數據庫挖掘青光眼相關靶點，進而篩選青光安Ⅱ號方作用于青光眼的靶點;制作蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡取其交集，并通過GO分析和KEGG富集分析。建立自發性慢性高眼壓DBA/2J青光眼小鼠模型，將C57BL/6J小鼠設置為空白組（等體積蒸餾水），DBA/2J小鼠隨機分為模型組（等體積蒸餾水）、益脈康組[0.31 g/（kg·d）]、青光安Ⅱ號方低濃度組[0.85 g/（kg·d）]、青光安Ⅱ號方中濃度組[1.7 g/（kg·d）]、青光安Ⅱ號方高濃度組[3.4 g/（kg·d）]，每組8只，每日灌胃1次。干預4周后，觸式眼壓筆監測小鼠眼壓;HE染色觀察小鼠視網膜形態結構;Western blot檢測沉默信息調節因子-1（silent information regulator type-1， SIRT1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferation-activated receptor-γ-coactivator 1α， PGC-1α）的蛋白表達水平;qRT-PCR檢測SIRT1、PGC-1α的mRNA表達水平。結果 從青光安Ⅱ號方共篩選得到101個活性成分和245個相關靶點，2 412個青光眼疾病相關基因靶點;藥物-活性成分-靶點相互作用最強的5個靶點分別是前列腺素內過氧化物合成酶2、核受體共激活因子2、胃蛋白酶原Ⅱ、前列腺素內過氧化物合成酶1以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma， PPARG）;PPI網絡顯示較強的靶點是SIRT1、PPARG;GO分析和KEGG富集分析得到細胞衰老、IL-17等信號通路。與給藥前相比，給藥后用藥組眼壓顯著降低（Plt;0.01）。給藥后，與空白組相比，模型組眼壓顯著升高（Plt;0.01），視網膜中SIRT1、PGC-1α mRNA表達量和蛋白表達量均顯著降低（Plt;0.01）;與模型組相比，用藥組眼壓顯著降低（Plt;0.01），SIRT1、PGC-1α mRNA表達量和蛋白表達量均顯著升高（Plt;0.01）。與益脈康組和青光安Ⅱ號方低濃度組相比，青光安Ⅱ號方中、高濃度組SIRT1、PGC-1α mRNA表達量和SIRT1蛋白表達量顯著升高（Plt;0.01）;與青光安Ⅱ號方低濃度組相比，青光安Ⅱ號方高濃度組PGC-1α蛋白表達量均顯著上升（Plt;0.01）。與青光安Ⅱ號方中濃度組相比，青光安Ⅱ號方高濃度組PGC-1α mRNA表達量和蛋白表達量顯著升高（Plt;0.01）。結論 青光安Ⅱ號方可有效調控SIRT1/PGC-1α信號通路，抑制RGC的丟失，主要在氧化應激、細胞衰老等方面對青光眼視神經發揮保護作用。

〔關鍵詞〕 青光眼;青光安Ⅱ號方;細胞衰老;沉默信息調節因子-1;過氧化物酶體增殖物激活受體g共激活因子-1α

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.08.013

Protective effects of Qingguang'an Ⅱ Formula on the optic nerve based on network pharmacology and SIRT1/PGC-1α signaling pathway

LV Yi1，2， JIANG Pengfei1，2， PENG Jun2，3*， PENG Qinghua1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Engineering Technology Research

Center for Prevention amp; Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases and Visual Function Protection with

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，

Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of protective action of Qingguang'an Ⅱ Formula （QGAFⅡ） on optic nerve in glaucoma based on network pharmacology and experimental research. Methods Targets of QGAFⅡ components were screened through the TCMSP database， and glaucoma-related targets were mined from GeneCards， Disgenet， and CTD databases. Then the targets through which QGAFⅡ acts on glaucoma were identified. A protein-protein interaction （PPI） network was constructed using the intersection of these targets， and GO and KEGG pathway analyses were performed on them. A spontaneous chronic high intraocular pressure （IOP） DBA/2J glaucoma mouse model was established. C57BL/6J mice were set as the blank group （an equal volume of distilled water）， and DBA/2J mice were randomize into the model group （an equal volume of distilled water）， Yimaikang （YMK） group [0.31 g/（kg·d）]， and low- [0.85 g/（kg·d）]， medium- [1.7 g/（kg·d）]， and high-concentration [3.4 g/（kg·d）] QGAFⅡ groups. Each group consisted of eight mice， and they were administered by gavage once daily. After 4 weeks of intervention， the IOP of mice was monitored by a contact tonometer; HE staining was used to observe the morphological structure of the mouse retina; Western blot was used to examine the protein expression levels of silent information regulator type-1 （SIRT1） and peroxisome proliferator-activated receptor-γ-coactivator 1α （PGC-1α）; qRT-PCR was used to check the mRNA expression levels of SIRT1 and PGC-1α. Results A total of 101 active ingredients and 245 related targets were screened from QGAFⅡ. Additionally， 2，412 disease-related gene targets for glaucoma were identified. The five targets with the strongest drug-active ingredient-target interactions were prostaglandin-endoperoxide synthase 2， nuclear receptor coactivator 2， pepsinogen Ⅱ， prostaglandin-endoperoxide synthase 1， and peroxisome proliferator activated receptor gamma （PPARG）. The PPI network showed that the stronger targets were SIRT1 and PPARG. Signaling pathways such as oxidative stress， cellular senescence， and IL-17 were obtained by GO and KEGG enrichment analyses. Compared with before administration， the IOP of the treatment groups significantly decreased after administration （Plt;0.01）. After administration， compared with the blank group， the model group showed a significant increase in IOP （Plt;0.01）， and the mRNA and protein expression levels of SIRT1 and PGC-1α in the retina were significantly reduced （Plt;0.01）. Compared with the model group， the IOP in the treatment groups showed a significant decrease （Plt;0.01）， while the mRNA and protein expression levels of SIRT1 and PGC-1α significantly increased （Plt;0.01）. Compared with the YMK group and the low-concentration QGAFⅡ group， the mRNA expression levels of SIRT1 and PGC-1α and the protein expression level of SIRT1 significantly increased in the medium- and high-concentration QGAFⅡ groups （Plt;0.01）; compared with the low-concentration QGAFⅡ group， the protein expression level of PGC-1α in the high-concentration QGAFⅡ group significantly increased （Plt;0.01）; compared with the medium-concentration QGAFⅡ group， the mRNA and protein expression levels of PGC-1α significantly increased in the high-concentration QGAFⅡ group （Plt;0.01）. Conclusion QGAFⅡ can effectively regulate the SIRT1/PGC-1α signaling pathway， and inhibit the loss of retinal ganglion cells （RGCs）. It mainly exerts protective effects on the optic nerve in glaucoma by targeting oxidative stress and cellular senescence.

〔Keywords〕 glaucoma; Qinguang'an Ⅱ Formula; cellular senescence; silent information regulator type-1; peroxisome proliferation-activated receptor-γ-coactivator 1α

青光眼作為年齡相關性視神經退行性病變疾病，又被稱作是眼部的阿爾茨海默病[1]。雖然，病理性高眼壓被認為是青光眼進展的先導因素，但高眼壓無法解釋正常眼壓性青光眼的視神經損傷，臨床上亦存在部分患者經過有效降眼壓治療后視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell， RGC）仍持續性丟失，導致視神經進行性萎縮，極大程度影響患者生活質量[2]。研究表明，青光眼中晚期視神經退變以及眼壓控制后視神經仍進行性損傷是衰老的結果[3]。神經元細胞一旦損傷通常不會再生，因此，在控制眼壓的同時，如何進行有效視神經保護治療逐漸成為研究熱點。

現代醫學認為，神經退行性變的發病機制大多與衰老相關。從中醫學角度理解，亦可說明青光眼視神經損害與衰老相關。彭清華教授結合多年臨床經驗指出，青光眼中晚期患者的關鍵病機在于肝腎虧虛、氣虛血瘀，為因虛致實之病[4]。久病可導致精氣虧耗，加之本病多發于中老年，陰血無以充養，陽氣逐漸痿弱，致肝腎不足、精血暗耗，此乃青光眼中晚期病機的本質。而肝腎精血虧虛會導致機體組織細胞的衰老，視神經進行性萎縮就是“衰老”的表現之一。青光安Ⅱ號方是彭清華教授的經驗方，該方由枸杞子、牛膝、女貞子、黃芪、燈盞細辛、川芎組成，具有補益肝腎、益氣活血的功效，可用于治療肝腎虧虛、脈絡瘀滯的青光眼中晚期視神經損害[5-9]。補益肝腎一直被認為是抗衰老的根本，而驅除瘀積是祛瘀生新的重要步驟，瘀積之物不除，阻礙精血上達，則目竅日漸衰老。本團隊前期研究表明，青光安Ⅱ號方可提高RGC的存活率，具有保護視神經的作用，但具體機制并未明確[5-11]。沉默信息調節因子-1（silent

information regulator type-1， SIRT1）是組蛋白去乙酰化酶家族中的一員，在視網膜損傷和眼部老化中起重要作用[12]。同時，SIRT1通過去乙酰化過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome pr?

oliferation-activated receptor-γ-coactivator 1α， PGC-1α）可以提高細胞對氧化應激的抵抗力，還可以影響線粒體呼吸功能和活性氧（reactive oxygen species， ROS）積累，從而在能量代謝、氧化平衡、細胞存活、衰老等過程中發揮作用[13-14]。SIRT1/PGC-1α信號通路協同發揮抗衰作用[15]。

研究表明，益脈康分散片具有清除氧自由基的作用，還可以提高機體抗纖溶活性和抗血栓形成，能夠改善視網膜血管的血液黏滯狀態，聯合甲鈷胺片還能夠控制青光眼眼壓、改善視野，顯示出一定的視神經保護作用[16]。本研究采用網絡藥理學技術探究青光安Ⅱ號方治療青光眼的機制，并加以實驗驗證：采用益脈康分散片作為陽性藥物對照組，觀察青光安Ⅱ號方不同藥物濃度對青光眼模型DBA/2J小鼠視網膜中SIRT1、PGC-1α蛋白表達水平的影響，以進一步探究青光安Ⅱ號方對青光眼視神經保護作用的機制。

1 材料

1.1" 實驗動物

SPF級DBA/2J雌性小鼠40只，6周齡，18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，質量合格證：1100111911055898。SPF級C57BL/6J雌性小鼠8只，6周齡，18～22 g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心代購，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002，質量合格編號：ZS-202111230007。實驗經湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準：LLBH-2021ZYX13。

1.2" 主要藥品及試劑

青光安Ⅱ號方：由枸杞子、女貞子、黃芪、川芎、牛膝、燈盞細辛按比例（1.5∶1.5∶1.5∶1∶1∶1）用滅菌蒸餾水制成懸混液（藥材均采購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院）。益脈康分散片（湖南湘雅制藥有限公司，國藥準字Z20080073，規格：400 mg/片）。

SIRT1抗體、PGC-1α抗體、β-actin、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為AS391-1、AF7736、AF0003、P0013C）;SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、PVDF轉印膜（蘭杰柯科技有限公司，批號分別為BL522A、BL521A、BS-PVDF-45）;電泳緩沖液購、脫脂奶粉（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為G2018、G5002）。

1.3" 主要儀器

筆試眼壓計（美國Reichert公司，型號：Reichert 7）;灌胃針（北京冀諾泰科技發展有限公司，型號：JNT-GWQ）;光學顯微鏡（北京奧特偉業科貿有限公司，型號：BK6000）;裂隙燈顯微鏡（日本Topcon公司，型號：SL-3G）;低溫離心機、搖床、熒光定量RCP儀、電泳儀、液氮罐（美國Thermo公司，型號為75009750、88882014、A51685、G8100、CY50985-70）;EP管（上海希言科學儀器有限公司，型號：10-0850）;-80 ℃冰箱（中國美菱公司，型號：DW-HL530）。

2 方法

2.1" 青光安Ⅱ號方治療青光眼的網絡藥理學研究

2.1.1" 青光安Ⅱ號方活性成分的獲取及其對應靶點的收集" 在TCMSP數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中篩選青光安Ⅱ號方中六味中藥的活性成分，設置口服利用度（oral bioavailability， OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件進行篩選;獲得其相關靶點后導入Excel表格中處理，去除重復值，并利用UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/）對各靶點名稱進行規范化處理。

2.1.2" 構建青光安Ⅱ號方藥物-活性成分-靶點相互作用網絡圖" 將青光安Ⅱ號方藥物、藥物活性成分以及活性成分對應的靶點均導入Cytoscape 3.9.1軟件中進行處理，獲得藥物-活性成分-靶點相互作用的網絡，利用Network Analyze功能對網絡進行分析，獲得各靶點的節點度（Degree）值后行可視化處理。

2.1.3" 青光眼疾病基因靶點收集及韋恩圖制作" 以“glaucoma”為檢索詞于GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、Disgenet數據庫（https：//www.disgenet.org/）、CTD數據庫（https：//ctdbase.org/）中進行檢索，獲得青光眼疾病基因靶點。借助Draw Venn Diagram軟件制作韋恩圖，將成分靶點與青光眼疾病靶點取交集以獲得青光安Ⅱ號方治療青光眼的關鍵靶點。

2.1.4" 構建青光安Ⅱ號方治療青光眼的蛋白質-蛋白質相互作用網絡" 將方藥與疾病的靶點導入String平臺（https：//string-db.org/cgi/input.pl），獲得蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，再利用Cytoscape軟件對PPI網絡進行分析及可視化處理。

2.1.5" GO及KEGG富集分析及可視化" 將方藥治療疾病的靶點導入Metascape平臺（https：//metascape.org/）進行GO富集分析，包括生物學過程（biological process， BP）、細胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）。物種選擇為Homo sapiens，選擇Custom Analysis，設置Min Overlap為3，P-value Cutoff為0.01，Min Enrichment為1.5，將結果導入Excel表格中，根據Count進行降序排列，選擇前10的內容，利用微生信平臺進行可視化處理。KEGG富集分析同上述法。

2.2" 青光安Ⅱ號方對青光眼視神經保護作用的實驗研究

2.2.1" 青光眼小鼠模型建立及給藥" 本實驗采用的DBA/2J小鼠喂養至38周齡時即可自動成模[17]。將C57BL/6J小鼠設置為空白組，DBA/2J小鼠隨機分為模型組、益脈康組以及青光安Ⅱ號方低、中、高濃度組，每組8只。

參照團隊前期研究[4-11]及《中醫科研設計與統計學》[18]中成人等效劑量換算方法，得出各組藥物濃度如下，益脈康組0.31 g/（kg·d）、青光安Ⅱ號方低濃度組0.85 g/（kg·d）、青光安Ⅱ號方中濃度組1.7 g/（kg·d）、青光安Ⅱ號方高濃度組3.4 g/（kg·d）。給予以上各組藥物混懸液2 mL（用蒸餾水作為溶劑制配），空白組、模型組予等體積蒸餾水，灌胃1次/d，連續干預4周。

2.2.2" 監測眼壓" 造模成功后，對給藥前及給藥4周后的小鼠右眼眼壓進行測量。在小鼠清醒狀態下每日固定時間段用接觸式眼壓筆測量眼壓，3次重復測量后取平均值。

2.2.3" HE染色觀察視網膜形態結構" 將視網膜組織制成石蠟切片后，蘇木精染色2 min，沖洗，1%鹽酸乙醇分化液10 s，沖洗，氨水返藍2 min，梯度乙醇脫水，伊紅染色2 min，沖洗，無水乙醇脫水，二甲苯透明。風干后滴加中性樹膠以封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.2.4" qRT-PCR檢測各組視網膜SIRT1、PGC-1α mRNA表達" 用Trizol法提取小鼠視網膜組織中總RNA，然后按試劑盒說明書依次加入2 μL Primer Mix，7 μL RNA Template，4 μL 5×RT Buffer，2 μL DTT和1 μL HiFiScript，逆反錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。運用Primer 5.0軟件設計引物，采用微流控微滴發生儀制備微滴后，將微滴轉移到96孔PCR板上，封膜，于梯度PCR儀上按試劑盒說明進行擴增。擴增條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃、30 s，58 ℃、1 min，40個循環;4 ℃、5 min，90 ℃、5 min;4 ℃保溫，升降溫速度≤2 ℃/s。以β-actin作為內參，2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。SIRT1：正向 5'-TTCTATACCCCATGAAGTGCCTC -3'，反向5'-CACCACCTAGCCTATGACACA-3'，長度128 bp;PGC-1α：正向5'-AAGTGGTGTAGCGACCAATCG-3'，反向5'-AATGAGGGCAATCCGTCTTCA-3'，長度161 bp;β-actin：正向5'-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3'，反向5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'，長度223 bp。

2.2.5" Western blot檢測各組視網膜SIRT1、PGC-1α蛋白表達" 取視網膜組織按照1∶100的比例加入RIPA裂解液，組織破碎儀90 Hz，45 s，循環5次，以破碎組織。冰上裂解20 min后，離心機4 ℃12 000 r/min，離心15 min（離心半徑9 cm），取上清液。按照試劑盒說明進行蛋白濃度測定，用RIPA配平成等密度、同體積的蛋白樣品。在60 V恒定電壓中電泳，當溴酚藍遷移至凝膠底部時停止電泳。冰水浴恒流300 mA，2 h，轉膜到PVDF膜;室溫下封閉1 h;稀釋一抗，取出PVDF膜，加入SIRT1（1∶1 000）、PGC-1α抗體（1∶2 000）4 ℃封閉過夜，4 ℃孵育過夜;PBS洗滌3次，每次5 min后二抗孵育2 h。置于避光室內，按照發光試劑A∶B=1∶1比例混合顯影并存檔，采用Image J軟件分析灰度值。

2.2.6" 統計學分析" 采用SPSS 26.0統計軟件對結果進行分析。若滿足正態性和方差齊性，則采用單因素方差分析;多重比較采用LSD法;若不符合正態分布或方差齊性，則采用非參數檢驗;計量資料以“x±s”表示，Plt;0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 青光安Ⅱ號方活性成分及靶點篩選

在TCMSP數據庫中獲得青光安Ⅱ號方的活性成分為101個，其中有10個成分無法在TCMSP數據庫中預測到靶點，故予以剔除，將91個成分預測所得靶點整合并刪除重復值，共得到靶點245個。以下選取每種藥物排名前2的活性成分，詳見表1。

3.2" 構建青光安Ⅱ號方藥物-活性成分-靶點相互作用網絡圖

藥物中Degree值最大的為枸杞，活性成分中相互作用最強的前5位為槲皮素、山柰酚、木犀草苷、β-谷甾醇以及黃芩素。靶點中相互作用最強的5個分別是前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase， PTGS）2、核受體共激活因子2（nuclear receptor coactivator 2， NCOA2）、胃蛋白酶原Ⅱ（pepsinogen I/pepsinogen Ⅱ， PGR）、PTGS1以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma， PPARG）。詳見圖1。

3.3" 青光安Ⅱ號方治療青光眼關鍵靶點網絡構建

通過CTD、GeneCard、Disgenet數據庫整合去重后獲得青光眼疾病相關基因靶點2 412個。青光安Ⅱ號方靶點與青光眼疾病靶點取交集，共獲得青光安Ⅱ號方治療青光眼靶點155個。將青光安Ⅱ號方治療青光眼的靶點導入String平臺后獲得青光安Ⅱ號方治療青光眼的PPI網絡，SIRI1、PPARG均為作用較強的靶點。詳見圖2。

3.4" 青光安Ⅱ號方治療青光眼靶點的GO及KEGG富集分析及可視化

運用Metascape進行GO富集分析后將BP、CC、MF三部分結果均按Count進行降序排列，各取前10位繪制柱狀圖，詳見圖3。BP富集結果主要為細胞因子對無機物、激素、含氮化合物、有機環狀化合物、有機氮化合物的反應等。CC富集結果主要為膜微域、膜筏、樹突狀樹、樹突、突觸后等。MF富集結果主要為激酶綁定、蛋白激酶結合、轉錄因子結合、DNA結合轉錄因子結合、氧化還原酶活性等。KEGG富集結果主要為癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、IL-17信號通路、細胞衰老等通路，詳見圖4。

3.5" 青光安Ⅱ號方對小鼠眼壓的影響

與給藥前相比，給藥后用藥組眼壓顯著降低（Plt;0.01）。給藥前，與空白組相比，其他組眼壓顯著升高（Plt;0.01）。給藥后，與空白組相比，模型組眼壓顯著升高（Plt;0.01），用藥組眼壓顯著降低（Plt;0.01）;與模型組相比，用藥組眼壓顯著降低（Plt;0.01）。詳見表2。

3.6" 青光安Ⅱ號方對小鼠視網膜形態結構的影響

空白組小鼠視網膜各層組織結構致密有序，視網膜神經節細胞排列有序，細胞形態完整;模型組小鼠視網膜各層組織分離，結構紊亂，神經節細胞層可見較多空泡，神經節細胞數量減少、大小不等，視網膜各層厚度均變薄;與模型組相比，益脈康組及青光安Ⅱ號方低、中、高濃度組小鼠視網膜均可見不同程度的改善，神經節細胞層內空泡減少，視網膜增厚;其中青光安Ⅱ號方高濃度組改善較為明顯，視網膜各層結構相對致密，神經節細胞明顯增多，細胞膜較為完整，細胞核清晰。詳見圖5。

3.7" 青光安Ⅱ號方對小鼠視網膜組織SIRT1、PGC-1α mRNA的影響

與空白組相比，模型組、益脈康組和青光安Ⅱ號方低、中濃度組視網膜中SIRT1、PGC-1α mRNA表達量顯著降低（Plt;0.01）;與模型組相比，用藥組SIRT1、PGC-1α mRNA表達量均顯著升高（Plt;0.01）;與益脈康組相比，青光安Ⅱ號方低濃度組PGC-1α mRNA表達量均顯著升高（Plt;0.01），青光安Ⅱ號方中、高濃度組SIRT1、PGC-1α mRNA表達量顯著升高（Plt;0.01）;與青光安Ⅱ號方低濃度組相比，青光安Ⅱ號方中、高濃度組SIRT1、PGC-1α mRNA表達量顯著升高（Plt;0.01）;與青光安Ⅱ號方中濃度組相比，青光安Ⅱ號方高濃度組PGC-1α mRNA表達量顯著升高（Plt;0.01）。詳見表3。

3.8" 青光安Ⅱ號方對小鼠視網膜組織SIRT1、PGC-1α 蛋白表達量的影響

與空白組相比，其余各組視網膜SIRT1、PGC-1α蛋白表達量顯著降低（Plt;0.01）;與模型組相比，用藥組SIRT1、PGC-1α蛋白表達量顯著升高（Plt;0.01）;與益脈康組比較，青光安Ⅱ號方各濃度組SIRT1、PGC-1α蛋白表達量均顯著升高（Plt;0.01）;與青光安Ⅱ號方低濃度組相比，青光安Ⅱ號方中、高濃度組SIRT1蛋白表達量均顯著上升（Plt;0.01），青光安Ⅱ號方高濃度組PGC-1α蛋白表達量顯著上升（Plt;0.01）;與青光安Ⅱ號方中濃度組相比，青光安Ⅱ號方高濃度組SIRT1、PGC-1α蛋白表達量均顯著上升（Plt;0.01）。詳見表4、圖6。

4 討論

中醫學將青光眼視神經萎縮的階段歸屬于“青盲”范疇，多責之于肝腎虧虛[19]。諸多醫家認為，肝腎與衰老之間有著緊密聯系。青光安Ⅱ號方中枸杞子、女貞子、牛膝皆為滋補肝腎之品，黃芪為健脾化源之物，牛膝與燈盞細辛、川芎合用活血化瘀，川芎、黃芪相配利水行氣，全方以補為主，補中寓通，共奏補益肝腎、活血利水之功，可有效延緩青光眼視神經的衰老退化。網絡藥理學研究顯示，青光安Ⅱ號方和青光眼的共同靶點主要富集在氧化應激、細胞衰老、轉錄因子結合等方面，PPI網絡中PPARG、SIRT1為相互作用較強的靶點。沉默信息調節因子（silent information regulator type，SIRT）家族被稱為“衰老基因家族”，SIRT1是其成員之一，在眼組織中高度表達，包括視網膜[20]。YAMAN等[21]發現，與正常人相比，POAG和剝脫性青光眼患者小梁網組織中SIRT1明顯下調;紀舒昱等[22]實驗表明，相比健康對照組，POAG患者小梁網組織中SIRT1和PGC-1α的表達量呈下降趨勢。本研究中模型組小鼠視網膜中SIRT1、PGC-1α mRNA表達及蛋白表達較空白組亦明顯降低。進一步證實了SIRT1、PGC-1α表達活性的下調可能是青光眼發病因素之一。這可能與神經細胞衰老相關，機體內SIRT1的表達會隨年齡增加逐漸下降，而SIRT1的表達水平可直接影響神經細胞的壽命[23]。

與模型組相比，給藥組SIRT1、PGC-1α mRNA表達及蛋白表達均升高;與益脈康組相比，青光安Ⅱ號方各濃度組PGC-1α mRNA表達量及SIRT1、PGC-1α蛋白表達量均顯著升高，青光安Ⅱ號方中、高濃度組SIRT1 mRNA表達量顯著升高。與青光安Ⅱ號方低濃度組相比，青光安Ⅱ號方中、高濃度組SIRT1、PGC-1α mRNA表達量及SIRT1蛋白表達量顯著升高，青光安Ⅱ號方高濃度組PGC-1α蛋白表達量顯著上升;與青光安Ⅱ號方中濃度組相比，青光安Ⅱ號方高濃度組PGC-1α mRNA表達量及SIRT1、PGC-1α蛋白表達量均顯著升高。盡管Western blot和qRT-PCR的檢測結果并不完全一致，但總體具有協同性。SIRT1是線粒體生物合成信號通路中的關鍵蛋白[24]。PGC-1α位于SIRT1 的下游區域，既是核轉錄共激活因子，又是調節線粒體生物發生的重要因子[25]。且PGC-1α為PPARG的輔助激活因子，PPARG基因定位于3p25，是重要的細胞分化轉錄因子，主管細胞分化及能量代謝[26]。SIRT1/PGC-1a信號通路被稱作是細胞的“能量感應網絡”，涵蓋了線粒體功能調節、能量輸出等環節[27]。SIRT1激活劑會增加受壓的RGC-5細胞中的琥珀酸脫氫酶的表達，并促進 PGC-1α的脫乙酰化影響氧化應激和減少線粒體呼吸功能，從而抑制視網膜神經元細胞的死亡[28]。線粒體存在于細胞核內，以ATP的形式為機體提供能量，以滿足其細胞需求，是細胞內產生“精氣”的單位[29]。激活 SIRT1/PGC-1a信號通路類似于中醫所謂“補虛”之法，如同青光安Ⅱ號方補益肝腎以溫煦氣化之源。本次實驗結果提示，青光安Ⅱ號方上調SIRT1、PGC-1α效果優于益脈康分散片，可能與藥物組成的功效相關，益脈康分散片中活血化瘀藥物居多，“通”的作用較強，而青光Ⅱ號“補中寓通”，補益肝腎作用強于益脈康分散片，因此調節能量的“補虛”作用較強。

本研究發現，與給藥前相比，給藥后青光安Ⅱ號方低、中、高濃度組小鼠眼壓后均降低;與模型組相比，給藥組小鼠眼壓均降低。慢性青光眼患者通常存在血液循環障礙、房水流通障礙等“血水同病”的特點，需血水同治，活血藥與利水藥相配伍可改善微循環，加速房水循環，降低眼壓[30-31]。青光安Ⅱ號方中牛膝和燈盞細辛可活血化瘀，川芎和黃芪可行氣利水，提示青光安Ⅱ號方降低小鼠眼壓的作用可能與活血行氣利水功效有關。視網膜形態、厚薄程度及RGC數量等指標對評價視神經保護制劑有重要價值[32]。本研究中，與模型組相比，給藥組DBA/2J小鼠視網膜均可見不同程度的改善，視網膜神經節細胞層內空泡減少，視網膜增厚，其中以青光安Ⅱ號方高濃度組改善較為顯著。說明青光安Ⅱ號方可有效改善小鼠視網膜形態結構損害，防止RGC的丟失，從而保護視神經。

綜上，網絡藥理學與體內實驗研究表明，青光安Ⅱ號方可抑制RGC的丟失，對視神經有保護作用，其機制可能與激活SIRT1/PGC-1α信號通路、調控氧化應激或衰老過程相關。但由于選用的數據庫有限，活性成分、靶點更新相對緩慢，篩選方式局限，無法完全納入藥物治療疾病的所有靶點。本實驗還需進一步與臨床實驗進行相互驗證，以進一步明確青光安Ⅱ號方發揮視神經保護作用的機制。

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〔收稿日期〕2024-04-01

〔基金項目〕國家自然科學基金面上項目（82274588，81874492）;國家中醫藥管理局人才支持項目——岐黃學者（國中醫藥人教函〔2022〕6號）;湖南省中醫藥科研計劃項目（D2022045）;湖南省自然科學基金青年基金項目（2020JJ5436）;湖南中醫藥大學科研揭榜掛帥項目（2022XJJB003）;中醫藥防治五官科疾病湖南省重點實驗室建設項目（2017TP1018）;國家中醫藥管理局中醫眼科學重點學科建設項目（ZK1801YK015）;湖南中醫藥大學中醫學國內一流建設學科建設項目;中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室開放基金項目（2018YZD02）。

〔通信作者〕*彭清華，男，博士，二級教授，博士研究生導師，E-mail：pqh410007@126.com;彭" 俊，男，碩士，E-mail：154451101@qq.com。