雜交水稻育種技術的發展與創新
2024-12-31 00:00:00張超徐成毛馨晨于恒秀
江蘇農業科學 2024年19期
摘要：近期，水稻無融合生殖研究取得了系列進展。通過對水稻減數分裂基因和配子發育相關基因的編輯或表達調控，初步實現了水稻雜交種的自交傳代，為一系法雜交水稻成功實現奠定了重要基礎。本文對三系法、兩系法、智能不育系及一系法4種雜交水稻制種技術的歷史、現狀進行綜述，重點介紹了各技術的分子生物學研究進展及各自的優缺點，并對各育種技術的發展進行了展望，為后續創制優良雜交水稻種子繁殖體系及進一步發揮雜交水稻潛力提供參考。
關鍵詞：雜交水稻；細胞質雄性不育系；光/溫敏核雄性不育系；智能不育系；無融合生殖
中圖分類號：S511.035.1" 文獻標志碼：A
文章編號：1002-1302（2024）19-0001-07
收稿日期：2024-03-19
基金項目：國家自然科學基金（編號：32200690）
作者簡介：張 超（1988—），男，山東濟寧人，博士，講師，碩士生導師，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：chaozhang@yzu.edu.cn。
通信作者：于恒秀，博士，教授，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：hxyu@yzu.edu.cn。
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球超過1/2的人口以稻米為主食［1］。人口的持續增加、耕地面積的不斷減少及極端氣候的頻繁出現，使糧食安全面臨嚴峻的挑戰。中國雜交水稻種植面積占比超過50%，占全國水稻總產量的60%以上，為我國乃至世界糧食增產做出了卓越貢獻［2-3］。雜交水稻是利用雜種優勢提高產量的成功應用，也是解決日益嚴重的糧食短缺危機的關鍵技術之一。
雜種優勢廣泛存在于生物界，它指2個不同遺傳背景的親本雜交產生的雜種F1代在抗逆性、抗病性、適應性、生長勢、產量和品質等方面優于親本的現象。雜種優勢在作物改良方面的利用對提高產量具有顯著的效果。20世紀50年代，半矮稈基因sd1的鑒定利用和半矮稈作物品種培育促成了第1次“綠色革命”，這解決了發展中國家的糧食短缺問題［4］。1926年，美國農學家Jones率先提出了水稻具有雜種優勢的理論，雜種優勢的利用被認為是“第二次綠色革命”。雜交水稻能獲得比常規水稻高15%以上的產量優勢［5-6］。
1963年，Henry Beachell于印度尼西亞首次成功培育出雜交水稻，隨后日本新城長友在1968年育成了具有Chinsurah Boro Ⅱ細胞質的不育系臺中65，率先實現了粳型雜交水稻的3系配套。但由于親緣關系太近而優勢較弱等問題，未能在生產上推廣應用［7］。20世紀60年代，袁隆平鑒定了1個雄性不育野生稻品系，該品系攜帶野生稻敗育細胞質雄性不育基因（cytoplasmic male sterility-wild abortion，CMS-WA）。如今CMS-WA已經滲入到各種水稻背景中，產生了許多CMS系，并在這些系的基礎上開發了“三系”雜交育種系統［8-9］。1973年，石明松在湖北仙桃發現了第1個光敏感雄性核不育水稻農墾58S，拉開了基于光溫敏核不育基因（photoperiod/ thermo-sensitive genic male sterile，PTGMS）的“兩系”雜交稻系統的發展序幕［10］。目前，雜交水稻種子生產主要以三系法和兩系法為主要繁殖體系。此外，近些年發展的水稻智能不育系及無融合生殖技術為雜交水稻育種提供了更多可能性，并指出了新的發展方向。
1 水稻三系法雜交育種技術研究現狀
三系法雜交水稻技術又被稱為“第一代雜交水稻技術”，該技術體系由細胞質雄性不育系、保持系和恢復系組成。雄性不育系的雄性生殖器官發育不正常，花粉敗育，但其雌性生殖器官發育正常，可接受外來正常花粉受精結實。保持系的細胞質基因正常，花粉可育，能夠自交結實繁殖，將保持系花粉授給不育系后產生的后代為不育系。恢復系具有能夠恢復不育系細胞質雄性不育的核基因，與不育系雜交后產生的雜交種正常可育，可應用于大面積水稻生產［11-12］。
細胞質雄性不育系受到細胞質不育基因和對應的細胞核基因的共同控制，通常是由于編碼細胞毒性蛋白的異常線粒體基因干擾了植物正常代謝，產生多種異常生理反應，導致花粉敗育［13-15］。CMS根據不育機制和恢保關系的不同主要分為野生稻敗育細胞質雄性不育（CMS-WA）、紅蓮型細胞質雄性不育（CMS-HL）及包臺型細胞質雄性不育（CMS-BT），其中CMS-HL和CMS-BT是配子體不育型，CMS-WA是孢子體不育型［16-17］。
CMS-WA是最早被發現并利用的一類不育胞質類型，由線粒體基因WA352控制。該基因在花藥絨氈層特異表達，所編碼的蛋白可與核編碼的線粒體跨膜蛋白COX11互作，抑制COX11清除細胞內活性氧的功能。受到活性氧損害的絨氈層細胞程序性死亡提前，產生花粉敗育表型［18］。水稻CMS-HL的不育基因是orfH79，而CMS-BT的不育基因是orf79。這2個基因都與線粒體嵌合基因atp6-orf79轉錄本相關，其序列相似性達到98%［16］。orf79與復制的atp6基因（B-atp6）共轉錄。其編碼具有細胞毒性的多肽。免疫印記分析表明，ORF79蛋白在小孢子內特異性積累，導致CMS-BT小孢子敗育［19］。orfH79有2種存在方式，一種是與atp6共轉錄形成的融合轉錄本，另一種為orfH79的單獨轉錄本［16，19-20］。關于CMS-HL的不育機制尚不完全明確。彭曉玨等利用原核系統證明微量的ORFH79天然蛋白強烈抑制了細菌生長，為思考水稻紅蓮型細胞質雄性不育的分子機理提供了研究線索［21］。Wang等發現，ORFH79通過與電子傳遞鏈復合體Ⅲ的亞基互作，影響了線粒體功能，導致花粉敗育［22］。
保持系具有與CMS系相同的核基因，但不具有異常線粒體基因，表現為可育，通過自交可以繁殖保持系。保持系對不育系的異花授粉可以繁殖不育系［11-12，23］。恢復系包含特定的育性恢復（Restorer of fertility，Rf）基因，其可通過作用于CMS基因的RNA或蛋白質抑制相應CMS基因功能，因此CMS的育性能夠在CMS系和恢復系的雜交種中得到恢復［12，24］，例如CMS-WA基因育性可被Rf3和Rf4恢復。有研究表明，Rf3可能在WA352翻譯或翻譯后水平發揮作用，而Rf4在WA352的轉錄后水平發揮作用［18，23，25］。CMS-BT基因育性可被Rf1a和Rf1b恢復。RF1A與RF1B均定位于線粒體，二者分別通過核酸內切及mRNA降解途徑抑制ORF79的蛋白含量［19］。CMS-HL基因育性可被Rf5和Rf6恢復。RF5參與融合轉錄本atp6-orfH79的剪接，而RF6可促進該轉錄本的加工過程，從而恢復花粉育性［26-27］。獲得的三系雜交種具有明顯的雜種優勢［23，28-29］。
南優2號是我國第1個大面積推廣應用的雜交水稻組合，由CMS-WA衍生而來，于1973年被發現，具有明顯的雜種優勢［30］。1980年，由謝華安等研發的汕優63是我國推廣面積最大的雜交水稻組合，大面積生產，產量達到600 kg/667 m2［31］。由于雜交水稻在生產上具有明顯的產量優勢，在我國迅速推廣，應用于商業化生產［11，32-33］。目前，我國推廣面積較大的雜交稻還有汕優64、威優64、汕優2號、岡優22、汕優6號、威優6號、Ⅱ優838、D優63、汕優10號（國家水稻數據中心），這些品種的種植面積都超過了600萬hm2。
三系法雜交水稻在產量上取得了巨大的成功，但可培育為不育系的水稻種質資源較少，不育系選育效率低。受恢保關系制約，三系法配組不自由，雙親間遺傳差異小，導致水稻雜種優勢難以充分利用。此外，部分不育系的育性受溫度影響發生波動［9，32-34］，這限制了三系法雜交水稻的產量提高及進一步推廣。
2 水稻兩系法雜交育種技術研究現狀
“第二代雜交水稻技術”是以依賴于光溫敏核不育系的“兩系雜交水稻”［3-4，9，32，34］。PTGMS育性受光照時長或溫度的影響，隨環境條件進行轉換，可育條件下自交繁殖不育系，不育條件下與大多數常規水稻品種（兩系恢復系）雜交生產具有雜種優勢的雜交種。根據影響其育性轉換的主要因素不同，通常將PTGMS分為2類，即光敏核不育（photoperiod-sensitive genic male sterile，PGMS）和溫敏核不育（thermo-sensitive genic male sterile，TGMS）。
PGMS的育性受到光周期的影響，一般可分為長光敏核不育型和短光敏核不育型。長光敏核不育型表現為在長日照條件下雄性不育，在短日照條件下育性恢復正常，短光敏核不育型則相反。典型的PGMS還受到溫度的負向互作。在我國各水稻研究中心，農墾58S（NK58S）被廣泛用于將PGMS性狀轉移到粳稻和秈稻優良品種（系）中。目前認為控制粳稻農墾58突變為NK58S雄性不育的光敏核不育基因主要有pms1、pms2和pms3。有研究指出，pms1是不完全顯性基因，編碼1個長鏈非編碼RNA，在幼穗中表達量較高，是miRNA2118的作用靶標。miRNA2118可以識別并剪切pms1的轉錄產物PMS1T，從而形成21 nt的phasiRNA（phased small-interfering RNAs）。NK58S在pms1基因上存在單堿基突變，導致在長日照條件下phasiRNA在水稻幼穗內大量積累，從而造成雄性不育［35］。pms2基因尚未克隆，其不育機制還有待進一步研究。Ding等克隆了pms3，其編碼1個長度為1 236 bp的長非編碼RNA（lncRNA）-LDMAR。由于在NK58S的LDMAR中發生了G到C的突變，改變了其RNA 2級結構，并造成LDMAR的啟動子區域甲基化程度升高，導致在長日照條件下轉錄本減少，從而造成花藥程序化死亡提前，出現在長日照條件下雄性不育的現象［23，36］。pms3在秈稻中的等位基因p/tms12-1不同于在粳稻NK58S中調控光敏核雄性不育基因，p/tms12-1在秈稻培矮64S（PA64S）背景中調控溫敏雄性不育，野生型P/TMS12-1是一個非編碼RNA基因，它的原始轉錄本經過至少2次加工產生1個小RNA。突變型p/tms12-1在該小RNA上產生單堿基突變（與pms3一致），導致p/tms12-1溫敏不育［37］。R2R3型MYB轉錄因子CSA調控水稻糖的分配，在水稻花粉發育過程中發揮重要作用［38］。進一步研究發現在秈稻及粳稻背景下，csa的花粉在短日照條件下表現不育，長日照條件下表現為可育。短日照條件下，CSA基因的表達量更高。CSA的同源基因MYB5和MYB8在長日照條件下具有更高的表達量。因此，CSA及其同源基因在不同光照條件下的功能互補可能是csa光敏不育的原因［39］。
TGMS的育性受到環境溫度的影響。TMS5編碼1個保守的RNA酶ZS1（RNaseZS1）。RNaseZS1能剪切并降解3個泛素核糖體L40融合蛋白基因UbL40mRNA。而在tms5突變體中，RNaseZS1功能缺失，不能對UbL40mRNA進行切割降解。高溫導致UbL40mRNA過度積累，使花粉發育受阻，花粉敗育［40-41］。水稻tms10高溫下表現為雄性不育，低溫條件下雄性可育。與其同源蛋白的雙突變體tms10 tms10l在高溫及低溫條件下均表現為不育。TMS10L可在常溫下互補TMS10的功能，從而使tms10突變體在常溫下表現雄性可育［42］。組蛋白結合蛋白OsMS1的自然等位基因OsMS1wenmin1可引起水稻溫敏雄性不育。高溫可導致OsMS1wenmin1的蛋白含量降低，且減低幅度大于OsMS1［43］。高溫敏感調控基因OsTMS19編碼五肽重復（pentatricopeptide repeat，PPR）蛋白。在高溫及長光照條件下，ostms19花藥中積累過多的活性氧，破壞了花粉內壁的形成，造成雄性不育。這種活性氧的動態平衡與育性轉換的關系在其他PTGMS中也存在，表明活性氧的調控可能是水稻PTGMS育性轉換的普遍機制［44］。唐杰等鑒定到育性受光溫影響的雄性不育突變體tms3650，但控制該性狀的基因尚未克隆，不育機制還有待進一步研究［45］。
相對于三系法雜交水稻，兩系法雜交水稻不需要保持系來繁殖雄性不育系，這大大簡化了雜交育種的程序。此外，PTGMS系的雄性不育由隱性核基因控制，它們可以與任何攜帶野生型育性基因的植株雜交，以恢復雜種的生育能力，這使得雜交組配更加自由，促使大多數種質資源的雜種優勢得到開發利用［9，32，34，46］。據全國農業技術推廣服務中心提供的數據，2017—2021年期間通過國家審定的水稻品種中，兩系法雜交水稻占比57.3%。但是，PTGMS的育性容易受到環境影響，在不可預測的環境條件下，光溫敏不育系面臨育性轉換臨界溫度不穩定的問題，特別是不能穩定保持的環境溫度容易導致PTGMS種子和雜交種子的生產失敗，給農業生產帶來損失［47-48］。
3 水稻“智能不育系”育種技術研究現狀
利用基因工程技術改造普通核不育系，是進一步利用水稻雜種優勢的新型育種技術體系。普通核不育系僅由1對隱性基因控制，任何品系都能轉育成為不育系，任何品系都能作為普通核不育系的恢復系。同時，普通核不育系花粉敗育徹底，不育性穩定［49］。普通核不育系和父本能夠不斷擴大遺傳差異，同時本身可以結合任何優良基因，聚合各種優良性狀，不受遺傳背景限制，能實現精準育種，因此又稱為智能不育系。由于純合隱性雄性不育系的完全敗育難以在生產中大量繁殖，限制其在雜種優勢利用中的應用價值。1993年，Williams等提出一種轉基因保持系的新策略，即通過用雄性育性恢復基因和花粉致死基因連鎖表達轉化隱性雄性不育植物，從而創建水稻保持系，通過保持系的自交可以繁殖雄性不育系和保持系種子［50］。2002年，Perez-Prat等提出了引入第3個標記基因的想法，即用育性恢復基因、選擇標記基因（種子顏色基因）和花粉致死基因，這3個基因構建緊密連鎖表達載體，轉化雄性不育突變體，以產生保持系。保持系自交授粉的后代將產生比例為 1 ∶1 的雄性不育系種子和帶顏色保持系種子，兩者可以通過顏色選擇標記進行分選，雄性不育系可以用于配置雜交種［51］。基于上述想法，2006年Dupont Pioneer率先在玉米中開發了雄性不育系種子生產技術（the seed production technology，SPT）。利用雄性不育的育性恢復基因Ms45、花粉特異啟動子PG47控制的玉米編碼α-淀粉酶基因ZmAA1和紅色熒光蛋白基因DsRed2這3個基因緊密連鎖的構建體來轉化玉米雄性不育突變體ms45，從而生產保持系。Ms45可以恢復雄性不育突變體ms45的雄性育性。花粉特異啟動子PG47控制下的Zm-aa1用來防止花粉中的淀粉積累，從而特異性地使攜帶轉基因成分的花粉失活，使只有非轉基因花粉才能參與受精結實。紅色熒光蛋白基因DsRed2用作識別后代是否攜帶轉基因成分的顏色篩選標記［52］。雜合轉基因植物恢復雄性育性并產生1 ∶1的不帶轉基因的可育花粉粒和帶轉基因的不育花粉粒。由于轉基因不影響雌性器官的育性，轉基因植物自花授粉產生2種種子。一種是攜帶轉基因且被標記為紅色熒光的種子，為保持系；另一種是非轉基因沒有顏色的種子，為雄性不育系，這2種種子可以通過熒光機械化分選。SPT技術自2012年起已經在美國被應用于玉米雜交種生產，且生產的雜交玉米被美國、澳大利亞和日本的監管機構認證為非轉基因玉米［53］。盡管SPT技術最早是在玉米中開發的，但它對于不易人工去雄的作物，如水稻、小麥、油菜等具有兩性花的作物更有適用性。
2010年，Wang等在水稻中采用了相同的方法，將花粉特異啟動子PG47驅動下的玉米α-淀粉酶基因Zm-aa1、糊粉酮特異性LTP2啟動子驅動下的紅色熒光蛋白DsRed2與水稻Ms26基因（OsCYP704B2）緊密相連，轉化進粳稻背景下的Oscyp704b2雄性不育突變體中［54］。由此產生了攜帶單拷貝轉基因插入的保持系，保持系自交產生了比例為1 ∶1的帶熒光種子和不帶熒光種子，表明該技術在水稻生產上具有應用潛力。然而，由于水稻種子具有穎殼，給利用紅色熒光標記進行水稻種子分選帶來難度［55］。2014年，于恒秀等提出利用對除草劑敏感性差異建立雜交水稻種子繁殖體系，利用水稻中OsCYP81A6基因的功能喪失會破壞水稻對磺酰脲類除草劑如苯達松的抗性這一原理，將OsCYP81A6基因的RNA干擾結構與水稻隱性雄性核不育基因的育性恢復基因和花粉致死基因緊密連鎖構建成連鎖結構，再轉入相應的雄性不育系中獲得保持系，保持系自交后代只需要噴灑磺酰脲類除草劑如苯達松就可以將可育株去除，篩選出雄性不育株［56］。同時，在載體構建時可以引入對另一類除草劑具有抗性的基因（如BAR基因），通過施用另一類除草劑噴施來提高保持系的制種產量［57］。
2016年，Chang等利用源自甲基磺酸乙酯（EMS）誘變的秈稻品種黃華占（HHZ）的隱性雄性不育突變體Osnp1（Oryza sativa No Pollen 1）和相應的育性恢復基因OsNP1構建了新核雄性不育系繁殖體系。HHZ是一個半矮稈、高產、穩產的優質秈稻品種，在我國廣泛種植。OsNP1編碼絨氈層退化和花粉外壁形成所需的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，Osnp1突變體在不同環境條件下均呈現穩定的雄性不育。將OsNP1基因、由花粉特異啟動子驅動的Zm-aa1以及由糊粉特異性LTP2啟動子驅動的紅色熒光蛋白DsRed連鎖表達載體轉化入Osnp1突變體中，通過篩選和鑒定獲得了一個名為Zhen18B的保持系，該保持系攜帶有單拷貝轉基因［58］。Zhen18B在形態、生長發育和結實方面與HHZ沒有差異，但自交產生的種子為1 ∶1的帶熒光轉基因種子和不帶熒光非轉基因種子，帶熒光種子為保持系Zhen18B，而不帶熒光種子為雄性不育系，命名為Zhen18A。在以Zhen18A為母本與其他水稻種質的雜交試驗中，約85%的單株產量超過親本［59］。這些結果證明該系統在雜交水稻生產上具有廣闊的應用前景。
2021年，李莉等利用基因編輯技術敲除細胞色素P450羥化酶編碼基因CYP703A3，成功獲得了雄性不育突變體931103a3。突變體931103a3的花粉量顯著減少，僅觀察到少量皺縮的不育花粉粒。將花粉育性恢復基因CYP703A3、花粉致死基因orfH79和選擇標記基因DsRed2構建的三元素連鎖表達載體通過幼穗愈傷組織轉化進突變體931103a3，通過鑒定篩選獲得了保持系9311-3B。通過自交保持系9311-3B，產生了含轉基因成分的保持系9311-3B和不含轉基因成分的雄性不育系9311-3A，且兩者比例為1 ∶1。以9311-3A為母本與優良品種雜交，與對照相比產量增加了13%以上［60-61］。
唐曉燕團隊利用干擾技術，降低糖代謝相關酶編碼基因的表達水平，使含有干擾載體的種子胚乳皺縮，重量變輕，但NMS種子胚乳正常且較重。通過重量分選機，可以輕松、準確地將保持系種子從NMS種子中分選出來，從而獲得純凈、飽滿的NMS種子。該系統以種子重量為篩選機制較之前用DsRed2的篩選機制，避免了因熒光信號弱而無法分選保持系種子與雄性不育系種子的問題。同時基于重量的分選機器較基于熒光的分選機器更為常見且成本低，工作效率更高［62］。此外，Pak等利用CRISPR/Cas9技術在中花11號（ZH11）中敲除OsOPR7基因，獲得了雄性不育突變體，經過篩選得到了能夠通過外源施加茉莉酸甲酯恢復育性的雄性不育系［63］。
智能不育系以普通核不育系為基礎，通過基因工程技術創制遺傳工程雄性不育系，完美解決了純雄性不育無法商業化生產的問題，具有育性穩定和組配自由的優點，且生產的種子不含有轉基因成分，是創制優良雜交水稻種質、提高水稻產量的重要技術。
4 無融合生殖水稻的興起
一系法雜交水稻主要利用水稻無融合生殖，即不經過減數分裂和雌雄配子融合而產生種子的繁殖方式。二倍體無融合生殖可使世代更迭但不會改變基因型，后代的遺傳構成與母本相同，因此可以固定雜種優勢，育成性狀不分離的雜交種。
2016年，Mieulet等在水稻中將3個減數分裂關鍵基因REC8、PAIR1和OSD1通過CRISPR/Cas9基因編輯產生的突變體兩兩雜交，成功地將減數分裂轉變為有絲分裂，創制出MiMe（Mitosis instead of Meiosis）材料，為在水稻中引入無融合生殖建立了基礎［64］。2018年，Khanday等發現AP2家族轉錄因子BBM1在受精后的胚胎發生過程中發揮中作用，卵細胞中異位表達BBM1基因可以觸發水稻孤雌生殖。將BBM1基因的異位表達與MiMe結合，可以得到雜交種子的克隆后代，且可進行多代穩定遺傳［65］。2019年，Wang等在水稻雜交種中同時編輯單倍體誘導基因OsMTL和MiMe相關基因，獲得了無融合生殖的Fix（fixation of hybrids）材料，獲得了雜交水稻的克隆種子，但克隆種子誘導率和結實率均偏低［66］。2022年，Vernet等優化轉基因策略，獲得了克隆種子誘導率超過95%的無融合生殖株系［67］。2023年，王克劍團隊利用擬南芥卵細胞特異啟動子pDD45驅動BBM4，發現BBM4卵細胞異位表達植株可以誘導孤雌生殖，獲得了無融合生殖的Fix2植株。Fix2植株結實率與野生型相同，但克隆種子誘導率偏低（3.2%）［68］。2024年，Dan等在MiMe材料中利用擬南芥卵細胞特異啟動子AtDD45驅動BBM1基因，在高結實率的情況下（6816%），獲得的克隆種子比率高達90.79%。該研究發現，異位表達BBM1基因并結合MiMe會產生多胚現象（1粒種子含有多個胚）及孤雌生殖頻率的隔代遺傳現象，相關機制還有待進一步研究［69］。
5 展望
三系法和兩系法作為目前雜交水稻育種的主要手段，還有較大的改進空間。三系法雜交水稻的育性受到恢保關系的制約，可供選擇的恢復系及保持系較少，雜交組合的選擇自由度低。兩系法育性轉換溫度偏高或不穩定而導致的育性波動是制約其可持續發展的關鍵。目前，光溫敏核不育系的不育基因資源來源相對單一，需要發掘更多的光溫敏核不育系，拓寬光溫敏不育系種質的遺傳基礎。最近的研究表明，一些水稻花粉育性調控基因的弱等位突變體表現為溫敏不育，這為兩系法雜交水稻的發展提供了新的思路［70-72］。
智能不育系在理論創新和技術儲備上都已達到實用化的程度。由于水稻種子有穎殼包裹，常用的紅色熒光篩選機制在水稻中的精準度并不理想，容易在普通核不育系中混入含轉基因成分的保持系種子。另外，熒光分選機械的分選效率較低、操作復雜。因此，研發一臺高精度、高效率、操作簡便的分選機械是推動以熒光分選為基礎的智能不育系系統發展的基礎。除了熒光分選機制以外，其他篩選機制例如基于種子重量和除草劑抗性等也是在構建NMS系統時的優良選擇。其中種子重量的變化對后代發育是否有影響還需進一步研究，而除草劑的使用在田間生產中較為常見，不會影響水稻產量，且在苗期就可以實現分選。施用化學藥劑使雄性不育株恢復育性是創制不育系的創新思路，但化學復雄如何能不影響雜交后代種子的發芽率以及藥劑殘留是否會對人體健康產生影響，這都是需要考慮和解決的問題。
一系法的發展，是科學與工程結合的典范。基因編輯手段的創新和作物功能基因組學的發展，使成功培育一系法雜交水稻逐漸成為可能。當前，MiMe體系已經非常成熟，獲得不重組的二倍體配子的效率達到 100%。孤雌生殖基因的發掘及改良（比如與MiMe結合后的實際效應）是一系法雜交水稻研究的重點。已有研究指出，克隆種子的比例與結實率存在負相關關系，且克隆種子比例在代際之間存在不穩定的現象［69］。這些是一系法走向商業化應用需要解決的問題。
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