miR-107對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞系CAL27增殖、侵襲及遷移的影響

摘要：目的 探討miR-107在口腔鱗癌細(xì)胞系CAL27中的表達(dá)及其對(duì)CAL27細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-107在口腔鱗癌細(xì)胞株CAL27和人口腔上皮細(xì)胞HOEC細(xì)胞中的表達(dá)情況；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-107 mimic和miR-107 NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入CAL27細(xì)胞，并分為對(duì)照（miR-107 NC）組和miR-107過表達(dá)（miR-107 mimic）組；MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果 CAL27細(xì)胞系中miR-107的表達(dá)低于HOEC細(xì)胞。miR-107 mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 光密度（OD）值均低于miR-107 NC組，凋亡細(xì)胞比例高于miR-107 NC組，而侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)少于miR-107 NC組（P＜0.05）。結(jié)論 上調(diào)miR-107可抑制CAL27細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)其凋亡。

關(guān)鍵詞：口腔腫瘤；RNA干擾療法；細(xì)胞增殖；腫瘤浸潤(rùn)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；miR-107

中圖分類號(hào)：R739.85 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240259

Effects of miR-107 on proliferation， invasion and migration of CAL27 cells in"oral squamous cell carcinoma

ZHANG Jinwei1， WANG Yan2， WANG Tong3△

1 Department of Stomatology， Branch of Tianjin Third Central Hospital， Tianjin 300250， China; 2 Department of"Rehabilitation， the Worker’s Sanatorium Hospital of Ningxia; 3 Department of Stomatology， Tianjin First Central Hosptial△Corresponding Author E-mail： wt990308@126.com

Abstract： Objective To investigate the expression miR-107 in oral squamous cell carcinoma CAL27 cell line and its effect on the proliferation， apoptosis， invasion and migration of CAL27 cells. Methods The expression of miR-107 CAL27 cell line and human oral epithelial HOEC cells were detected by real-time quantitative fluorescent PCR （qRT-PCR）. MiR-107 mimic and miR-107 NC plasmid were transfected into CAL27 cells using liposome transfection method， and cells were divided into two groups， the miR-107 NC group used as a control group and the miR-107 mimic group used as a miR-107-overexpressed group. MTT cell proliferation assay was used to detect cell proliferation. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Transwell chamber assay was used to detect cell migration and invasion. Results The expression of miR-107 was lower in CAL27 cell line than that in HOEC cells. OD values of the miR-107 mimic group were lower than those of the miR-107 NC group at the time of 24， 48 and 72 h after transfection. The proportion of apoptotic cells was higher in the miR-107 mimic group than that of the miR-107 NC group， while the number of invasion and migration cells was lower than that of the miR-107 NC group （P＜0.05）. Conclusion Up-regulation of miR-107 can inhibit proliferation， invasion and migration of CAL27 cells.

Key words： mouth neoplasms; RNAi therapeutics; cell proliferation; neoplasm invasiveness; cell movement; miR-107

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是較為常見的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)生于口腔黏膜上皮，吸煙或者飲酒者發(fā)病率較高［1］。目前，盡管手術(shù)治療日趨成熟，西妥昔單抗靶向治療和程序性死亡受體1（PD-1）等免疫療法［2-3］也不斷涌現(xiàn)，但OSCC的5年生存率仍僅為50%左右。此外，OSCC進(jìn)展迅速，患者確診時(shí)多已處于局部晚期并約有60%的患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，生存率顯著降低，預(yù)后較差［4-5］。微小RNA（miRNA）是一種由18～24個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA，通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)（UTRs）作用，觸發(fā)mRNA的降解或翻譯抑制。miRNA的失調(diào)在多種生理、生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，OSCC患者較健康者表達(dá)上調(diào)的miRNA有miR-21、miR-155、miR-184、miR-211等，下調(diào)的有miR-125、miR-137、miR-145、miR-375等，這些miRNA參與OSCC細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲［6］。因此，筆者推測(cè)OSCC相關(guān)特異性的miRNA可以用于早期診斷，對(duì)OSCC的分期以及OSCC的預(yù)后判斷可發(fā)揮作用。其中，miR-107是一種非編碼微小RNA，其在胃癌、肺癌等多種癌癥中作為抑癌因子發(fā)揮作用［7-8］，但關(guān)于miR-107在OSCC中作用的相關(guān)報(bào)道較少。Na等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR-107可以靶定TRIAP1，從而在口腔鱗癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。本研究旨在探討miR-107在口腔鱗癌細(xì)胞系CAL27中的表達(dá)及其對(duì)CAL27細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 口腔鱗癌細(xì)胞系CAL27及人口腔上皮細(xì)胞HOEC細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司），胰蛋白酶（HyClone公司），PCR試劑盒（Takara公司），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol（Invitrogen公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Beyotime公司），miR-107引物及miR-107 NC/mimic質(zhì)粒合成（蘇州金唯智公司），噻唑藍(lán)MTT試劑盒（Sigma公司），Transwell小室（Corning公司），二甲基亞砜（DMSO，Beyotime公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 CAL27及HOEC細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。5%CO2、37 ℃、70%～80%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%后傳代并分為對(duì)照（miR-107 NC）組和miR-107過表達(dá)（miR-107 mimic）組。在轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于6孔板中，按照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染，將4 μg miR-107 NC質(zhì)粒或miR-107 mimic質(zhì)粒與10 μL脂質(zhì)體混合后加入無血清培養(yǎng)基，靜置20 min后置入6孔板繼續(xù)培養(yǎng)6 h，再更換為含血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-107表達(dá) 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR。miR-107引物序列：上游5'-AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3'，下游5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；U6序列：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3'。反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR premix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free H2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算miR-107相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后制成2×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)染后以每孔100 μL接種于96孔板，37 ℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后去除培養(yǎng)液，每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，去除培養(yǎng)液并于每孔加入DMSO 100 μL，充分溶解藍(lán)紫色沉淀物，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的光密度（OD）值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 胰酶消化2組轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入200 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC以及10 μL碘化丙啶染色液進(jìn)行雙重染色，室溫避光條件下孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，上室加入每孔含2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液過夜培養(yǎng)。行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)需提前將Matrigel膠置于4 ℃冰箱中過夜后以無血清培養(yǎng)基稀釋至300 μL/L，取100 μL稀釋液均勻地涂抹一層在小室的PET膜上，置于24孔板、37 ℃溫箱內(nèi)放置3 h后取出，在超凈工作臺(tái)過夜干燥24 h，于24孔板中和上室加入4%多聚甲醛，4 ℃固定30 min，風(fēng)干小室后，0.1%結(jié)晶紫室溫染色5 min，洗凈表面的結(jié)晶紫，棉簽擦掉上層未遷移的細(xì)胞。顯微鏡下對(duì)非細(xì)胞接種側(cè)拍照，記錄遷移或侵襲的細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[[x] ±s]表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-107在口腔鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá) 口腔鱗癌細(xì)胞CAL27 miR-107的相對(duì)表達(dá)水平低于人口腔上皮細(xì)胞HOEC細(xì)胞（0.64±0.09 vs. 1.01±0.15；n=3，t=3.712，P＜0.05）。

2.2 2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后增殖能力比較 miR-107 mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48、72 h OD值均低于miR-107 NC組（P＜0.01），見表1。

2.3 2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后凋亡率比較 miR-107 mimic組凋亡的細(xì)胞比例高于miR-107 NC組（12.24%±0.03% vs. 4.01%±0.15%；n=3，t=96.291，P＜0.01），見圖1。

2.4 2組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較 miR-107 mimic組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)目少于miR-107 NC組（P＜0.01），見圖2、表2。

3 討論

鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是OSCC患者死亡的主要原因之一［10］。隨著科學(xué)的發(fā)展，miRNA這一小分子的非編碼RNA越來越受到人們關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)之一，miR-107在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。Sharma等［11］研究顯示，miR-107在73%的食管癌組織中與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFRL1）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且在食管鱗癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-107可顯著降低FGFRL1 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞產(chǎn)生。Zhang等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-107在食管鱗癌組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)且其可以靶向負(fù)調(diào)控原肌球蛋白3（TPM3），進(jìn)而抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用。在口腔癌領(lǐng)域中，Na等［9］研究證實(shí)，miR-107在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)較正常細(xì)胞系明顯降低，可以靶向降低凋亡抑制劑1（TRIAP1）的表達(dá)，從而抑制OSCC細(xì)胞的增殖和遷移。本研究亦發(fā)現(xiàn)OSCC細(xì)胞CAL27中miR-107的表達(dá)低于人口腔上皮細(xì)胞HOEC，提示miR-107在OSCC中呈低表達(dá)狀態(tài)。轉(zhuǎn)染miR-107 mimic質(zhì)粒至CAL27細(xì)胞，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-107可以抑制CAL27細(xì)胞的增殖能力，這與Na等［9］研究結(jié)果一致，且筆者的研究還發(fā)現(xiàn)miR-107可促進(jìn)CAL27細(xì)胞凋亡，并抑制其侵襲和遷移，再次證實(shí)了miR-107在OSCC細(xì)胞中發(fā)揮了抑瘤作用。

綜上所述，miR-107在口腔癌的發(fā)病過程中發(fā)揮了抑癌作用，后續(xù)將進(jìn)行組織學(xué)及動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-107在口腔鱗癌中的作用和相關(guān)信號(hào)機(jī)制，探討其作為口腔癌早期診斷標(biāo)志物的可能性。

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（2024-03-05收稿 2024-05-15修回）

（本文編輯 陸榮展）