腫瘤微環境下腫瘤轉移相關蛋白1在食管鱗癌上皮細胞間質化和轉移機制研究

【摘要】目的 探究腫瘤微環境（TME）下腫瘤轉移相關蛋白1（MTA1）表達情況及其在食管鱗癌上皮細胞間質化（EMT）和轉移機制，為今后臨床治療食管鱗癌提供思路。方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）技術測定并比較人正常食管上皮細胞及不同類型食管鱗癌細胞中MTA1 mRNA表達情況；選擇表達量最高的食管鱗癌細胞株用于構建敲低MTA1表達的食管鱗癌細胞系KYSE410細胞（siMTA1組），同時構建正常MTA1表達的KYSE410細胞（siNC組）；分析TME培養對siMTA1組與siNC組KYSE410細胞中MTA1 mRNA表達的影響；在TME培養下，采用超敏型細胞增殖檢測試劑（CCK-8）檢測siMTA1組與siNC組KYSE410細胞增殖情況；Transwell小室試驗檢測siMTA1組與siNC組KYSE410細胞侵襲與轉移情況、RT-qPCR法檢測siMTA1組與siNC組KYSE410細胞EMT上皮性鈣黏附蛋白（E-cad）、神經型鈣黏附蛋白（N-cad）mRNA相對表達量。結果 食管鱗癌細胞株（KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450）的MTA1 mRNA表達量均高于人正常食管上皮細胞HET-1A，且KYSE410細胞株表達量最高；常規培養、TME下siNC組MTA1 mRNA相對表達量均高于siMTA1組；與常規培養比，TME培養下siNC組、siMTA1組MTA1 mRNA相對表達量均較高；TME培養條件下，siNC組KYSE410細胞侵襲數量、轉移數量均高于siMTA1組；TME培養條件下，siNC組KYSE410細胞EMT相關分子

E-cad mRNA相對表達量低于siMTA1組，N-cad mRNA相對表達量高于siMTA1組（均Plt;0.05）。結論 食管鱗癌細胞中MTA1 mRNA表達量較人正常食管上皮細胞明顯增加，且相較于常規培養條件，TME培養條件下會顯著促進MTA1的表達，MTA1的敲低明顯調節EMT相關分子的表達，抑制KYSE410細胞的增殖、侵襲、轉移。

【關鍵詞】腫瘤微環境 ; 腫瘤轉移相關基因1 ; 食管鱗癌 ; 上皮細胞間質化

【中圖分類號】R735.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.24.0001.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.24.001

食管癌在消化系統惡性腫瘤中占有重要地位，其中食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是國內最常見的組織學類型[1]。對于早期ESCC患者，手術切除往往能帶來較好的治療效果，然而，晚期ESCC患者面臨的主要問題是術后復發和癌細胞的擴散，這些因素是導致患者死亡的主要原因之一[2]。惡性腫瘤的一個關鍵特性是其侵襲和轉移的能力，腫瘤轉移相關蛋白1（MTA1）作為一種與腫瘤轉移密切相關的基因，已經在多種腫瘤中（包括ESCC）觀察到，其高表達與腫瘤的侵襲性和血管生成密切相關。在缺氧、炎癥及腫瘤微環境（TME）等病理條件也能增強MTA1的表達[3]。此外，在TME中，多種因素，如細胞因子、生長因子、缺氧和免疫細胞等都可以誘導上皮間質轉化（EMT）的發生，而EMT這一過程可促進腫瘤的侵襲和轉移[4]。由此可見，在TME刺激下，MTA1可能通過對ESCC細胞的EMT與遷移過程而產生的影響，在ESCC細胞轉移中發揮重要作用。基于此，本研究通過模擬體外TME，檢測食管鱗狀細胞MTA1 mRNA表達量，細胞增殖、侵襲、轉移能力及EMT相關分子的表達情況，探討MTA1對ESCC細胞EMT和轉移影響的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人正常食管上皮細胞HET-1A（上海博古生物技術有限公司）；ESCC細胞株KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450（中國科學研究院細胞資源中心）。所有細胞分別培養在Dulbecco改良Eagle（DMEM）培養基中，培養條件是37 ℃、5% CO2的濕化培養箱。

1.1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養基（TOYOBO）；Lipofectamine 2 000轉染試劑（美國英杰生命技術有限公司）；MTA1敲低質粒（siMTA1）（用于抑制MTA1表達）和陰性對照質粒（siNC）（上海吉瑪基因公司）；TRIzol試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；反轉錄和qPCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；磷酸鹽（PBS）緩沖液、4%細胞固定液和1%結晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司）；Matrigel膠[西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]。

熒光定量PCR儀（美國伯樂公司，型號：CFX96 Touch）；凝膠成像系統（Thermo Fisher Scientific，型號：VersaDoc2000）；倒置光學顯微鏡（日本株式會社尼康，型號：Eclipse E600）；酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：Epoch2）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞RNA提取及RT-qPCR檢測MTA1 mRNA表達量 從中通過Trizol方法提取細胞總RNA后，進行反轉錄生成cDNA，這一過程遵循PrimeScrip反轉錄試劑盒。PCR反應體系根據SYBR Premix Ex TaqTM配制，具體步驟包括：⑴預變性步驟在75 ℃下進行，持續120 s；⑵變性步驟在90 ℃下進行，持續5 min；⑶退火步驟在60 ℃下進行，持續60 s；⑷延伸步驟在72 ℃下進行，持續30 s；⑷通過熒光定量PCR儀在40個循環中收集熒光信號。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）用作內參照基因，而MTA1 mRNA的相對表達量通過2-??CT方法計算，其引物序列為上游5'-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3'和下游5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。每個樣本獨立重復實驗3次。以相對表達量最高的細胞株（KYSE410）進行后續實驗。

1.2.2 敲低MTA1表達的KYSE410細胞系構建及培養 采用siRNA干擾技術，根據說明書分別將siNC、siMTA1與LipofectamineTM 2 000轉染試劑混合，然后分別將siNC轉染混懸液及siMTA1轉染混懸液轉染至KYSE410細胞，轉染后使用RT-qPCR檢測MTA1 mRNA的表達量，驗證敲低MTA1表達的KYSE410細胞是否構建成功。將構建成功的siNC、siMTA1 KYSE410細胞分別作為siNC組、siMTA1組，將對應細胞分別置于常規培養條件（DMEM培養基，37 ℃、20%氧氣、5%二氧化碳的濕化培養箱，pH=7.4）和TME培養條件（DMEM培養基，37 ℃、1%氧氣、5%二氧化碳、94%氮氣（N2）的濕化培養箱，3%氯化氫，pH值=6.5）下培養，分別培養24、48、72 h。

1.2.3 CCK-8實驗檢測siNC組、siMTA1組KYSE410細胞增殖能力 將1.2.2中培養的siNC組、siMTA1組KYSE410細胞稀釋，細胞密度為每100 μL含有5×103個，接種到96孔板中，每組設置3個復孔，并在周圍留有空白孔以防止液體蒸發，同時加入PBS緩沖液以保持濕潤。分別培養至12、24、48、72 h時進行檢測。在進行CCK-8細胞增殖實驗之前，向每個孔中加入110 μL的CCK-8工作液（由100 μL新鮮培養基和10 μL CCK-8原液混合而成）。細胞孵育2 h后，使用酶標儀在450 nm處測量吸光度值（OD 450 nm）。

1.2.4 Transwell小室檢測siNC組、siMTA1組KYSE410細胞侵襲及遷移能力 通過Transwell實驗來評估細胞的侵襲能力，siNC、siMTA1組細胞在不含胎牛血清的DMEM培養基中進行24 h的饑餓處理。接著，使用Matrigel膠（濃度為50 mg/L）涂覆Transwell小室的底部，然后在Transwell小室的下層加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基。將經過饑餓處理的細胞（每100 μL含有1×105個細胞）分別加入到Transwell小室中。培養24 h后，移除Transwell小室，用棉簽擦拭去除上層的細胞。隨后，用PBS緩沖液清洗小室外層的細胞，接著用4%的細胞固定液固定，再用1%結晶紫染液染色。對小室外層的細胞進行拍照并計數，選擇10個不同的視野，利用Image J軟件來計算穿透膜的細胞數量，以此作為細胞侵襲能力的指標。實驗重復3次，最終結果取平均值。在進行遷移實驗時，不添加基質膠，以檢測KYSE410細胞的遷移能力。

1.2.5 EMT相關分子表達量檢測 以GAPDH為內參檢測EMT相關分子上皮性鈣黏附蛋白（E-cad）、神經型鈣黏附蛋白（N-cad）的mRNA表達水平，檢測方法參照1.2.1中RT-qPCR檢測法。

1.3 統計學方法 使用SPSS 27.0統計學軟件分析數據，計量資料經S-W法檢驗證實符合正態分布且方差齊，以（ x ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同食管鱗癌細胞系中MAT1 mRNA相對表達量 MTA1在4種食管鱗癌細胞中的表達均高于人正常食管上皮細胞HET-1A，其中在KYSE410細胞中表達量最高，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表1。

2.2 TME培養對KYSE410細胞MTA1 mRNA表達的影響 常規培養、TME培養下siNC組MTA1 mRNA相對表達量均高于siMTA1組；與常規培養比，TME培養siNC組、siMTA1組MTA1 mRNA相對表達量均較高，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表2。

2.3 TME培養對siNC組、siMTA1組KYSE410細胞增殖能力的影響 siNC組、siMTA1組KYSE410細胞培養0、12、24、36、48、60、72 h的OD 450 nm值逐漸增大，且各個時間點siMTA1組均低于siNC，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表3；siMTA1組KYSE410細胞增殖曲線較siNC組更為平緩，見圖1。

2.4 TME下siNC組、siMTA1組KYSE410細胞侵襲、遷移能力及EMT相關分子表達量變化 Transwell小室實驗結果顯示，與siNC組比，siMTA1組KYSE410細胞通過matrigel 基質膠細胞侵襲數量、轉移數量均減少；

RT-qPCR實驗結果顯示，與siNC組比，siMTA1組KYSE410細胞E-cad mRNA相對表達量升高，N-cad mRNA相對表達量降低，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表4。

3 討論

MTA1與細胞轉移密切相關，多種上皮源性惡性腫瘤中常出現過量表達的現象。SU等[5]在大腸癌組織研究中發現，MTA1在癌組織中呈高表達，并且其高水平的表達與淋巴結的轉移情況呈現出明顯的正相關性。LIU等[6]的研究證實，當MTA1在食管上皮細胞或組織中的表達水平上升時，通常意味著癌變的發生。本研究通過對比人正常食管上皮細胞HET-1A、不同ESCC細胞株KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450中MTA1 mRNA表達量，發現MTA1在人正常食管上皮細胞中低表達，而在ESCC細胞株中的表達量顯著提高，與SU等、LIU等的研究結果相似，這意味著MTA1表達量的上升，可能對癌細胞的發生、轉移等有促進作用。

MTA1作為一種應激反應蛋白，其表達受到多種環境因素的影響，缺氧、炎癥及TME等損傷性條件均能促進MTA1的表達[7]。本研究發現，TME培養條件下MTA1的相對mRNA表達量高于常規培養。其原因可能與TME中的免疫細胞、基質細胞等多種因素密切相關，如腫瘤相關巨噬細胞（TAMs），可通過分泌細胞因子促進腫瘤細胞中MTA1的表達[8]；可見食管鱗癌的腫瘤微環境可促進MTA1表達。為了探究抑制MTA1表達對ESCC細胞增殖的影響，本研究在TME培養條件下敲低siMTA1表達，發現ESCC細胞增殖能力顯著下降。研究表明，通過脂質體轉染法將MTA1 siRNA轉染至人食管癌Eca109細胞，可以抑制MTA1基因的表達，從而抑制細胞的增殖，誘導細胞凋亡，其過程可能與下調增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白的表達、促進caspase-3蛋白的活化有關[9]。

此外，腫瘤細胞及其周圍的間質細胞分泌的信號分子能夠吸引并積累具有免疫抑制特性的細胞，從而構建出一個促進炎癥的微環境。這種持續的炎癥狀態通過多樣的生物學途徑刺激腫瘤干細胞樣特征的細胞的增長，并激活上皮 - 間質轉化EMT的過程[10]。EMT是一個多步驟的生物學過程，通常會導致上皮細胞間的聯系和黏附性降低，細胞失去頂端 - 基底極性，并獲得間充質細胞的特征，這使得癌細胞更有可能進行遷移和侵襲鄰近組織[11]。在這一過程中，與EMT相關的標志性分子會出現明顯的變化，如E-cad表達水平的下調，會導致細胞極性喪失，促使細胞轉變為間質狀態，利于細胞增強運動能力，從而增加細胞的收縮能力，提高腫瘤細胞侵襲力；N-cad的水平升高，促使細胞骨架發生重構，由皮質肌動蛋白向細胞質和基底的中間絲網絡轉變，這一變化進一步增強了腫瘤細胞的侵襲性和遷移能力[12]。ZHOU等[13]的研究證實，TME更有益于MTA1的表達，而MTA1表達量的提高，會促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移，也會下調E-cad、上調N-cad。本研究發現，與siNC組比，siMTA1組敲低MTA1的KYSE410細胞株中E-cad相對表達量升高，N-cad相對表達量降低，這表明MTA1能夠促進食管鱗癌細胞的EMT過程，這是癌細胞獲得遷移和侵襲能力的重要機制。

綜上， 食管鱗癌細胞中MTA1 mRNA表達量較人正常食管上皮細胞明顯增加，且相較于常規培養條件，TME培養條件下會顯著促進MTA1的表達，MTA1的敲低明顯調節EMT相關分子的表達，抑制KYSE410細胞的增殖、侵襲、轉移，但其具體的作用機制，還需深入探究，為今后臨床治療相關疾病提供更全面依據。

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