KLF9水平、mtDNA拷貝數與惡性膠質瘤的關系

摘要目的：探討Krüppel樣因子9（KLF9）水平及線粒體DNA（mtDNA）拷貝數與惡性膠質瘤發生發展的潛在聯系。方法：選取2020年6月—2022年12月本院神經外科收治的膠質母細胞瘤（GBM）病人28例作為研究對象，留取腦膠質瘤標本；另選擇同期因腦外傷而行顱骨減壓術病人10例作為對照組，并留取其非癌腦組織。采用在線數據庫基因表達譜交互式平臺分析KLF9在膠質瘤組織和正常組織中的表達。采用GSE16011數據集進行基因表達、相關性和生存分析。人神經膠質瘤細胞系U87轉染KLF9siRNA和陰性對照（si-NC）以及pcDNA-KLF9和陰性載體（Vector）。分別對細胞mtDNA拷貝數、活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）進行測量。結果：與正常組織相比，KLF9在低級別膠質瘤（LGG）和GBM腫瘤組織中的表達水平更高。KLF9水平較高的LGG和GBM病人生存期較短。此外，GBM表達的KLF9水平明顯高于LGG。與非癌腦組織相比，GBM組織中KLF9免疫反應分數增加（P＜0.05）。在GBM的GSE16011數據集中，單變量和多變量分析顯示，KLF9具有顯著的GBM預后價值。與si-NC相比，si-KLF9降低了U87細胞中線粒體膜蛋白的水平［包括前序列轉位酶23（Tim23）、線粒體外膜20易位酶（Tom20）、細胞色素C氧化酶Ⅳ亞型（COX Ⅳ）］，顯著減少了mtDNA拷貝數。與Con組相比，FCCP＋si-NC組細胞ATP水平、線粒體膜電位（MMP）水平降低（P＜0.05），ROS水平增加（P＜0.05）。與FCCP＋si-NC組相比，FCCP＋si-KLF9組細胞ATP、MMP和ROS水平降低（P＜0.05）。結論：高水平的KLF9與GBM病人的低存活率相關。KLF9可調節膠質母細胞瘤細胞中的線粒體穩態和線粒體吞噬。

關鍵詞惡性膠質瘤；Krüppel樣因子9；線粒體DNA；線粒體穩態；預后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.033

惡性膠質瘤是中樞神經系統中常見的、致命性腫瘤，病人的預后較差，其中膠質母細胞瘤（glioblastomas，GBM）病人的中位生存期僅為16個月［1］。目前，尚無惡性膠質瘤有效的預后或治療靶點，因此，探索功能性腫瘤相關基因不僅可發現神經膠質瘤進展的新機制，還可識別治療干預的可能靶點。Krüppel樣因子（Krüppel-like factor，KLF）成員包括KLFs1-17，是含鋅指結構的轉錄因子，在細胞的分化和發育調節及惡性腫瘤的生物學發展過程中起著至關重要的作用［2］。研究表明，KLF轉錄因子在不同的細胞背景下充當癌基因和/或腫瘤抑制因子［3］。研究發現，KLF9可調節孕酮反應啟動子的反式激活，并在多種癌組織中異常表達，表明KLF9上調可能與癌癥發展有關［4-5］。因此，更好地理解KLF9在膠質瘤進展中的表達模式和生物學作用可能為尋找治療干預的新靶點提供線索。KLF9可通過結合基因啟動子區富含GC的DNA序列來調節致癌或腫瘤抑制基因，從而在腫瘤發生中發揮重要作用［6］。線粒體是代謝穩態的基礎［7］。線粒體功能由各種線粒體生物發生基因調節，這些基因控制線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）的復制和線粒體編碼蛋白的轉錄，mtDNA拷貝數的改變可影響氧化磷酸化和能量代謝，導致GBM中的線粒體功能障礙，并且高mtDNA與GBM的不良預后和治療抵抗相關［7-8］。研究發現，KLF9可通過驅動mtDNA拷貝數上調減輕布比卡因神經毒性［9］。因此，本研究探討KLF9水平及mtDNA拷貝數與惡性膠質瘤的潛在聯系。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2020年6月—2022年12月本院神經外科收治的GBM病人28例作為研究對象，其中，男15例，女13例，年齡15～64（50.14±13.08）歲。所有病人均為首次診斷，即術前無化療或放療治療史。留取腦膠質瘤標本，所有標本均經病理證實，并保存于－80 ℃，根據世界衛生組織（WHO）神經系統腫瘤分類標準（2016年修訂版）［10］，本研究28例標本均為高度膠質瘤（Ⅲ級或Ⅳ級）。另選擇同期因腦外傷而行顱骨減壓術病人10例作為對照組，并留取其非癌腦組織。本研究經醫院醫學倫理委員會批準（倫理編號：2019-12），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2免疫組化SP法檢測非癌腦組織和腦膠質瘤組織中KLF9蛋白水平

石蠟包埋的組織切片在60 ℃的烘箱中烘烤15 min，用3%的過氧化氫封閉內源過氧化物酶10 min。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后，將切片浸入pH＝6.0的檸檬酸緩沖液中，接受微波抗原熱修復10 min，然后在室溫下冷卻。為了避免非特異性染色，用正常山羊血清處理切片，然后在4 ℃下用抗KLF9抗體（1∶100稀釋，美國Abcam公司）孵育過夜。PBS洗滌載玻片3次，每次3 min；施加第二抗體并在室溫下孵育1 h。再用PBS洗滌3次，每次3 min，加入DAB顯色劑并孵育5～10 min，在顯微鏡下控制顯色時間，并用蒸餾水沖洗終止反應。在蘇木精重新染色并用蒸餾水充分沖洗后，使用1%乙醇-鹽酸進行區分，隨后用蒸餾水再次徹底沖洗。常規脫水、二甲苯處理、中性樹脂固定后，在顯微鏡下觀察細胞染色。

兩名有經驗的病理學家獨立評估陽性腫瘤細胞的百分比及其染色強度。KLF9蛋白的表達被定義為細胞質中的棕黃色染色。在顯微鏡下（×400）隨機選擇5個視野，并計算免疫反應得分。KLF9染色強度分數分配如下：陰性（0分）、弱（1分）、中等（2分）和強（3分）。陽性腫瘤細胞百分比的分數確定如下：0%～25%計1分、26%～50%計2分、51%～75%計3分和76%～100%計4分。每個切片的免疫反應得分為染色強度得分和腫瘤細胞百分比得分的乘積。

1.3生物信息學分析

采用在線數據庫基因表達譜交互式分析平臺（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析KLF9在膠質瘤組織和正常組織中的表達。采用GSE16011數據集進行基因表達、相關性和生存分析。

1.4蛋白免疫印跡法

使用放射免疫沉淀檢測緩沖液（上海Beyotime公司）提取總細胞蛋白樣品，并用Bradford蛋白質測定試劑盒（上海Beyotime公司）測量蛋白濃度。蛋白樣品通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上（美國Pall公司）。用5%脫脂乳封閉膜，然后用特異性針對前序列轉位酶23（Tim23，1∶1 000，美國Proteintech 公司）、KLF9（1∶1 000，美國Abcam公司）、線粒體外膜20易位酶（Tom20，1∶1 000，美國CST公司）、細胞色素C氧化酶Ⅳ亞型（COX Ⅳ，1∶1 000，美國Proteintech公司）或抗內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1∶1 000，美國Proteintech公司）在室溫下反應1 h，并用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）洗滌4次，每次15 min。通過Tanon高信號增強化學發光法（ECL）蛋白質印跡基質（中國Tanon公司）在iBrightcl 750成像系統（美國Invitrogen公司）顯現蛋白條帶。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測KLF9 mRNA的表達

采用TRIzol溶液分離100 mg冷凍樣品的總RNA，然后合成cDNA。以cDNA為模板進行聚合酶鏈式反應（PCR）。PCR反應條件為，95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環；隨后在72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產物通過ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統成像，并通過Image LabTM 5.2.1軟件分析。通過目標條帶和內部參考條帶之間的累積光密度的比率來確定KLF9 mRNA的表達。RT-PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成。目的基因KLF9正向引物為5′-ATATCCTCTTGACAATTGCT-3′，反向引物為5′-GAATGATCCACATGTCTCG-3′，預期條帶為320 bp。GAPDH正向引物為5′-TGGGACGACATGGAGAAAA-3′，反向引物為5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′，其擴增片段長度為567 bp。

1.6細胞培養

人星形膠質細胞（HA）、人神經膠質瘤細胞系（LN229、U87）、GBM病人來源的細胞系N33購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）。HA在星形膠質細胞培養基（美國Gibco公司）中培養。LN229、U87在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基（美國Gibco公司）中培養。N33在含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12（美國Gibco公司）中培養。所有細胞都在37 ℃和5%CO2下培養。

1.7轉染和慢病毒生產

KLF9 siRNA si-KLF9和陰性對照（si-NC）由上海GenePharma公司合成。pcDNA-KLF9和陰性載體（Vector）由湖南Youbio公司構建。通過lipofectamine 3000（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行細胞轉染。

1.8mtDNA含量的測量

使用TIANamp基因組DNA試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］從U87細胞中提取基因組DNA。使用線粒體16S rRNA基因、tRNA基因和核β2M基因的引物，通過RT-PCR測定相對mtDNA拷貝數。使用qTOWER 2.0實時PCR熱循環儀（美國 Analytik Jena 公司）在10 μL體積中進行PCR擴增，該體積包含25 nmol/L的引物、5 μL SYBR Green PCR主混合物和10 ng DNA作為模板。引物如下：16S rRNA正向引物為5′-GGTGCAGCCGCTATTAAGG-3′，反向引物為5′-ATCATTTACGGGGAAGGCG-3′；tRNA正向引物為5′-CACCCAGAACAGGGTTTGT-3′，反向引物為5′-TGGCCATGGGTATGTTTA-3′；β2M正向引物為5′-TCGTGTCTCCATGTTTGATGTATCT-3′，反向引物為5′-TCTCTGCTCCCACCTCTAAGT-3′。

1.9細胞活性氧（ROS）測量

采用紅色熒光ROS檢測試劑盒（蘇州優逸蘭迪生物科技有限公司）測定細胞ROS。在標準培養條件下，將U87細胞接種在96孔板中。用PBS洗滌細胞后，將細胞與20 μmol/L DHE溶液在37 ℃孵育15 min，然后用PBS洗滌細胞2次。使用流式細胞儀監測ROS產生。

1.10定量ATP分析

通過線粒體膜和基質蛋白的降解，可以在生物化學上監測有絲分裂。FCCP是線粒體氧化磷酸化的有效解偶聯劑，通常用于誘導線粒體吞噬。將U87細胞分為對照（Con）組、FCCP＋si-NC組、FCCP＋si-KLF9組。Con組加入空白試劑處理細胞，FCCP＋si-NC組、FCCP＋si-KLF9組加入FCCP試劑處理細胞。

采用增強型ATP檢測試劑盒（上海Beyotime公司）檢測細胞ATP水平。在6孔板中培養U87細胞，并用10 μmol/L FCCP（美國Sigma公司）處理用si-NC或si-KLF9穩定轉染的U87細胞12 h。在ATP裂解緩沖液中收獲細胞，在4 ℃下以13 000×g離心5 min。收集上清液并轉移至新試管中。將20 μL上清液和100 μL ATP測定工作液加入平底黑色96孔板中。使用光度計微量滴定板讀數器監測細胞ATP。

1.11線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）

根據線粒體膜電位檢測試劑盒（美國sigma公司）的使用方法，使用JC-1作為熒光探針快速檢測HT22細胞中的MMP。通過熒光顯微鏡捕獲熒光，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行數字化。

1.12統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用不成對t檢驗或單向方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1KLF9在GBM中上調并與不良預后的相關性

通過GEPIA平臺的數據分析KLF9在低級別膠質母細胞瘤（LGG，WHOⅡ級）和高級別膠質母細胞瘤（GBM，WHOⅢ級或Ⅳ級）中的表達水平。與正常組織相比，KLF9在LGG和GBM腫瘤組織中的表達水平更高（見圖1）。總體存活率和無病存活率分析顯示，KLF9水平較高的LGG和GBM病人生存期較短（見圖2、圖3）。此外，GBM表達的KLF9水平明顯高于LGG（見圖4）。KLF9的高水平與神經膠質瘤病人的低存活率相關，表明KLF9是預后的潛在生物標志物。

2.2KLF9蛋白在非癌腦組織和GBM組織中的表達

免疫組織化學染色結果顯示，陽性染色的KLF9蛋白有細小的棕黃色顆粒，位于膠質瘤的細胞質中。與非癌腦組織相比，GBM組織中KLF9免疫反應得分顯著增加（P＜0.05）。詳見圖5、圖6。同時，免疫印跡法證實了GBM組織中KLF9蛋白表達高于非癌腦組織（見圖7）。GBM細胞系（U87細胞）和來自GBM病人的N33細胞中的KLF9蛋白表達水平也高于人星形膠質細胞HA中的KLF9蛋白表達水平（見圖8）。

2.3GBM病人KLF9表達與臨床病理特征的關系

在GBM的GSE16011數據集中，37例KLF9的Z分數≤0（低表達）和71例KLF9的Z分數＞0（高表達）。單變量和多變量分析顯示，與關鍵臨床特征結合時，KLF9具有顯著的GBM預后價值。詳見表1。

2.4KLF9調節線粒體穩態

KLF9在控制線粒體質量中發揮關鍵作用，本研究進一步考察KLF9是否也參與調節線粒體穩態。使用KLF9 siRNA（si-KLF9）的瞬時轉染有效地敲低了U87細胞中內源性KLF9的表達（見圖9）。免疫印跡顯示，與si-NC相比，si-KLF9降低了U87細胞中線粒體膜蛋白的水平，包括Tim23、Tom20和COX Ⅳ（見圖10）。本研究測定了tRNA和16S rRNA的mtDNA基因的含量，si-KLF9顯著減少了mtDNA拷貝數（見圖11）。在U87細胞中過表達KLF9，并分析其對線粒體膜蛋白表達的影響（見圖12）。然而，免疫印跡顯示KLF9過表達對U87細胞中Tim23、Tom20和COX Ⅳ表達沒有明顯影響（見圖13）。這些結果表明，KLF9可能調節線粒體穩態。

2.5KLF9防止線粒體解偶聯劑誘導的有絲分裂

免疫印跡顯示，si-KLF9對內源性KLF9的敲低促進了FCCP誘導的線粒體內外膜蛋白的降解（見圖14）。與Con組相比，FCCP＋si-NC組細胞ATP、MMP水平降低（P＜0.05），ROS水平增加（P＜0.05）。與FCCP＋si-NC組相比，FCCP＋si-KLF9組細胞ATP、MMP和ROS水平降低（P＜0.05）。詳見圖15～圖19。

3討論

本研究發現，KLF9在膠質瘤中表達上調，并與GBM病人的不良預后相關。KLF9是線粒體穩態的負調節因子，KLF9的沉默促進線粒體解偶聯劑誘導的線粒體吞噬。線粒體吞噬在控制線粒體穩態中發揮至關重要的作用，線粒體吞噬的損傷導致線粒體功能的下降，是癌癥的標志。因此，本研究提出KLF9介導的對線粒體吞噬的抑制可能有助于神經膠質瘤中線粒體穩態的喪失和腫瘤的發展。

近年來，KLFs作為重要的致癌調節因子出現，在不同的細胞背景下作為癌基因和/或腫瘤抑制因子發揮作用［11］。值得注意的是，研究發現KLF9與視網膜神經節細胞中的神經突生長有關［12］，表明KLF9在神經癌癥中可能具有腫瘤促進作用。然而，KLF9在膠質瘤進展中的作用和機制仍不清楚。本研究證明含有鋅指的轉錄因子KLF9在神經膠質瘤中具有重要的腫瘤誘導作用。首先，本研究發現KLF9在LGG和GBM中均上調，高分級腫瘤組織比低分級腫瘤組織表達更多的KLF9。高水平的KLF9與原發性和復發性膠質瘤病人的低存活率相關，表明KLF9可以作為膠質瘤不良預后的新的生物標志物。此外，本研究觀察到KLF9表達在體外培養的細胞系和臨床樣本中均上調。因此，不僅表明KLF9在神經膠質瘤中作為腫瘤誘導因子發揮作用，而且也支持KLF9失調與人類癌癥有關的觀點。

mtDNA是一種環狀的高拷貝數DNA［8］。除了作為細胞通過氧化磷酸化產生ATP的能量來源，線粒體在鈣穩態、脂肪酸氧化、ROS的合成、凋亡、細胞周期和增殖等過程中的作用也至關重要。因此，線粒體活性的破壞與多種疾病有關，包括癌癥［6］。此外，mtDNA通過一種稱為類核的核蛋白復合物與線粒體內膜相關聯［13］。mtDNA突變的累積導致線粒體功能障礙，這在GBM發病機制中起著重要作用，有利于異常的能量和ROS產生以及對凋亡和化療藥物的抵抗［7］。研究發現，KLF9通過增加氧化應激加重心肌細胞缺血性損傷［14］。本研究發現，KLF9敲低降低了U87細胞中線粒體膜蛋白的水平，包括Tim23、Tom20和COX Ⅳ，并減少了mtDNA拷貝數。這些結果表明，KLF9可能能夠調節線粒體穩態。

線粒體體內平衡通過線粒體生物發生和線粒體選擇性自噬（線粒體吞噬）的適當平衡來維持［15］。必須去除受損或功能障礙的線粒體以維持線粒體質量和能量供應。線粒體吞噬在清除線粒體和恢復細胞穩態中起著至關重要的作用。線粒體吞噬的失調導致功能障礙的線粒體網絡的積累和臨床疾病的異質性集合，如癌癥和神經退行性疾病［15］。自噬誘導是抗神經膠質瘤治療的標志性效果之一，通過自噬調節劑靶向線粒體動力學可能是一種潛在的治療策略［16］。研究報道，自噬相關的基因在神經膠質瘤病人中具有預后潛力，并可能在神經膠質瘤生物學中發揮關鍵作用［17］。本研究結果顯示，KLF9負調節GBM細胞中線粒體穩態和線粒體解偶聯劑誘導的線粒體吞噬。KLF9介導對線粒體吞噬的抑制可能有助于神經膠質瘤中線粒體穩態的喪失和腫瘤的發展。

綜上所述，本研究使用公開的神經膠質瘤數據庫揭示了KLF9在非癌腦組織和腦膠質瘤中表達的差異，特別是在GBM中。高水平的KLF9與GBM病人的低存活率相關。KLF9調節GBM細胞中的線粒體穩態。敲除KLF9降低線粒體膜蛋白水平和mtDNA拷貝數，并促進線粒體解偶聯劑誘導的線粒體吞噬。因此，KLF9可作為預測膠質瘤預后的分子標志物，也可作為基因治療的潛在靶點。

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（收稿日期：2023-05-06）

（本文編輯鄒麗）