止咳平喘方對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥及TLR4/TRAF6/NF-κB通路的影響

摘要：目的 探討止咳平喘方減輕支氣管哮喘（BA）小鼠氣道炎癥的作用及機制。方法 84只BALB/c小鼠隨機分為對照組、BA組、止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組、脂多糖（LPS）組、止咳平喘方高劑量+LPS組，每組12只。除對照組外，其他組小鼠均構建BA模型，建模成功后進行給藥處理，每日1次，持續3周。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中免疫球蛋白E（IgE）濃度和肺泡灌洗液中白細胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；HE染色檢測肺組織病理變化；PAS染色測定支氣管上皮杯狀細胞增生以及黏液分泌；流式細胞術檢測小鼠脾臟組織中輔助性T細胞17（Th17）和調節性T（Treg）細胞水平；Western blot檢測肺組織Toll樣受體4（TLR4）/腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）/核因子κB（NF-κB）通路相關蛋白表達。結果 與對照組比較，BA組肺組織病理損傷嚴重，支氣管上皮杯狀細胞增生及黏液分泌增多，IgE含量、TNF-α水平、IL-17水平、Th17細胞比例、Th17/Treg比值及TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達升高，Treg細胞比例降低（P＜0.05）。與BA組比較，止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組支氣管上皮杯狀細胞增生和黏液分泌減少，肺組織損傷改善，IgE含量、TNF-α水平、IL-17水平、Th17細胞比例、Th17/Treg比值及TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達降低，Treg細胞比例升高（P＜0.05）；LPS組對應指標變化趨勢與上述相反（P＜0.05）。與止咳平喘方高劑量組比較，止咳平喘方高劑量+LPS組肺組織病理損傷加劇，支氣管上皮杯狀細胞增生及黏液分泌增多，IgE含量、TNF-α水平、IL-17水平、Th17細胞比例、Th17/Treg比值及TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達升高，Treg細胞比例降低（P＜0.05）。結論 止咳平喘方可能通過抑制TLR4/TRAF6/NF-κB通路減輕BA小鼠氣道炎癥反應。

關鍵詞：哮喘；止咳平喘方；Toll樣受體4/腫瘤壞死因子受體相關因子6/核因子κB通路；氣道炎癥

中圖分類號：R256.12 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240222

Effects of Zhike Pingchuan Formula on airway inflammation and TLR4/TRAF6/NF-κB

pathway in bronchial asthma mice

FAN Huihui， REN Yumei△， TIAN Xinlei， ZHANG Kai， LI Xiaoli

Department of Pediatrics， Henan Hospital of Traditional Chinese Medicine （the Second Affiliated Hospital of

Henan University of Chinese Medicine）， Zhengzhou 450053， China

△Corresponding Author E-mail： xiaoxiannv800@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of Zhike Pingchuan Formula on reducing airway inflammation in mice with bronchial asthma （BA）. Methods A total of 84 BALB/c mice were randomly separated into the control group， the BA group， the low-dose Zhike Pingchuan Formula group， the high-dose Zhike Pingchuan Formula group， the dexamethasone group， the lipopolysaccharide （LPS） group and the high-dose Zhike Pingchuan Formula+LPS group， with 12 mice in each group. The BA model was constructed in all groups of mice except the control group. After successful modeling， mice were treated with drug administration once a day for 3 weeks. Serum immunoglobulin E （IgE） concentration and levels of interleukin-17 （IL-17） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in alveolar lavage fluid were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Pathological changes in lung tissue was detected by HE staining. The bronchial epithelium goblet cell proliferation and mucus secretion were determined by PAS staining. Flow cytometry was used to detect levels of T helper cell 17 （Th17） and regulatory T （Treg） cell in mouse spleen tissue. Western blot assay was used to detect toll-like receptor 4 （TLR4）/tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 （TRAF6）/nuclear factor kappa-B （NF-κB） pathway-related protein expression in lung tissue. Results Compared with the control group， damage of lung tissue was serious， the proliferation of bronchial epithelial goblet cells and the secretion of mucus increased， IgE concentration， TNF-α， IL-17 levels， Th17 cell proportion， Th17/Treg ratio， and TLR4， TRAF6， p-NF-κB p65 protein expression increased， while Treg cell proportion decreased in the BA group （P＜0.05）. Compared with the BA group， the bronchial epithelial cupular cell proliferation and mucus secretion were reduced in the low-dose Zhike Pingchuan Formula group， the high-dose Zhike Pingchuan Formula group and the dexamethasone group， the lung tissue damage was improved， the concentration of IgE， levels of TNF-α， IL-17， the proportion of Th17 cells， the ratio of Th17/Treg and expression of protein levels of TLR4， TRAF6 and p-NF-κB p65 were reduced， and the proportion of Treg cell was elevated （P＜0.05）. The trend of corresponding indexes in the LPS group was opposite to the above （P＜0.05）. Compared with the high-dose Zhike Pingchuan Formula group， the pathological damage of lung tissue increased in the high-dose Zhike Pingchuan Formula+LPS group. The proliferation of bronchial epithelial goblet cells and the secretion of mucus increased， the IgE concentration， TNF-α， IL-17 levels， Th17 cell proportion， Th17/Treg ratio and TLR4， TRAF6， p-NF-κB p65 protein expression increased， while the Treg cell proportion decreased （P＜0.05）. Conclusion Zhike Pingchuan Formula may reduce airway inflammation in BA mice by inhibiting TLR4/TRAF6/NF-κB pathway.

Key words： asthma; Zhike Pingchuan Formula; toll-like receptor 4/tumor necrosis factor receptor-associated factor 6/nuclear factor kappa-B pathway; airway inflammation

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）是一種呼吸系統的常見多發疾病，其主要特征為慢性氣道炎癥。目前治療BA主要采取吸入皮質類固醇、長效β2激動劑等常規藥物。但研究發現約有10%的BA患者對常規藥物反應不佳［1］。中醫藥具有多靶點、不良反應少的特性。止咳平喘方是在名中醫侯江紅教授臨床經驗方的基礎上結合文獻［2］配伍形成的，該方有清熱化痰，宣肺平喘的作用［3］。已有研究報道，止咳平喘方能提高BA急性發作期患者臨床療效，抑制炎性因子，降低復發率［4］。但止咳平喘方對BA過程中氣道炎癥的影響鮮有報道。相關研究顯示，抑制Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路可改善哮喘大鼠氣道炎癥［5］。但止咳平喘方能否通過調控該通路影響BA小鼠氣道炎癥尚不明確。因此，本研究旨在探究止咳平喘方對BA小鼠氣道炎癥的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 5周齡，20～22 g的SPF級雄性BALB/c小鼠84只購自廣東萊迪生物公司，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0064。小鼠飼養于河南省中醫院，使用許可證號：SYXK（豫）2021-0018。所有動物實驗均遵循“3R”原則，并得到河南省中醫院動物倫理委員會的批準，批號：2021-0566。

1.1.2 藥品與試劑 止咳平喘方由10 g炙麻黃、10 g大棗、10 g陳皮、10 g白果、6 g枳殼、6 g紫蘇子、6 g白芥子、6 g萊菔子、10 g苦杏仁、9 g射干、15 g地龍、9 g蒼耳子、3 g五味子、9 g防風、6 g蟬蛻、12 g法半夏、15 g丹參、6 g桃仁組成［2］，方中所有藥物均購自廣東康愛多連鎖藥店有限公司，上述所有藥物置于200 mL蒸餾水中煎煮，然后收集煎煮液用于后續實驗。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自北京百奧萊博公司；地塞米松購自廣東華南藥業公司；氫氧化鋁購自淄博鋮博新材料公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自上海源葉生物科技有限公司；小鼠免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司；流式抗體CD4-FITC、IL-17-PE、叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，Foxp3）-PE購自艾柏森生物科技有限公司；兔源一抗TLR4、TRAF6、NF-κB p65、GAPDH、p-NF-κB p65及山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及BA小鼠模型的構建 按照隨機數字表法將BALB/c小鼠分為對照組、BA組、止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組、LPS組、止咳平喘方高劑量+LPS組，每組12只。除對照組外，其他組均在實驗第1天和第7天通過向小鼠腹腔注射1 mL含100 mg OVA、100 mg氫氧化鋁的混合液致敏，第15天開始用1% OVA滴鼻激發哮喘，每日1次，連續7 d以構建BA小鼠模型［6］。

1.2.2 給藥處理 在建模成功后行各組給藥處理。止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組［7］、地塞米松組［8］小鼠分別需灌胃1.875 mL/kg止咳平喘方水煎液、7.5 mL/kg止咳平喘方水煎液（小鼠給藥劑量按小鼠和大鼠體表面積折算的等效劑量）、0.188 mg/kg地塞米松，且均腹腔注射等體積的生理鹽水；LPS組［9］小鼠需腹腔注射0.15 mg/kg LPS，且還需灌胃等量的生理鹽水；止咳平喘方高劑量+LPS組小鼠需灌胃7.5 mL/kg" 止咳平喘方水煎液，且腹腔注射0.15 mg/kg LPS；BA組、對照組小鼠均灌胃且腹腔注射等體積的生理鹽水。每日1次，持續3周。

1.2.3 標本收集 末次給藥24 h后，各組小鼠麻醉后取腹主動脈血，經離心得血清，用于IgE含量檢測；處死小鼠，分離并暴露頸部氣管，并在氣管處剪一切口，將1 mL生理鹽水注入其中，用一次性無菌注射器緩慢回抽液體，重復上述操作3次，將3次所得液體混合即為肺泡灌洗液，用于TNF-α、IL-17的檢測；收集小鼠的脾臟組織用于流式細胞術實驗；取小鼠肺組織均分為兩部分，一部分用于PAS染色以及HE染色，另一部分凍存于-80 ℃冰箱中用于Western blot檢測。

1.2.4 小鼠血清中IgE含量及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17水平的檢測 按照ELISA說明書檢測血清中IgE含量以及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17水平。

1.2.5 肺組織的HE染色和PAS染色 將肺組織固定在4%多聚甲醛中24 h后，組織進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，切成切片（厚度4 μm），通過HE染色評估肺部炎癥水平，通過PAS染色評估小鼠黏液分泌以及支氣管上皮杯狀細胞增生。

1.2.6 流式細胞術檢測小鼠脾臟組織中輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）/調節性T細胞（regulatory T cell，Treg cell） 使用淋巴細胞分離液分離小鼠脾臟組織勻漿中的淋巴細胞，經3 000 r/min離心20 min后，收集兩液相交界處的細胞，將該細胞培養5 h后，加入CD4-FITC、IL-17-PE抗體染色以評估Th17細胞比例，加入CD4-FITC、Foxp3-PE抗體染色以評估Treg細胞比例，計算Th17/Treg比值。

1.2.7 Western blot檢測小鼠肺組織中TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達 RIPA裂解緩沖液裂解肺組織勻漿，在4 ℃下12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為肺組織總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度，通過電泳分離40 μg總蛋白，然后轉移到PVDF膜上。在室溫下利用5%脫脂奶粉封閉膜1.5 h后，將膜在4 ℃下與一抗TLR4（1∶3 000）、TRAF6（1∶3 000）、p-NF-κB p65（1∶3 000）、NF-κB p65（1∶4 000）、GAPDH（1∶" "4 000）孵育過夜，然后將膜與二抗（1∶5 000）共同孵育1.5 h。加入ECL試劑觀察蛋白印跡，Image J軟件評估蛋白灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 29.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（[x] ±s）表示。采用單因素方差分析用于多組間的差異比較，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 止咳平喘方對各組小鼠血清中IgE含量變化的影響 與對照組比較，BA組小鼠血清中IgE含量升高（P＜0.05）；與BA組比較，止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組小鼠血清中IgE含量降低（P＜0.05），LPS組小鼠血清中IgE含量升高（P＜0.05）；與止咳平喘方高劑量組比較，止咳平喘方高劑量+LPS組小鼠血清中IgE含量升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 止咳平喘方對各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17水平變化的影響 與對照組比較，BA組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17水平升高（P＜0.05）；與BA組比較，止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17水平降低（P＜0.05），LPS組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17水平升高（P＜0.05）；與止咳平喘方高劑量組比較，止咳平喘方高劑量+LPS組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17水平升高（P＜0.05），見表1。

2.3 止咳平喘方對各組小鼠肺組織病理變化的影響 HE染色顯示，對照組小鼠支氣管周圍未見明顯炎性細胞浸潤，肺泡間隔正常；BA組小鼠支氣管周圍可見明顯炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚；與BA組比較，止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組小鼠支氣管周圍炎性細胞浸潤減少，肺泡間隔變窄，LPS組小鼠支氣管周圍炎性細胞浸潤嚴重，肺泡間隔變厚；與止咳平喘方高劑量組比較，止咳平喘方高劑量+LPS組小鼠支氣管周圍炎性細胞浸潤加劇，肺泡間隔增厚，見圖2。PAS染色顯示，對照組小鼠無黏液分泌，支氣管上皮杯狀細胞無增生；BA組小鼠黏液分泌旺盛，支氣管上皮杯狀細胞大量增生；與BA組比較，止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組小鼠黏液分泌以及支氣管上皮杯狀細胞增生減少，LPS組小鼠黏液分泌以及支氣管上皮杯狀細胞增生增多；與止咳平喘方高劑量組比較，止咳平喘方高劑量+LPS組小鼠黏液分泌及支氣管上皮杯狀細胞增生增多，見圖3。

2.4 止咳平喘方對小鼠脾臟中Th17/Treg比值的影響 與對照組比較，BA組脾臟中Th17比例及Th17/Treg比值升高，Treg細胞比例降低（P＜0.05）；與BA組比較，止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組脾臟中Th17比例及Th17/Treg比值降低，Treg細胞比例升高（P＜0.05），LPS組脾臟中Th17比例及Th17/Treg比值升高，Treg細胞比例降低（P＜0.05）；與止咳平喘方高劑量組比較，止咳平喘方高劑量+LPS組脾臟中Th17比例及Th17/Treg比值升高，Treg細胞比例降低（P＜0.05），見表2。

2.5 止咳平喘方對各組小鼠肺組織中TLR4/TRAF6/NF-κB通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，BA組小鼠肺組織中TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達升高（P＜0.05）；與BA組比較，止咳平喘方低劑量組、止咳平喘方高劑量組、地塞米松組小鼠肺組織中TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達降低（P＜0.05），LPS組小鼠肺組織中TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達升高（P＜0.05）；與止咳平喘方高劑量組比較，止咳平喘方高劑量+LPS組小鼠肺組織中TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達升高（P＜0.05），見圖4、表3。

3 討論

BA是一種氣道慢性炎癥性疾病，該病涉及多種炎癥介質和炎性細胞的參與［10］。氣道炎癥作為BA的基本病理特征，表現為大量炎性細胞的浸潤，炎性細胞通過釋放顆粒蛋白引起一系列炎癥反應，這是反復出現哮喘癥狀的重要原因［11］。因此，減少炎性因子的釋放和抑制氣道炎癥是治療BA的有效方法。IgE可作用于嗜酸性粒細胞和肥大細胞，上述細胞通過釋放生物活性介質加重哮喘；此外，IgE也是機體抵抗外界感染的主要抗體，其水平越高，表明機體炎癥反應越嚴重［12］。本研究構建了BA模型小鼠，結果顯示，與對照組比較，BA組小鼠血清中IgE含量、肺泡灌洗液中IL-17水平、TNF-α水平升高，肺組織病理損傷、支氣管上皮杯狀細胞增生及黏液分泌嚴重，表明BA小鼠存在氣道炎癥。Th17/Treg平衡與多種免疫疾病密切相關。有研究表明Th17/Treg失衡可促進哮喘小鼠炎癥程度［13］。本研究發現，與對照組比較，BA組小鼠脾臟組織中Th17比例及Th17/Treg比值升高，Treg比例降低，提示Th17/Treg失衡可能是導致BA小鼠氣道炎癥的重要原因之一。因此，促進Th17/Treg平衡可能是改善BA小鼠氣道炎癥的有效策略之一。

止咳平喘方具有化痰止咳、宣肺息風之功效［3］。止咳平喘方可通過降低炎癥相關因子水平改善BA急性發作期患者肺功能［14］，還可改善BA患兒咳嗽癥狀［15］。以上研究表明止咳平喘方具有改善BA的作用。本研究亦顯示，止咳平喘方可促進BA小鼠Th17/Treg平衡，抑制氣道炎癥，且止咳平喘方劑量越高，對應的趨勢越明顯。由此表明止咳平喘方可通過促進Th17/Treg平衡抑制BA小鼠氣道炎癥。地塞米松是臨床上常用于治療BA的藥物，本研究將其設為陽性藥物，結果顯示地塞米松與高劑量止咳平喘方對BA小鼠氣道炎癥的抑制作用相當，再次證實止咳平喘方是可用于改善BA的藥物。

TLR4可通過TRAF6刺激NF-κB來激活炎癥途徑，進而促進多種疾病的進展［16］。據報道，抑制TLR4/TRAF6/NF-κB軸可減少癲癇模型大鼠神經元炎癥［17］；下調TLR4/TRAF6/NF-κB通路可緩解小鼠過敏性鼻炎［18］；抑制TLR4/NF-κB軸可抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應［19］。本研究顯示，與BA組比較，LPS組小鼠肺組織中TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達升高，氣道炎癥反應增強，且LPS為TLR4激活劑，表明TLR4/TRAF6/NF-κB通路的激活確實參與了BA小鼠氣道炎癥反應過程，炎癥進一步刺激小鼠黏液分泌以及支氣管上皮杯狀細胞增生。此外，本研究還發現，止咳平喘方可抑制BA小鼠肺組織中TLR4、TRAF6、p-NF-κB p65蛋白表達，且止咳平喘方劑量越高，抑制作用越明顯，故推測止咳平喘方可能通過抑制TLR4/TRAF6/NF-κB通路抑制BA小鼠氣道炎癥反應，進而阻礙小鼠黏液分泌以及支氣管上皮杯狀細胞增生。為了驗證該推測，本研究在高劑量止咳平喘方作用的基礎上再加TLR4激活劑LPS干預BA小鼠，結果顯示LPS減弱了高劑量止咳平喘方對BA小鼠氣道炎癥反應、黏液分泌以及支氣管上皮杯狀細胞增生的抑制作用，由此證實了推測，即止咳平喘方可能通過抑制TLR4/TRAF6/NF-κB通路抑制BA小鼠氣道炎癥反應，進而阻礙黏液分泌以及支氣管上皮杯狀細胞增生。

綜上所述，止咳平喘方可能通過抑制TLR4/TRAF6/NF-κB通路抑制BA小鼠氣道炎癥反應。但該作用機制較為復雜，具體通過通路下游的哪些蛋白來發揮作用有待后續實驗進一步深入挖掘。

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（2024-02-23收稿 2024-04-18修回）

（本文編輯 胡小寧）