黃瓜枯萎病拮抗昆蟲共生菌的篩選及抑菌機制初步研究

摘要：為篩選新的防治黃瓜枯萎病的生防菌資源。從昆蟲體表及體內分離昆蟲共生細菌，采用對峙法、生長速率法和盆栽法對分離的細菌進行抑菌活性測定，篩選出具有較強抑菌活性的昆蟲共生菌，并對其抑菌機制進行初步研究。結果表明，從蠐螬和蟬幼蟲體表及體內共分離得到104株細菌，獲得2株抑菌活性較好的昆蟲共生細菌QC02和QC04，其發酵液對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumebrium）的抑制率分別為56.03%、51.17%，盆栽防效分別為44.00%、47.00%；經過初步鑒定，菌株QC02和QC04分別為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。2株共生細菌發酵濾液可顯著抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長、孢子萌發，并且可產生纖維素酶、葡聚糖酶、幾丁質酶等多種胞外酶，含有表面活性素、伊枯草菌素、豐原素等脂肽類抗生素相關基因。結果表明，菌株QC02和QC04在防治植物病害方面具有較好的應用潛力。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；多黏類芽孢桿菌；黃瓜枯萎病；抑菌活性；生防菌

中圖分類號：S436.421.1₊3" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0143-08

收稿日期：2023-11-14

基金項目：天津市科技計劃項目（編號：21ZYCGSN00520）。

作者簡介：葉 敏（1996—），男，江蘇常州人，碩士研究生，從事微生物源農藥研究與應用。E-mail：3080508568@qq.com。

通信作者：田小衛，博士，副教授，從事微生物源農藥研究與應用。E-mail：1267542@qq.com。

尖孢鐮刀菌在十大植物病原真菌中排名第五，可以引起多種植物的土傳病害，而黃瓜枯萎病是其中較為嚴重的一種，發病率一般為10%～30%，嚴重時可達70%，可以導致黃瓜幼苗死亡、減產并導致巨大的經濟損失^［1-2］。防治黃瓜枯萎病的方法多樣，包括培育抗病品種、嫁接、種子和土壤消毒、輪作或休耕、使用化學農藥及利用拮抗微生物進行生物防治。其中，常用和有效的方法是使用化學殺菌劑，但使用不當會造成環境污染、病原菌抗藥性增強以及農藥殘留威脅人類健康等嚴重問題^［3-4］。生物防治是一種環境友好型的防治方法，包括使用拮抗微生物、非致病性的病原菌以及其他可以激活寄主植物對病原體抗性的微生物及其制劑^［5］。

具有良好防效的菌株是生物防治重要的種質資源，擴展篩選范圍是獲得這些菌株的重要途徑。為了尋找對黃瓜枯萎病有良好生物防治潛力的微生物，大量有潛力的菌株從植物根際、植物體內和海洋中分離和篩選出來^［6-8］。而從動物體內篩選的案例較少，尤其是從與植物有復雜相互作用的昆蟲體內獲得生防微生物的情況較少^［9］。昆蟲消化道和表皮具有特殊的微生境，其中的微生物多種多樣，可以產生多種功能的生物活性物質^［10-13］。研究發現，昆蟲共生微生物對植物病害具有生物防治功能。例如，從以色列葡萄黃化病媒介昆蟲Hyalesthes obsoletus中分離得到的1株Dylla樣細菌可以內生定殖葡萄緩解植原體引起的葡萄黃化病^［14］。因此，動物源微生物也是生防微生物資源開發的重要方向之一。

本研究針對土傳真菌性病害黃瓜枯萎病，首次從地下昆蟲蠐螬和蟬幼蟲體表和腸道內分離篩選具有良好生物防治潛力的菌株，并初步探討了其抑菌機制，為挖掘防治土傳真菌性病害的昆蟲共生細菌提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 共生細菌分離材料

分離材料為蠐螬和蟬幼蟲。蠐螬于2022年7月采集于安徽省蚌埠市禹會區高埂村（32°49″40′N，117°22″15′E）土壤中，而蟬幼蟲于2022年8月采集于天津農學院東校區欒樹林（39°5″31′N，117°6″2′E）。所有樣品采集與處理過程中均佩戴手套操作。

1.1.2 供試病原菌

抑菌活性供試病原菌有尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、草莓疫霉菌（Phytophthora fragariae）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、茄鏈格孢菌（Alternaria solani）、蘿卜鏈格孢菌（Alternaria raphani）、蘋果殼囊孢菌（Cytospora mali），均保存于天津農學院植物病理實驗室。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨固體（NA）培養基用于共生細菌的分離培養，牛肉膏蛋白胨液體（NB）培養基用于共生細菌發酵；常規和濃縮馬鈴薯葡萄糖固體（PDA）培養基用于病原真菌培養和抑菌活性測定，濃縮配方如下：去皮馬鈴薯20%、葡萄糖2%和瓊脂1.8%。

1.2 試驗方法

1.2.1 昆蟲共生細菌的分離

體表附生菌分離：使用無菌蒸餾水（SDW）沖洗昆蟲表面3次，去除表面的瞬時微生物，然后使用無菌濾紙擦干表皮。使用無菌棉拭子擦拭昆蟲背部、腹部各20次，每個拭子頭浸泡在10 mL 0.85%氯化鈉溶液中并渦旋。

腸道內生細菌分離：蠐螬和蟬幼蟲腸道解剖后置于研缽中，加入生理鹽水研磨。使用相同的溶液分別將昆蟲拭子浸泡液和腸道研磨液稀釋100、1 000倍，取100 μL稀釋液涂布到NA平板上，37 ℃培養24 h。挑取具有明顯特征的菌落，純化2次后4 ℃保存。

1.2.2 拮抗細菌的篩選

采用對峙法篩選對黃瓜枯萎病菌具有抑菌活性的細菌。將細菌接種至NB培養基于37 ℃、220 r/min振蕩培養24 h。從培養 4 d 的黃瓜枯萎病菌上挑取直徑6 mm的菌絲塊放置PDA平板的中心，將20 μL 10₉ CFU/mL細菌發酵液劃線涂布于距離菌絲塊2 cm處，28 ℃黑暗培養 4 d。試驗重復3次。菌絲生長的抑制率（GI）計算公式為：GI=［（R - r）/R］×100%；其中，R表示細菌遠端的真菌菌落徑向距離，r表示細菌近端的真菌菌落徑向距離。

1.2.3 對其他植物病菌的抑菌活性測定

采用生長速率法，測定對黃瓜枯萎病菌具有拮抗作用的細菌。將具有活性的細菌發酵后，發酵液采用 0.22 μm 濾芯過濾后按1 ∶5（體積比）加入融化降溫的PDA培養基中混勻并倒平板。將培養好的病原菌打成直徑為6 mm的菌餅倒接于平板中，使有菌絲面朝下。28 ℃恒溫培養72 h后檢查結果，測定菌落直徑，計算抑制率。

1.2.4 盆栽試驗 對黃瓜種子表面消毒后，浸入50～60 ℃溫水中5～6 h，然后播種至含有營養土的盆缽中，待幼苗生長至2葉期接種黃瓜枯萎病菌，孢子濃度為10₇ CFU/mL。

預防處理：將2葉期的黃瓜幼苗從盆缽中取出，使用消毒后的剪刀輕微傷根。使用50 mL 10₈ CFU/mL 拮抗細菌發酵液進行土壤灌根處理。在用細菌處理72 h后，灌根接種30 mL黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液。

治療處理：對2葉期黃瓜幼苗傷根后，使用 30 mL 黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液灌根。72 h后，使用50 mL 10₈ CFU/mL細菌發酵液灌根。使用無菌蒸餾水代替細菌發酵液作為對照。將黃瓜植株置于25 ℃溫室中培養。每個處理5株黃瓜，重復4次。

接種處理后14、21 d，參考Cao等的方法評估每種植物的外部癥狀：0級，無枯萎或黃化；1級，子葉黃化；2級，子葉萎蔫；3級，第1張真葉枯萎；4級，第2～3張真葉枯萎；5級，所有葉片枯萎或死亡^［15］。疾病嚴重程度指數（DSI）：DSI =∑ （等級×該等級的植物數量）/（5×評估植物總數）×100。相對防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%。

1.2.5 拮抗細菌對病原菌的影響

對菌絲生長的抑制：如“1.2.3”節中所述制備細菌發酵濾液，與濃縮PDA培養基混合稀釋成2、4、6、8倍并倒平板。在平板中心接種直徑6 mm的黃瓜枯萎病菌菌絲塊，28 ℃黑暗培養。使用馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）代替發酵濾液作為對照，每個處理重復3次。4 d后觀察并測量黃瓜枯萎病菌菌落直徑，計算抑制率。

對分生孢子萌發的抑制：如“1.2.3”節中所述制備細菌發酵濾液，使用PDB稀釋2、4、10倍。將100 μL 10₆ CFU/mL黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液離心取沉淀，加入100 μL細菌發酵濾液，混勻后28 ℃孵育24 h。使用PDB培養基作為對照，每個處理重復3次。通過光學顯微鏡觀察100個分生孢子的萌發情況計算孢子萌發率。

對菌絲形態的影響：觀察細菌處理后的黃瓜枯萎病菌的菌絲形態變化，使用稍加修改的載玻片培養技術^［16］。向裝有載玻片的培養皿中倒入融化的馬鈴薯葡萄糖固體培養基，厚度超過載玻片1 mm。待平板冷卻凝固后，在平板底面標記出載玻片中心點作為黃瓜枯萎病菌接種位置，從這一點向兩邊偏移1 cm處標記出細菌接種位置和對照點。挑取黃瓜枯萎病菌菌絲接種在中心點，在細菌接種位置接種2 μL 10₉ CFU/mL細菌發酵液，干燥后于28 ℃培養。待病原菌菌落邊緣生長接近對照點，取出載玻片并使用0.01%臺盼藍-乳酸苯酚溶液或0.5%中性紅溶液染色病原真菌，使用光學顯微鏡觀察病原真菌菌絲形態變化。

1.2.6 生防相關基因和胞外酶的檢測

采用特異性引物（表1），對拮抗細菌基因組中編碼伊枯草菌素、桿菌肽、豐原素、多黏菌素、殺鐮孢菌素等脂肽類抗生素和Yndj蛋白、表面活性素、纖維素酶、葡聚糖酶等抑菌代謝物的生物合成基因進行檢測^［17-18］。擴增體系（25 μL）：ddH₂O 8.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板2.0 μL、2×Easy Taq MasterMix（+Dye） 12.5 μL。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用表1中的前6對引物分別對QC02進行PCR擴增，擴增條件為預變性94 ℃ 4 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s（引物110F/110R、147F/147R、ITUCF1/ITUCR3、ituD2F/ituD2R、bamC2F/bamC2R）或60 ℃ 30 s（引物ysnEf/ysnEr），72 ℃延伸1 min，30個循環；再72 ℃延伸10 min。使用表中的后8對引物分別對QC04進行PCR擴增，擴增條件為預變性94 ℃ 4 min；變性 94 ℃ 40 s，退火56 ℃ 40 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；再72 ℃延伸10 min。

通過胞外酶檢測平板檢測拮抗細菌分泌的生防功能胞外酶^［19-24］。細菌37 ℃、220 r/min過夜培養，分別取5 μL發酵液滴加或劃線接種在纖維素酶、葡聚糖酶、蛋白酶、幾丁質酶、果膠酶和淀粉酶檢測平板上，2 d后觀察是否有透明圈產生。

1.2.7 菌株鑒定

使用EasyPure@ Bacteria Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術有限公司），按照說明書提取拮抗細菌基因組。使用NanoDrop 1 000 UV-VIS超微量紫外分光光度計測定基因組DNA的濃度和純度，并將濃度調整為50.0 ng/μL。利用細菌通用引物27F和1492R擴增拮抗細菌的16S rDNA，約1 400 bp。擴增體系與“1.2.6”節相同。擴增條件為預變性94 ℃ 4 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；再72 ℃延伸10 min。擴增產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶單一后送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用BLAST程序與NCBI GenBank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的序列進行比對分析。選擇合適的比對序列，通過MEGA 7.0軟件進行Clustal W對齊，利用鄰接樹法構建系統發育樹。

1.3 數據處理

使用R 4.1.2進行單因素方差分析，應用Duncan’s新復極差法進行各試驗組間差異顯著性檢驗（ɑ=0.05）。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選

從昆蟲樣品中共分離出共生細菌104株，包括50株蠐螬腸道內生細菌、41株蟬幼蟲腸道內生細菌和13株蟬幼蟲表皮附生細菌。通過對峙培養篩選出2株拮抗活性較強的菌株QC02和QC04，均為蠐螬腸道內生細菌，對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制率分別為56.03%、51.17%（圖1）。

由圖2可知，菌株QC02和QC04具有廣譜的抑菌活性，對供試的8種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，對蘋果腐爛病菌的抑菌活性最強，抑制率分別為73.02%、68.94%。

2.3 盆栽試驗

菌株QC02和QC04對黃瓜枯萎病的盆栽防治效果如表2所示。感染黃瓜枯萎病菌的黃瓜植株在接種后14 d發病嚴重，呈現泛黃和枯萎癥狀，21 d全部枯萎。菌株QC02治療和預防處理的黃瓜在接種后21 d的相對防效分別為35.00%和44.00%，而菌株QC04治療和預防處理的黃瓜在接種后21 d的相對防效分別為27.00%和47.00%。總體來看，菌株QC02對黃瓜枯萎病的治療效果最好，菌株QCO4預防處理后可有效緩解黃瓜枯萎病的發生。

2.4 拮抗細菌對黃瓜枯萎病菌的影響

2.4.1 對菌絲生長的影響

稀釋2倍的菌株QC02和QC04發酵濾液可抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長，抑制率分別為85.19%、57.20%（圖3）。隨著稀釋倍數的增加，病原菌菌絲生長抑制率下降，稀釋8倍的菌株QC02發酵濾液的抑菌率仍可達45.76%。

2.4.2 對孢子萌發的影響

稀釋2倍的菌株QC02發酵濾液對黃瓜枯萎病菌孢子萌發具有較強的抑制效果，抑制率為70.51%，而菌株QC04發酵濾液的抑制率僅為27.90%（圖4）。隨著稀釋倍數的增加，菌株QC02發酵濾液的抑制率下降，稀釋10倍后與菌株QC04發酵濾液抑制率無顯著差異。

2.4.3 對菌絲形態的影響 菌株QC02（圖5-A、圖5-B）和QC04（圖5-C、圖5-D）對峙培養的黃瓜枯萎病菌菌絲變細、縮短和變形。靠菌株QC04一側的菌絲被臺盼藍染成藍色，中性紅染成微紅色，表明菌株QC04對黃瓜枯萎病菌具有殺菌活性而不是抑菌活性。

2.5 生物防治相關基因及酶的檢測

應用特異性引物，對菌株QC02和QC04基因組進行PCR擴增。擴增結果表明，菌株QC02具有表面活性素、Yndj蛋白、伊枯草菌素、桿菌肽、豐原素和IAA合成酶基因，菌株QC04具有多黏菌素、殺鐮孢菌素、纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶酶等生防物質合成酶基因（圖6）。通過胞外酶檢測培養基上透明圈的觀察發現2種細菌可分泌葡聚糖酶、纖維素酶、幾丁質酶、蛋白酶和淀粉酶等重要的真菌細胞壁降解酶（圖7）。

2.6 昆蟲拮抗共生細菌的鑒定

菌株QC02和QC04的16s rDNA序列經NCBI數據庫BLAST比對，與芽孢桿菌屬物種相似性達99.7%，構建系統發育樹結果表明，2株細菌分別與貝萊斯芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌屬菌株聚在同一分支（圖8）。因此，將菌株QC02和QC04初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

3 討論與結論

本研究從蠐螬腸道中篩選出的細菌QC02和QC04對黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、小麥根腐病菌、黃瓜灰霉病菌、草莓灰霉病菌、番茄早疫病菌、蘿卜黑斑病菌和蘋果腐爛病菌等8種病原真菌表現出較強的拮抗活性，抑菌率在50%以上。經初步鑒定，菌株QC02和QC04分別屬于貝萊斯芽孢桿菌和多黏類芽孢桿菌。

芽孢桿菌的抑菌活性與其代謝產物具有密切的聯系，許多芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等可通過非核糖體途徑產生各種脂肽類抗生素抑制病原真菌^［25-26］。例如，解淀粉芽孢桿菌SQR9產生豐原素和桿菌肽可有效防治黃瓜枯萎病^［27］。通過PCR檢測，發現菌株QC02和QC04具有多種脂肽類抗生素合成相關基因。除此之外，分泌胞外酶在芽孢桿菌破壞真菌細胞壁發揮抑菌作用的過程中起到重要作用。Yang等從油菜根際土壤中篩選得到的多黏類芽孢桿菌HX-140可以產生蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶和抗真菌揮發性有機化合物，有效降低黃瓜枯萎病55.6%的侵染率^［28］。多黏類芽孢桿菌P.SC09-21菌株能產生抑制辣椒疫霉的蛋白酶，且處理后黃瓜的PR蛋白基因cap4和CaChi2的表達水平也有所提高^［29］。納豆芽孢桿菌tk-1脂肽類生物表面活性劑被證明在抗腫瘤、抗菌、抗凝和降膽固醇方面效果顯著^［30］。本研究篩選的菌株QC02和QC04均可產生纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶，能夠抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發，其作用機制及代謝產物還需進一步分析和研究。

盆栽試驗結果表明，使用菌株QC02和QC04發酵液的預防效果分別為44.00%、47.00%，與已報道的幾種生防菌株防效相似或者更高。以Streptomyces albospinus CT205菌為例，2011年和2012年的黃瓜枯萎病防治效果分別為8.7%和51.9%^［31］。菌株QC02的治療效果超過QC04，這與其發酵液對黃瓜枯萎病菌的抑制作用相一致。另外，相關研究發現多黏類芽孢桿菌WLY78產生的殺鐮刀菌素能夠激活黃瓜的系統抗性^［32］。菌株QC04的預防效果超過QC02，可以推測QC04生防效果不僅與發酵液抑菌活性相關，而且與其誘導植物系統抗性相關。因此，菌株QC04對黃瓜的誘導抗性有待進一步研究。

本研究篩選的2株昆蟲共生細菌對黃瓜枯萎病的防治均有一定的效果，后期可通過發酵條件優化、作用機制及制劑研制等方面進行深入研究，充分挖掘菌株的深層生防潛力，有望進一步研發生防菌劑應用于黃瓜生產中。

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