CD1a⁺和CD83⁺樹突狀細胞在COPD小鼠肺組織中的分布及意義

摘要：目的 研究CD1a和CD83陽性樹突狀細胞（DC）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠肺組織中的分布及意義。方法 將20只C57BL/6小鼠采用隨機數字表法分為空氣對照組和煙熏COPD組，各10例。空氣對照組暴露于空氣中；煙熏COPD組使用香煙煙熏法建立COPD小鼠模型，于最后一次煙熏結束24 h內處死小鼠，取右下肺。觀察2組小鼠體質量變化、肺組織病理變化，測量平均內襯間隔（MLI），免疫組化法檢測肺組織中CD1a+、CD83+ DC的分布并計數。結果 建模7、14、21、28 d時煙熏COPD組的小鼠體質量較空氣對照組均降低（P＜0.05）；HE染色示煙熏COPD組小鼠肺組織正常肺泡結構破壞，多個肺泡相互融合形成較大的肺泡腔，肺泡間隔有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，COPD造模成功；與空氣對照組比較，煙熏COPD組MLI值（μm）增大（28.30±3.47 vs. 50.40±3.60），肺組織中CD1a+ DC數量（個/視野）增多（9.58±2.18 vs. 17.08±3.67），而CD83+ DC數量（個/視野）減少（19.78±4.95 vs. 8.02±3.30），差異有統計學意義（均P＜0.05）。結論 煙熏COPD組小鼠肺組織CD1a+ DC增多，CD83+ DC減少，香煙煙熏可能導致DC成熟障礙。

關鍵詞：肺疾病，慢性阻塞性；樹突細胞；吸煙；CD1a；CD83

中圖分類號：R563 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240321

Distribution and significance of CD1a+ and CD83+ dendritic cells in lung tissue of COPD mice

ZHANG Lanying1， ZHANG Fuan2， LIU Maomao1， CHEN Jie1， ZHOU Jian1， LIU Yuting1， OUYANG Yao1△

1 Department of Respiratory and Critical Care Medicine， 2 Department of Neurosurgery，

Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zunyi 563000， China

△Corresponding Author E-mail： ouyangyao116@sohu.com

Abstract： Objective To study the distribution and significance of CD1a and CD83 positive dendritic cells （DCs） in lung tissue of chronic obstructive pulmonary disease （COPD） mice. Methods Twenty C57BL/6 mice were randomly divided into the air control group and the smoked COPD group （n=10 for each group）. COPD mouse model was established using cigarette smoking method. Mice were executed within 24 h after the last cigarette smoking， and right lower lung was collected. Body mass changes and lung histopathological changes of mice were observed in two groups. Mean linear intercept （MLI） was measured， and expression levels of CD1a+ and CD83+ DCs in lung tissue were detected by immunohistochemistry. Results The body mass of mice at 7， 14， 21 and 28 d after modeling was lower in the smoked COPD group than that in the air control group （P＜0.05）. HE staining showed that the normal alveolar structure of lung tissue of mice in the smoked group was disrupted， with multiple alveoli fused with each other to form a larger alveolar lumen， a large number of inflammatory cells infiltrated in alveolar intervals， and walls of the alveoli were thickened. COPD modeling was successful. Compared with the air control group， MLI values （μm） increased in the smoked COPD group （28.30±3.47 vs. 50.40±3.60）， and the number of CD1a+ DCs （ per field of view） in lung tissue increased （9.58±2.18 vs. 17.08±3.67）， while the number of CD83+ DCs （per field of view） decreased （19.78±4.95 vs. 8.02±3.30） （all P＜0.05）. Conclusion The number of CD1a+ DCs in lung tissue is increased and the number of CD83+ DCs in lung tissue is decreased in the smoked COPD group of mice， and cigarette smoking may have impaired DC maturation.

Key words： pulmonary disease， chronic obstructive; dendritic cells; smoking; CD1a; CD83

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種高發病率、高病死率及高負擔的疾病，以持續存在的氣流受限和相應的呼吸系統癥狀為特征，其與氣道及肺組織對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應有關，嚴重影響患者的生活質量，并帶來較大的經濟壓力和社會負擔［1-2］。吸煙是COPD發病的重要誘發因素，吸煙停止后肺部炎癥仍持續存在，自身免疫系統紊亂可能是COPD的發病機制［3］。氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥反應是COPD的特征性改變，這一過程需要抗原提呈細胞參與。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是目前已知唯一可激活初始T細胞的抗原提呈細胞，在啟動、調控及維持特異性免疫反應中發揮不可替代的作用［4-5］。根據成熟狀態不同可分為成熟DC及未成熟DC，未成熟DC具有攝取并處理抗原的能力，成熟DC具有抗原提呈能力，目前認為CD1a是未成熟DC的標志，而CD83則是成熟DC的標志［6-7］。本研究通過香煙煙熏法建立COPD小鼠模型，檢測COPD小鼠肺組織中CD1a+和CD83+ DC的分布情況，探討DC在COPD發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠20只，6～8周齡，雌雄不限，體質量18～24 g，購自第三軍醫大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（渝）2012-0005。本研究經遵義醫科大學附屬醫院動物倫理委員會審批后實施，批準號：KLLY（A）-2020-056。

1.2 主要試劑及儀器 黃果樹牌香煙購自貴州中煙工業有限責任公司，焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量12 mg。兔抗小鼠CD1a多克隆抗體、兔抗小鼠CD83多克隆抗體、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒（小鼠）購自北京博奧森生物技術有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；全自動輪轉式切片機購自德國Leica公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD小鼠模型建立及分組 將20只C57BL/6小鼠采用隨機數字表法分為空氣對照組和煙熏COPD組各10只。使用香煙煙熏法建立COPD小鼠模型：將小鼠置于自制煙熏玻璃箱（90 cm×40 cm×30 cm）中，每周連續煙熏6 d，4次/d（每次6支煙，間隔1 h），共持續4周。空氣對照組則暴露于空氣中，正常飼養。觀察小鼠一般情況，于模型建立0、7、14、21、28 d時記錄體質量變化。

1.3.2 標本收集和HE染色 2組小鼠于末次煙熏結束24 h內予1.25%阿佛丁（20 mL/kg）腹腔注射麻醉，然后采用頸椎脫臼法處死。充分暴露胸腔，取右下肺，于4%多聚甲醛固定24 h，30%～100%梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋并制作厚5 μm切片，行HE染色，顯微鏡觀察肺組織病理變化。

1.3.3 小鼠肺組織平均內襯間隔（mean linear intercept，MLI）測定 將HE染色切片在低倍鏡（×100）下隨機讀取5個視野（避開大血管和支氣管），于每個視野正中劃十字交叉線，計數與交叉線相交的肺泡隔數（NS），同時測量十字線總長（L），按公式計算MLI。MLI=L/NS，以表示肺泡平均內徑。通過MLI評估小鼠肺氣腫嚴重程度。

1.3.4 免疫組化法檢測小鼠肺組織DC中CD1a+、CD83+的表達 將小鼠肺組織切片脫蠟、脫水、清除內源性氧化產物、抗原修復，血清封閉；加兔抗小鼠CD1a、CD83多克隆抗體（1∶100），以PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃冰箱過夜；加二抗［超敏二步法免疫組化檢測試劑盒（小鼠）］，DAB顯色，蘇木紫染色，乙醇分化、脫水、干燥、封片。采用IPWin32軟件，于200倍下選取同一張切片上5個陽性細胞數最多的視野進行拍照并計數，作為該切片對應肺組織的陽性細胞數。

1.4 統計學方法 采用SPSS 29.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（[x] ±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內各時間點比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組小鼠的一般情況 空氣對照組小鼠活潑好動，毛發有光澤且較順暢，食欲旺盛，呼吸平穩。煙熏COPD組小鼠精神萎靡，毛發無光澤，食欲減退，出現咳嗽、氣促表現。

2.2 2組小鼠體質量變化 造模0 d時，2組小鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）；造模7、14、21、28 d時，煙熏COPD組體質量均低于空氣對照組（P＜0.05）。空氣對照組小鼠體質量隨時間延長而逐漸增加，煙熏COPD組小鼠體質量隨煙熏時間延長而逐漸降低（P＜0.05），見表1。

2.3 小鼠肺組織病理特征 HE染色結果顯示，空氣對照組小鼠肺泡壁結構連續、完整，肺泡間隔可見少量炎性細胞浸潤。煙熏COPD組小鼠正常肺泡結構破壞，多個肺泡相互融合形成較大的肺泡腔，肺泡間隔有大量的淋巴細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤，且肺泡壁增厚，與人類COPD患者肺組織形態、結構相似，見圖1。煙熏COPD組MLI值（μm）較空氣對照組增大（50.40±3.60 vs. 28.30±3.47，n=10，t=13.993，P＜0.05），提示造模成功。

2.4 2組小鼠肺組織中CD1a+及CD83+ DC的分布比較 CD1a和CD83染色均位于細胞膜及細胞質內。CD1a+和CD83+ DC呈棕黃色，單核，胞體呈卵圓形或不規則形，部分細胞表面見粗細不一、長短不等的突起，主要分布于肺泡、肺小血管管壁周圍、小氣道及氣道周圍淋巴組織，見圖2。煙熏COPD組小鼠肺組織中CD1a+ DC較空氣對照組增多，而CD83+ DC較空氣對照組減少（均P＜0.05），見表2。

3 討論

COPD嚴重危害人類健康［8］，盡管現階段的診療技術取得了較大進步，但其患病率和死亡率仍呈上升趨勢［9］。吸煙是COPD的主要危險因素，可增加肺組織和小氣道中炎性細胞、炎性因子、趨化因子等，造成氣道上皮和肺實質損傷退化，最終導致COPD［10］。本課題組前期通過香煙煙熏法成功建立COPD小鼠模型［11］。本研究顯示，香煙煙熏COPD組小鼠一般情況較空氣對照組差，體質量下降，肺泡結構破壞、肺部炎性細胞浸潤，與文獻［12］報道一致。

COPD患者存在小氣道炎癥［13］，需要抗原提呈細胞參與。DC是體內的重要抗原提呈細胞［14-15］。目前認為CD1a是未成熟DC的標志，而CD83則是成熟DC的標志［6-7，16］。Giorello等［17］研究表明CD1a+和CD83+ DC可以作為早期乳腺癌患者轉移發展的預后標志。Barbieri等［18］發現吸煙可引發口腔免疫系統紊亂，降低DC的活化和成熟能力，影響口腔鱗狀細胞癌的發生發展。Stahelin等［19］研究顯示吸煙可消耗口腔鱗狀細胞癌中未成熟DC和成熟DC。由此可知，CD1a+和CD83+ DC作為重要的免疫細胞可調節機體免疫功能，參與多種疾病的發生發展。

本課題組前期研究發現，在COPD患者肺組織小氣道中CD1a+ DC分布增加，CD83+ DC分布減少，香煙煙霧影響COPD患者小氣道DC的成熟［20］，且通過流式細胞術和免疫組化法檢測COPD患者外周血以及肺組織中趨化因子受體6、CD80水平，發現趨化因子受體6表達增高，CD80表達降低，存在輔助性T細胞17（Th17）/調節性T（Treg）細胞失衡［21］，筆者推測COPD患者中存在DC成熟障礙，DC介導Th17/Treg細胞失衡可能在COPD的發病機制中發揮重要作用。而本研究在煙熏COPD小鼠肺組織中發現CD1a+ DC增多，CD83+ DC減少，DC成熟障礙，與本課題組前期研究［20］結果一致。Zanini等［22］研究表明，COPD患者中心氣道中未成熟DC標志物CD207增加，而成熟DC標志物CD83減少，成熟度降低；這與本研究結果一致，且該研究表明DC成熟障礙與氣道血管分布和血管生成因子有關，未成熟DC與疾病嚴重程度明顯相關，氣道血管變化與DC成熟障礙之間的相互作用可能在COPD的發病機制中發揮關鍵作用。在本研究中，煙熏COPD組MLI值較空氣對照組增大且DC成熟障礙，說明DC成熟障礙可能參與COPD的發病，并與其嚴重程度相關。香煙煙熏使DC成熟障礙的具體機制不明，筆者推測香煙煙霧復雜的化學成分可促進免疫炎癥，使得肺部炎癥持續加重導致DC成熟障礙，不能有效地激活效應性T淋巴細胞，從而引起特異性免疫反應。此外，不同的煙熏時間對DC成熟的影響可能也不同。在本研究中，經過長達4周的煙熏后，煙熏COPD小鼠肺組織中DC成熟障礙。而Givi等［23］研究表明，短期香煙煙霧提取物可刺激未成熟DC成為成熟DC的狀態，CD83、CD86、CD40表達上調，促炎細胞因子分泌增多，而長期暴露于香煙煙霧提取物則抑制功能性DC的發育，CD11c、CD83、CD86和CD40表達下降，DC成熟障礙，同時產生細胞因子和刺激T淋巴細胞能力下降。Paplinska-Goryca等［24］研究表明，在哮喘、COPD患者及健康人中，單核細胞衍生的DC中胸腺基質淋巴細胞生成素、白細胞介素（IL）-33和IL-17A的表達受到上皮細胞的不同調控，這些細胞間復雜的相互作用可能會影響氣道炎癥，并成為哮喘和COPD發生發展的重要因素。

綜上，本研究發現煙熏COPD小鼠的肺組織CD1a+ DC數量增多，CD83+ DC數量減少，DC成熟障礙，但DC成熟障礙的機制尚待闡明。

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（2024-03-19收稿 2024-04-28修回）

（本文編輯 李國琪）