一株馬立克病病毒特超強變異株meq基因編輯缺失候選疫苗毒株的構建與鑒定

摘" 要： 馬立克病（MD）是由馬立克病病毒（MDV）感染引起的一種重要的家禽免疫抑制病與腫瘤病，該病可用疫苗進行預防和控制，但在長期免疫壓力下MDV的毒力持續增強，經典MD疫苗已難以對當前流行的特超強MDV（HV-MDV）變異株提供良好的免疫保護，亟需研發新一代MD高效疫苗。本文以HV-MDV變異株HNSQ01為親本毒株，在CEF上連續傳代之后，利用CRISPR/Cas9系統對其meq基因進行編輯，通過一系列試驗鑒定和分析，最終建立一株meq基因編輯缺失的MD疫苗候選毒株，命名為SQ01Δmeq。1日齡SPF雞攻毒試驗結果顯示，在77 d試驗周期內，親本毒株HNSQ01不僅嚴重抑制感染雞生長并導致免疫抑制，而且導致100%的MD發病率、100%致死率及80%的肉眼觀察腫瘤發生率；但SQ01Δmeq未引起感染雞的生長及免疫抑制，而且MD發病率、致死率及腫瘤發生率均為0%，表明其對宿主無致病性，生物安全性良好。本研究建立的meq基因編輯缺失MDV毒株SQ01Δmeq，為后續研發新型高效的MD疫苗奠定了重要基礎。

關鍵詞： 馬立克?。籑DV；meq；CRISPR/Cas9；基因編輯；基因缺失；新型疫苗

中圖分類號： S852.659.1

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5672-12

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.030

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-21

基金項目：國家自然科學基金（U21A20260）；河南省杰出青年科學基金（232300421009）；河南省農業科學院自主創新項目（2024ZC096）

作者簡介：張" 多（1998-），女，河南永城人，碩士生，主要從事動物疫病防控技術研究，E-mail： 16696657142@163.com

*通信作者：羅" 俊，主要從事動物病毒學研究，E-mail： luojun593@aliyun.com；余祖華，主要從事動物分子免疫學研究，E-mail： yzhd05@163.com

Development and Pathogenicity Analysis of a meq-gene-edited Candidate Marek’s Disease Vaccine Strain Generated from a Hypervirulent MDV Variant

ZHANG" Duo1，2，3， TENG" Man2，3， ZHANG" Zhuo2，3，4， LIU" Jinling2，3， ZHENG" Luping2，3， GE" Siyu2，3，4， HAN" Fang1，2，3， LUO" Qin5， CHAI" Shujun2，3， ZHAO" Dong2，3， YU" Zuhua1*， LUO" Jun2，3，4*

（1.Laboratory of Functional Microbiology and Animal Health， College of Animal Science and Technology，

Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003，" China;

2.Institute for Animal Health amp; UK-China Center of Excellence for Research on Avian Disease， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002，" China;

3.Longhu Laboratory， Zhengzhou 450046，" China;

4.College of Public Health， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001，" China;

5.College of Veterinary Medicine， Henan University of Animal Husbandry and Economy， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：" Marek's disease （MD）， caused by Marek's disease virus （MDV）， is one of the most important immunosuppressive and neoplastic diseases. It can be prevented and controlled with MD vaccines， but the virulence of epidemic MDV strains persistently increases under the highly immune pressure of widely used MD vaccines. Recent studies have found that the classical MD vaccines are no longer able to provide ideal immune protection for the current prevalent hypervirulent MDV （HV-MDV） variant， which implies the urgent need to develop a new generation of highly effective MD vaccines. Presently， we have used the newly isolated HV-MDV variant HNSQ01 as the parental virus， first passaged on CEF monolayers in vitro， to generate a meq gene-edited and knocked out mutant of SQ01Δmeq utilizing the CRISPR/Cas9-based gene editing technology. A series of experiments and analysis have demonstrated a stable MD vaccine candidate strain of SQ01Δmeq has been successfully generated. Furthermore， the pathogenicity analysis was performed with 1-day-old specific-pathogen-free （SPF） chickens for virus challenge experiments. During the 77-days animal experiments， the parental HNSQ01 had caused serious atrophy of host immune organs and inhibited the growth of virus-challenged birds， together with the 100% MD morbidity， 100% mortality and 80% gross tumor occurrence. However， SQ01Δmeq had not caused the immunosuppression or inhibited the growth of virus-challenged birds， together with the 0% rates of MD morbidity， mortality and tumor occurrence. Our data indicate that the generation of SQ01Δmeq provides an important basis for the future research and development of novel efficient genetically engineered MD vaccines.

Key words： Marek's disease; MDV; meq gene; CRISPR/Cas9; Gene editing; gene deletion; novel vaccine

*Corresponding authors：" LUO Jun， E-mail： luojun593@aliyun.com; YU Zuhua， E-mail： yzhd05@163.com

雞馬立克?。∕arek's disease，MD）是由馬立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）感染誘發的一種重要的家禽免疫抑制病與腫瘤?。?］。MDV可感染雞、火雞、鵪鶉等，引發宿主神經損傷、免疫抑制及淋巴瘤組織增生，最終導致動物大批死亡，每年給全球養禽業造成巨大經濟損失。與MD有關的家禽皰疹病毒，曾分為三種不同血清型，包括血清Ⅰ型（MDV serotype 1，MDV-1）即禽α皰疹病毒2型（Gallid alphaherpesvirus 2，GaAHV-2）、血清Ⅱ型MDV（MDV serotype 2，MDV-2）即禽α皰疹病毒3型（Gallid alphaherpesvirus 3，GaAHV-3）和火雞皰疹病毒（Herpesvirus of turkeys，HVT），也被命名為火雞α皰疹病毒1型（Melleagrid alphaherpesvirus 1，MeAHV-1）［2］。其中，只有MDV-1分離株對宿主具有致病性和致瘤性。作為首個使用疫苗成功預防控制的病毒性腫瘤病，MD曾在20世紀末得到了良好的控制。但在MD疫苗長期使用的免疫壓力下，導致MDV流行毒株毒力不斷增強。根據對宿主的致病性，可將MDV-1分離株劃分為不同的致病型，包括溫和毒（mild MDV，mMDV）、強毒（virulent MDV，vMDV）、超強毒（very virulent MDV，vvMDV）以及特超強毒（very virulent plus MDV，vv+MDV）［3］。近年來，一些vv＋MDV毒株，特別是最近從MD疫苗免疫雞群發病病例中分離鑒定的特超強MDV（Hypervirulent MDV，HV-MDV）變異株［4-5］ ，被證實已全面突破了當前廣泛使用的MD經典疫苗的免疫保護，很可能是導致近期MD病例頻繁暴發的主要原因，給我國家禽養殖業造成嚴重危害［6］。

meq基因是MDV最重要的致瘤基因［7］，全長1 020 bp，是MDV-1特有的基因。有研究表明meq基因與其他轉錄因子通過宿主和病毒基因的表達修飾在 MDV 誘導的T細胞淋巴瘤發生中發揮關鍵作用［8］。利用細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）和基因同源重組技術敲除MDV強毒株的meq基因后，病毒不再具有致瘤作用，這一發現揭示了meq基因在MDV致瘤中發揮關鍵作用［7］。隨后，以meq基因為主要靶標進行病毒基因組改造，構建了一系列MD基因缺失疫苗候選毒株，如rMd5Δmeq、Md5BACΔMeqΔLORF9、686BAC-ΔMeqΔvIL8、rMSΔmeq以及SC9-1等［9-19］，成為21世紀以來新型MD疫苗研究的熱點［20］。受眾多未明因素的影響，對于絕大多數的meq基因缺失候選疫苗毒株而言，仍存在導致宿主免疫抑制或免疫保護效力不足的問題，難以走向商業化應用。

基于CRISPR/Cas9系統的基因編輯是一種新型高效的遺傳操作技術，幾乎可以靶向編輯任何一種基因。目前，該技術也被廣泛用于病毒學研究［21］，其中已被編輯研究過的病毒多為DNA病毒，包括MDV在內的皰疹病毒［21-23］。在此前的研究中［24-29］，我們已開展了一系列的MDV基因編輯研究，包括病毒的蛋白編碼基因meq、pp38以及非編碼RNA基因如miRNAs。在最近的研究中［29，30］，我們還成功的將該技術應用于MDV特異性單克隆抗體的篩選和鑒定，充分展示了CRISPR/Cas9基因編輯的技術優勢。當前，疫苗免疫雞群頻繁暴發MD，經典MD疫苗對新出現的HV-MDV變異株免疫保護效力低下，迫切需要研發新一代高效的MD疫苗［4-6］。2019年以來，受多種因素疊加影響，如新冠疫情暴發、MDV毒力增強以及疫苗免疫效力下降等，國內雞群暴發大規模家禽腫瘤病，其中HV-MDV變異株的流行及感染是主要誘因［6］。此前研究發現，已分離鑒定的HV-MDV變異株中，HNSQ01似乎毒力最強，可導致SPF感染雞100%的MD發病率、86.7%的死亡率以及63.3%的腫瘤發生率［5］。為獲得更好的抗原性，本研究以HNSQ01為親本毒株，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建meq基因缺失毒株，以期為后續新型高效的MD疫苗創制奠定重要基礎。

1" 材料與方法

1.1" 細胞和病毒

雞胚成纖維細胞（chicken embryo fibroblast，CEF），用9～10日齡SPF雞胚制備，SPF種蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。HV-MDV變異株HNSQ01［5］，此前分離鑒定并保存于液氮。從液氮中取出HNSQ01，在6孔板CEF單層上連續傳代，每隔3～4 d傳代一次，每隔5代保種一次，液氮凍存備用。其中，P6代用于動物攻毒試驗，P25代用于meq基因編輯。MDV的傳代培養及效價測定，均按此前報道進行［31］。

1.2" 主要試劑

M199 培養基、Opti-MEM培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），均購自Gibco公司；TPB（tryptone phosphate broth）培養基，購自BD公司；0.25% Trypsin-EDTA （1×） 胰蛋白酶消化液、無血清細胞凍存液、青鏈霉素雙抗，均購自新賽美公司；蛋白酶K溶液（10 mg·mL-1）、1 mol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol·L-1 EDTA 溶液（pH 8.0），均購自 Solarbio 公司；Ex Taq DNA聚合酶、DH5α感受態、DNA膠回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；BbsⅠ-HF限制性內切酶和T4 DNA連接酶，均購自NEB公司；DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG和DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG，均購自Abbkine公司；質粒提取試劑盒Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ，購自Omega公司；轉染試劑Trans IT-X2TM Dynamic Delivery System，購自Mirusbio 公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，購自TIANGEN公司；FastStart Universal SYBR Green MasterBak，購自ROCHE公司。鼠源抗MDV-pp38單抗31G7和MDV-Meq單抗8G11-B2由此前制備保存［29-30］。

1.3" 質粒和引物

pMD18T-gB、pMD18T-OVO質粒和pX459-gR-F3/pX459-gR-R2質粒，均為此前制備保存［25，28，31］；根據MDV標準毒株GX0101的基因組（GenBank Acc. No. JX844666.1）設計引物，用于meq基因編輯PCR檢測的引物對meq-9F/meq-2R、用于測定MDV和宿主基因拷貝數的qPCR引物對yg-gB-F/yg-gB-R和yg-OVO-F/yg-OVO-R、用于MDV基因相對表達水平分析的逆轉錄-熒光定量PCR（RT-qPCR）引物對gB-F/gB-R、meq-F/meq-R、pp38-F/pp38-R、RLORF4-F/RLORF4-R以及RLORF5a-F/RLORF5a-R，如表1列示，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4" 實驗動物

1日齡SPF雞，購自北京勃林格殷格瀚維通生物技術有限公司，于正壓隔離器中飼養。動物實驗方案經河南省農業科學院動物疫病防控研究所動物倫理審查委員會審核批準（批準文號：LLSC41023016）。

1.5" pX459-gRNA質粒轉染及病毒感染

提前1 d于24孔板中制備好CEF單層，按照Trans IT-X2TM Dynamic Delivery System（Mirusbio，美國）說明書操作，取pX459-gR-F3和pX459-gR-R2質粒，等量混合后分別共轉染4孔CEF單層（500 ng·孔-1），38.5℃、5% CO2培養箱中培養24 h，然后分別接種不同劑量（50、100、150和200 μL）親本毒株HNSQ01（p25代，病毒效價為15 257 PFU·100 μL-1）。設置兩個未轉染質粒的對照孔，其中一孔接種100 μL的HNSQ01病毒液作為MDV感染陽性對照，另一孔不接種病毒作為CEF陰性對照，置38.5℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h，然后消化CEF取樣進行PCR鑒定。

1.6" PCR 分析及病毒克隆純化

上述樣品，每孔各取出一半病毒/細胞混懸液，提取總DNA進行PCR鑒定，并用1％瓊脂凝膠電泳進行分析。選取PCR擴增顯示基因編輯剪切效率較高的樣品孔的另一半病毒/細胞混懸液，進行連續有限稀釋，分別轉接到已鋪滿CEF單層的6孔板4～6個細胞孔中，置培養箱中培養3～5 d。顯微操作挑取MDV單噬斑，逐個轉接到24孔板CEF單層上（1個·孔-1），同上培養48 h，然后消化細胞取樣，同上進行PCR鑒定分析。根據PCR鑒定結果，連續進行2～3輪的病毒單噬斑克隆純化，直至PCR鑒定及DNA測序分析證實獲得完全純化的meq基因缺失病毒克隆。將其擴大培養并收集凍存，測定病毒效價后置于液氮中備用。同時，將meq基因缺失毒株連續傳代15代，分別收集第1～5、10、15代病毒樣品，進行PCR分析鑒定毒株的傳代穩定性。

1.7" 間接免疫熒光試驗（IFA）

從液氮中取出HNSQ01及其meq基因缺失毒株，分別接種CEF單層并培養3～4 d，待觀察到病毒噬斑形成后，根據此前報道的方法［29-30］，固定并封閉細胞，依次孵育MDV-pp38單抗31G7（1∶50 000）、DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG（1∶1 000）、MDV-meq單抗8G11-B2（1∶2 000）以及DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG（1∶1 000），進行IFA染色。最后置于熒光顯微鏡（ZEISS公司，德國）下觀察結果。

1.8" 逆轉錄-熒光定量PCR（RT-qPCR）

用HNSQ01及其meq基因缺失毒株分別感染CEF單層，待形成典型病毒噬斑后消化離心收集細胞，用TRIzol試劑提取細胞/病毒總RNA然后逆轉錄制備cDNA。按照此前報道的qPCR方法［24，32-33］，以cDNA為模板、ICP4為內參，利用SYBR GreenⅠRT-qPCR 法分別檢測MDV基因gB、meq、pp38、RLORF4以及RLORF5a的相對轉錄水平。每個試驗均設置三個獨立重復。

1.9" 病毒增殖曲線測定

取HNSQ01及其meq基因缺失毒株，分別接種6孔板CEF單層（100 PFU·孔-1）。病毒感染24、48、72、96和120 h后，分別消化收集細胞，液氮凍存備用。將上述各時間點的病毒感染細胞各取一半，按此前報道進行MDV的PFU效價測定［31］；另外一半病毒感染細胞樣品，用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，分別提取細胞/病毒總DNA，并用NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher公司、美國）測定濃度后備用。取pMD18T-gB和pMD18T-OVO標準質粒，將其分別進行10倍比稀釋建立qPCR標準曲線。通過SYBR GreenⅠPCR測定上述樣品中MDV gB基因的拷貝數，再根據公式計算gB基因的拷貝數/（×106細胞）。上述每個試驗均設置三個獨立重復。

1.10" 動物攻毒試驗

1日齡SPF雞75只，隨機分為3組，包括CEF陰性對照組（34只）、HNSQ01攻毒組（27只）和meq基因缺失毒株攻毒組（26只），分別置正壓隔離器內正常飼養。1日齡時，攻毒組分別腹腔注射HNSQ01（P6代）或meq基因缺失毒株（P50代）感染的CEF懸液2 000 PFU·（200 μL·只）-1；陰性對照組腹腔注射等體積的CEF懸液。攻毒后每日觀察各組的臨床癥狀、發病及死亡情況，病死雞進行剖檢并觀察腫瘤發生情況。攻毒后每間隔一周，每組各取5只雞稱重。感染后第14和21天，每組各取4只雞安樂死，采集胸腺、法氏囊和脾稱重，記錄并計算免疫器官指數。計算公式：免疫器官指數=［免疫器官重量（g）/體重（g）］×100。至第77天整個試驗結束時，將所有存活雞進行安樂死、剖檢觀察內臟器官腫瘤發生情況，同時每組各取3只雞，采集肝和脾，送樣至武漢賽維爾生物科技有限公司制備組織切片，并進行HE染色，觀察組織病理變化情況。最終根據全程試驗記錄，統計各組的MD發病率、死亡率和肉眼腫瘤發生率，繪制各組試驗雞的存活曲線。

1.11" 數據統計分析

使用生物學軟件GraphPad Prism Version 9.5（GraphPad Software公司、美國），統計分析MDV基因相對表達水平、繪制病毒增殖曲線以及動物攻毒試驗存活曲線。使用生物學軟件SPSS 25.0（IBM公司、美國），統計分析動物攻毒試驗雞各組之間體重、免疫器官指數、MD發病率、死亡率以及腫瘤發生率的差異顯著性。以Plt;0.05檢驗各組之間差異是否具有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" meq基因編輯缺失毒株的構建及PCR鑒定

分別提取gRNA質粒轉染/病毒感染、陽性對照及陰性對照CEF總DNA并進行PCR擴增鑒定。電泳分析結果顯示，質粒未轉染/HNSQ01感染CEF中，僅擴增出約1 121 bp的meq基因野生型條帶；質粒轉染/不同劑量病毒感染CEF中，同時擴增出約1 121 bp的野生型條帶和約196 bp的meq基因編輯小條帶；陰性對照CEF未擴增出任何產物（圖1A）。將meq基因編輯小條帶切膠回收并純化克隆，DNA測序分析結果與預期完全相符。將上述基因編輯效率最高的病毒/細胞懸液進行有限稀釋，接種6孔板CEF單層，連續進行3輪病毒單噬斑的克隆純化及PCR鑒定，最終獲得一株meq基因完全編輯缺失的MDV毒株，命名為SQ01Δmeq（克隆號為C6-2-1）。將其進行連續傳代，PCR檢測結果顯示p1～ p15代次的子代病毒中，均只擴增出約196 bp的特異性條帶（圖1B），表明該毒株的meq基因被成功編輯缺失且未發生回復突變，傳代穩定性良好。

2.2" meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq的 IFA 鑒定

為了分析meq基因的編輯缺失是否影響MDV病毒噬斑的形成，以HNSQ01和SQ01Δmeq分別感染CEF單層，形成典型MDV噬斑后固定細胞，分別用MDV pp38和Meq蛋白特異性單抗進行IFA染色。結果顯示，兩個毒株感染的CEF細胞中，均可觀察到形態相似且綠色熒光特異性染色的MDV噬斑，說明pp38蛋白均正常表達；紅色熒光特異染色的Meq蛋白僅在HNSQ01病毒噬斑中正常表達，而在SQ01Δmeq病毒噬斑中均未見表達（圖2）。上述結果進一步證實SQ01Δmeq毒株的meq基因被完全編輯缺失，且其缺失不影響pp38蛋白的表達及病毒噬斑的形成。

2.3" meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq的基因表達及體外增殖

以 ICP4為內參基因，利用RT-qPCR分別檢測MDV gB、meq、pp38、RLORF4以及RLORF5a在HNSQ01和SQ01Δmeq感染CEF中的相對表達水平。結果顯示，與HNSQ01相比，除了未檢測到meq基因表達之外，其他基因如gB、pp38、RLORF4和RLORF5a在SQ01Δmeq感染CEF中均正常表達，且與親本毒株的表達水平無顯著性差異（Pgt;0.05）（圖3A）。分別收集HNSQ01和SQ01Δmeq感染的CEF并提取總DNA，用SYBR GreenⅠqPCR檢測病毒感染后不同時間點gB基因和宿主OVO基因拷貝數，繪制病毒體外增殖曲線。結果顯示，隨著感染時間增加病毒基因拷貝數也持續增加，且HNSQ01和SQ01Δmeq的增殖曲線基本相似（圖3B），在感染后24、48、72、96 以及120 h均無顯著性差異（P＞0.05）。利用IFA染色，對上述同批次樣品進行的PFU效價滴定結果，亦顯示HNSQ01和SQ01Δmeq具有相似的增殖曲線（圖3C），兩個毒株在任一時間點的病毒效價均無顯著差異（P＞0.05）。上述結果表明，meq基因的編輯缺失不影響所檢測基因的表達，也不影響SQ01Δmeq的體外復制能力。

2.4" SQ01Δmeq感染對SPF雞的生長及免疫器官的影響

分別用HNSQ01（p6代）和SQ01Δmeq（p50代）感染1日齡SPF雞，以CEF細胞為陰性對照，進行動物攻毒試驗，并于攻毒后每隔一周對試驗雞進行稱重。結果顯示（圖4A），除了最后兩周因HNSQ01攻毒雞全部死亡無法統計之外，自14 dpi到63 dpi的任一檢測時間點HNSQ01攻毒組與CEF陰性對照組之間試驗雞的體重均存在差異性顯著（Plt;0.05），同時HNSQ01組攻毒和SQ01Δmeq攻毒組之間也均存在顯著差異性，而SQ01Δmeq攻毒組與CEF陰性對照組之間均無顯著性差異（Pgt;0.05）。在攻毒后14 dpi和21 dpi，分別對各組雞的免疫器官指數進行分析。統計結果顯示（圖4B～D），HNSQ01攻毒組的胸腺指數、法氏囊指數和脾指數與CEF陰性對照組及SQ01Δmeq攻毒組均存在顯著性差異（Plt;0.05），而SQ01Δmeq攻毒組和CEF陰性組相比，除了在14 dpi時脾臟指數明顯偏高之外，其它時間點的免疫器官指數均無顯著差異（Pgt;0.05）。上述數據表明，meq基因的編輯缺失顯著消除了病毒對宿主產生的生長抑制和免疫抑制。

2.5" SQ01Δmeq感染對SPF雞的致病性及致瘤性

根據整個動物試驗77 d內的觀察記錄，首先扣除攻毒后一周內可能因應激反應導致早期死亡的雞只（CEF陰性對照、HNSQ01和SQ01Δmeq攻毒組分別為10、9和2只）和14 d、21 d安樂死的雞（8只·組-1），剩余雞納入有效統計數據，根據每日記錄的各組死亡數繪制存活曲線。結果發現，在整個試驗周期內CEF陰性對照組和SQ01Δmeq攻毒組試驗雞均未觀察到發病和死亡，而HNSQ01組自攻毒后第2周開始發病，此后陸續死亡，至64 dpi時全部死亡無存活（圖5）。對各組死亡雞和存活雞全部進行剖檢觀察，統計發現HNSQ01攻毒組的MD發病率為100%（10/10）、死亡率為100%（10/10）、肉眼觀察腫瘤發生率為80.0%（8/10），而CEF對照組和SQ01Δmeq攻毒組的上述指標均為0%（0/16和0/16）。試驗結束時每組隨機挑選3只雞的肝臟和脾臟進行病理組織學觀察，結果如圖6所示，HNSQ01攻毒組的肝臟和脾臟中均可觀察到典型的T淋巴細胞炎性侵潤和組織增生性腫瘤灶，MD腫瘤發生率為100%（3/3），而CEF陰性對照組和SQ01Δmeq攻毒組試驗雞的兩種內臟組織均無異常，腫瘤發生率均為0%（0/3）。

3" 討" 論

MD是人類史上第一個使用疫苗免疫成功預防的腫瘤病。自1970年HVT疫苗首次商品化應用于雞群，先后歷經了以不同血清型疫苗毒株研制MD單價疫苗的發展史（如HVT/MDV-3的FC-126、MDV-2的SB-1和MDV-1的CVI988），隨后二價疫苗、三價疫苗、基因缺失或插入的基因工程疫苗等也得以不斷研究和優化［20］。然而，MD疫苗在雞群中的長期使用，加速了MDV的持續進化，導致產生毒性更強的毒株［34］。近年來，全球各地不斷暴發MD疫情［35］。作為世界第一養禽大國，中國雞群MD的流行及暴發亦更加頻繁［6，34］。MD疫苗免疫雞群中vv+MDV和HV-MDV變異株的陸續報道，表明當前國內雞群流行的MDV毒力早已進化，并且最新研究證實此前廣泛使用的經典MD商品疫苗已不能對新出現的超強毒株或變異株起到良好免疫保護［5］。究其原因，很可能是由于現有MD疫苗的親本毒株均分離自20世紀70～80年代，在歷經數十年后，這些年代久遠的MD疫苗毒株無論是從遺傳距離上還是從病毒抗原性上，都難以為當前已發生進化和變異的MDV流行毒株提供良好的免疫保護［4-5］。

為了研制免疫原性更好的MD疫苗候選毒株，本研究選取從國內MD疫苗免疫發病雞群臨床病例中最新分離鑒定的毒力最強之一的HV-MDV變異株HNSQ01為親本毒株，首先將其在CEF上連續傳代，以降低其對宿主潛在的免疫抑制，然后利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建其meq基因缺失毒株并分析其對宿主的致病性和安全性，以期為后續研發具有自主知識產權的新型高效MD疫苗提供重要材料。通過一系列的試驗研究，如PCR擴增、電泳分析、病毒單噬斑克隆、純化鑒定以及DNA測序分析，最終獲得一株可穩定傳代且無回復突變的meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq（病毒克隆號C6-2-1）。進一步的IFA染色和RT-qPCR分析顯示，meq基因的編輯缺失沒有影響MDV噬斑形成及代表性MDV基因的表達。利用qPCR分析和PFU效價滴定，測定的病毒體外增殖曲線結果顯示，兩個毒株均具有相似的增殖曲線，表明meq基因的編輯缺失不影響其體外復制能力。雖然通過兩種方法檢測的病毒體外增殖曲線的變化趨勢不完全相同，這可能與前者可檢測到全部病毒總DNA而后者僅能檢測到有活性的病毒有關。更進一步的SPF雞攻毒試驗數據顯示，在持續77 d的整個試驗周期內，親本毒株HNSQ01攻毒雞至64 d時全部發病死亡，致病率和致死率均為100%，MD腫瘤發生率高達80%，這與此前期報道的結果基本一致［5］，而SQ01Δmeq攻毒雞和CEF模擬對照組在試驗全程均未見發病或死亡，存活雞剖檢中也未觀察到任何雞發生內臟腫瘤，并且最終對隨機挑選的雞的肝、脾組織進行病理切片和HE染色觀察，也未發現任何T淋巴細胞浸潤及腫瘤發生，這充分表明meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq對宿主沒有致病性和致瘤性，生物安全性良好。

同時，在攻毒后14 d和21 d對各組試驗雞免疫器官指數監測的結果也顯示，HNSQ01導致了感染雞嚴重的胸腺和法氏囊萎縮，并且脾明顯增大，三項免疫器官指數與SQ01Δmeq攻毒組和CEF陰性對照組均存在顯著性差異，而SQ01Δmeq攻毒組與CEF陰性對照組之間，除了脾稍有增大之外其他兩項免疫器官指數均無顯著性差異，這很可能與我們在meq基因編輯前后對HNSQ01在CEF上進行了連續傳代有關，有效消除了SQ01Δmeq對宿主潛在的免疫抑制性，與此前研究報道的結果相似［9，17］。此外，整個試驗過程中SQ01Δmeq攻毒雞生長狀況良好且體重增加正常，與HNSQ01嚴重影響雞體重增加形成了鮮明的對比。上述試驗數據充分說明，meq基因的編輯缺失完全消除了HV-MDV變異株HNSQ01的對宿主的免疫抑制性、致病性和致瘤性。下一步，非常有必要盡快開展SQ01Δmeq對其親本毒株以及其它vv+MDV和HV-MDV變異株的免疫攻毒保護試驗，并且同時與其他MD商品疫苗尤其是最新研發的meq基因缺失疫苗進行對比試驗，以評估其商業應用前景。綜上所述，本文以HV-MDV變異株為親本毒株，建立了meq基因編輯缺失毒株SQ01Δmeq，為具有自主知識產權的新型高效MD疫苗的設計和創制奠定了重要基礎。

4" 結" 論

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，本文以HV-MDV變異株HNSQ01為親本毒株成功構建了一個穩定傳代的meq基因缺失毒株并命名為SQ01Δmeq。相關研究結果表明，meq基因的編輯缺失未影響SQ01Δmeq的體外復制、噬斑形成及其它病毒基因的正常表達，對宿主雞無致病性和致瘤性，且不會引起免疫器官萎縮，生物安全性良好，為后續創制新型高效的MD疫苗奠定了重要基礎。

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（編輯" 白永平）