BALF Xpert MTB/RIF和 PCR-反向斑點雜交技術在涂陰肺結核診斷中的價值

【摘要】 目的：對比支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）結核分枝桿菌（MTB）/利福平（RIF）耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert MTB/RIF）和聚合酶鏈反應（PCR）-反向斑點雜交技術在涂陰肺結核診斷中的價值。方法：納入2021年6月—2023年1月于江西省胸科醫院接受治療的肺結核患者共200例，所有患者均留取BALF送檢，進行Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點雜交技術檢測。以病理檢查結果為金標準，統計確診涂陰肺結核的占比情況，并計算Xpert MTB/RIF與PCR-反向斑點雜交技術兩種檢測方法的陽性率、與金標準結果的一致性，并評估兩種檢測方法對涂陰肺結核的診斷價值。結果：Xpert MTB/RIF檢測涂陰肺結核的陽性率（76.50%）與PCR-反向斑點雜交技術（69.50%）比較，差異無統計學意義（字2=2.486，P=0.115）。200例肺結核患者中確診為涂陰肺結核有137例，占比68.50%；Xpert MTB/RIF的符合率（94.89%）高于PCR-反向斑點雜交技術（74.45%），差異有統計學意義（Plt;0.05）。Xpert MTB/RIF診斷涂陰肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度均高于PCR-反向斑點雜交技術（Plt;0.05）。結論：Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點雜交技術均可用于涂陰肺結核診斷中，其中Xpert MTB/RIF的診斷價值更高，可輔助臨床早期診斷篩查。

【關鍵詞】 支氣管肺泡灌洗液 結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術 PCR-反向斑點雜交技術 涂陰肺結核

Value of BALF Xpert MTB/RIF and PCR-Reverse Dot Blot Hybridization Technique in the Diagnosis of Smear Negtive Pulmonary Tuberculosis/LI Qiuhong， LI Zanhua， CHEN Yanling， WU Yuqing， CHEN Siyu. //Medical Innovation of China， 2024， 21（30）： 138-142

[Abstract] Objective： To compare the diagnostic value of Xpert Mycobacterium tuberculosis/Rifampicin （Xpert MTB/RIF） and polymerase chain reaction （PCR）-reverse dot blot hybridization technique in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） in smear negtive pulmonary tuberculosis. Method： A total of 200 patients with pulmonary tuberculosis who received treatment in Jiangxi Chest Hospital from June 2021 to January 2023 were included. All patients were retained BALF for inspection， and they were detected by Xpert MTB/RIF and PCR-reverse dot blot hybridization technique. Using the results of pathological examination as the gold standard， the proportion of confirmed smear negtive pulmonary tuberculosis was counted， and the positive rates of Xpert MTB/RIF and PCR-reverse dot blot hybridization technique were calculated， and the consistency with the gold standard results were calculated， and the diagnostic value of the two detection methods for smear negtive pulmonary tuberculosis were evaluated. Result： There was no significant difference in the positive rate of Xpert MTB/RIF （76.50%） in detecting smear negtive pulmonary tuberculosis compared with PCR-reverse dot blot hybridization technique （69.50%）

（字2=2.486， P=0.115）. Among 200 patients with pulmonary tuberculosis， 137 cases （68.50%） were diagnosed as smear negtive pulmonary tuberculosis. The coincidence rate of Xpert MTB/RIF （94.89%） was higher than that of PCR-reverse dot blot hybridization technique （74.45%）， the difference was statistically significant （Plt;0.05）. The sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value and accuracy of Xpert MTB/RIF were higher than those of PCR-reverse dot blot hybridization technique （Plt;0.05）. Conclusion： Both Xpert MTB/RIF and PCR-reverse dot blot hybridization technique can be used in the diagnosis of smear negtive pulmonary tuberculosis， among which Xpert MTB/RIF has a higher diagnostic value and can assist in early clinical diagnosis and screening.

[Key words] BALF Xpert MTB/RIF PCR-reverse dot blot hybridization technique Smear negtive pulmonary tuberculosis

First-author's address： Department of Respiratory Medicine， Jiangxi Chest Hospital， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.30.032

*基金項目：江西省衛生健康委科技計劃項目（202211258）

①江西省胸科醫院呼吸內科 江西 南昌 330006

②江西省胸科醫院結核科 江西 南昌 330006

通信作者：李贊華

肺結核屬于呼吸系統疾病的一種，因肺組織、支氣管、胸膜等部位受到結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致，具有較強傳染性，列為我國乙類傳染病。相關文獻統計，我國肺結核發病具有季節性和循環周期性，高密度地區和人群流動性較大的地區分布廣[1]。其起病緩慢，早期癥狀不明顯，部分患者屬于非活動性肺結核或潛伏感染，痰涂片檢測結果顯示涂陰性，不易診斷[2]。因此需提高臨床診斷準確性。常規檢查方式如鏡檢、病原菌培養均存在一定局限性[3]，且痰涂片無法有效區分MTB和非MTB，也無法區分菌體活性[4]。其次MTB培養耗時長，一般為6～8周，一定程度上會延誤診療時間。MTB/利福平（RIF）耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert MTB/RIF）與聚合酶鏈式反應（PCR）-反向斑點雜交技術作為新型的檢測技術，兼具耗時短、敏感度高的優勢。相關研究證實，支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）Xpert MTB/RIF對肺結核具有較高診斷價值[5]。PCR-反向斑點雜交技術也被臨床證實對痰標本中MTB藥性檢測效果顯著[6]。當前少有研究對以上兩種檢測方法診斷涂陰肺結核的價值進行對比分析。基于此，本研究擬對比分析PCR-反向斑點雜交技術和Xpert MTB/RIF對涂陰肺結核的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究樣本選自江西省胸科醫院2021年6月—2023年1月收治的200例肺結核的初診患者。（1）納入標準：①年滿18周歲，符合肺結核診斷標準[7]；②入組前未曾進行抗結核治療；③認知水平及精神正常。（2）排除標準：①既往接受肺部手術；②合并心、腎等重要器官功能不全；③包裹性胸腔積液，形成胸膜纖維板。納入的患者中男131例，女69例，平均（52.76±17.19）歲。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者或患者家屬知情同意本研究。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 用一次性無菌瓶收集BALF，每份標本要求收集20 mL左右，回收率大于等于30%。分別進行PCR反向點雜交檢測、Xpert MTB/RIF檢測。

1.2.2 Xpert MTB/RIF檢測 （1）吸取1 mL BALF，加入4%氫氧化鈉溶液與異丙醇，于渦旋振蕩器搖晃20 s，室溫下靜置約15 min，待充分液化后，吸取混合液2～4 mL，采用Xpert MTB/RIF檢測儀進行分析，評估樣本中MTB的載量、利福平耐藥存在性，所用試劑盒源于瑞典賽沛公司。（2）排除質量控制探針，當剩余探針數目≥2根出現熒光，則提示MTB感染。當MTB對利福平耐藥，所有探針不可同時出現熒光。

1.2.3 PCR-反向斑點雜交技術 （1）BALF的處理：若灌洗液中不含痰和血，僅需離心處理（轉速3 000 r/min，離心時間15 min），若灌洗液中含痰或血，則先進行液化處理，過程同Xpert MTB/RIF檢測，然后離心，設置參數同上，摒除上清液，取灌洗液1.2～1.5 mL離心（轉速12 000 r/min，離心時間5 min），吸取上清液，加入1 mL洗液充分混勻，離心處理（離心參數同上）。整個過程需密切關注顏色變化；之后吸取50 μL裂解液，與沉淀物一并混合搖勻，水浴加熱10 min，離心處理2 min，轉速同上，取上層清液，采用PCR擴增儀（江蘇圣極基因科技有限公司，蘇械注準20192221303）對目標DNA片段進行擴增。（2）根據靶基因序列，對MTB的rpoB基因進行定位，以此為模板獲取擴增引物，擴增得到382bp的DNA片段。（3）PCR擴增條件：A，150℃，擴增120 s→95 ℃，擴增600 s；B，95 ℃，擴增45 s→←64 ℃，1 min，20 cycles；C，95 ℃，擴增0.5 min→←56 ℃，擴增0.5 min→←68 ℃，45 s，30 cycles；D，68 ℃，擴增300 s。（4）嚴格按照說明書要求進行加樣、擴增、雜交、洗膜和顯色操作。（5）根據膜條上不同位點的顯示結果，得到相應病原菌。

1.2.4 金標準 根據《肺結核診斷和治療指南》[7]，至少三次痰涂片與一次結核菌培養為陰性，經支氣管或肺部組織病理檢查確診為涂陰肺結核（陽性）。

1.3 觀察指標

（1）比較兩種檢測方法的陽性率。（2）比較兩種檢測方法診斷涂陰肺結核的一致性。統計200例患者中被確診為涂陰肺結核的例數，與Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點雜交技術診斷結果進行一致性對比。（3）比較兩種檢測方法的診斷價值。分析Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點雜交技術對涂陰肺結核的診斷效果，計算敏感度、特異度、準確度等。

1.4 統計學處理

采用SPSS 24.0統計軟件進行分析。計數資料以率（%）表示，行字2檢驗；一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75，表明一致性較好，0.4lt;Kappa值lt;0.75，表明一致性中等，0lt;Kappa值≤0.4，表明一致性較差。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法的陽性率比較

200例患者中，經Xpert MTB/RIF檢測涂陰肺結核陽性153例，陰性47例，陽性率為76.50%；經PCR-反向斑點雜交技術檢測涂陰肺結核陽性139例，陰性61例，陽性率為69.50%。Xpert MTB/RIF檢測陽性率高于PCR-反向斑點雜交技術，但兩組比較，差異無統計學意義（字2=2.486，P=0.115）。

2.2 兩種檢測方法診斷結果與確診結果比較

200例肺結核患者中，金標準確診涂陰肺結核有137例，占比68.50%，其中Xpert MTB/RIF符合率為94.89%（130/137），Kappa值為0.627，PCR-反向斑點雜交技術符合率為74.45%（102/137），Kappa值為0.158。Xpert MTB/RIF符合率明顯高于PCR-反向斑點雜交技術，差異有統計學意義（字2=5.988，P=0.014）。

2.3 兩種檢測方法診斷涂陰肺結核的價值

Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑點雜交技術對涂陰肺結核均有一定診斷價值。Xpert MTB/RIF敏感度、特異度、準確度、陰性預測值及陽性預測值均高于PCR-反向斑點雜交技術（Plt;0.05）。見表1、表2。

3 討論

肺結核是一種因MTB感染引起的呼吸系統疾病，具有較強傳染性，能夠通過飛沫傳播，相關資料顯示，患者年齡、職業、病原學檢查結果均是影響延遲就診的重要因素[8]。截至2019年，全球約有1 000萬新發肺結核患者，我國新發與復發肺結核患者高達83.3萬例，且總體感染趨勢并未下降[9]。在早期階段，肺結核潛伏期較長，且缺乏特異性表現，經結核菌實驗室檢查，結果可能顯示為陰性，即涂陰肺結核，不僅會延誤治療，導致病情加重，還會形成傳染源，加大結核防控難度與潛在風險[10-11]。因此，盡早精準診斷涂陰肺結核對抗癆治療意義重大。對此臨床已有諸多研究，如耐藥基因檢測[12]、外周血單核細胞相關指標聯合T-SPOT.TB輔助檢測[13]等。本次研究主要探討PCR-反向斑點雜交技術及Xpert MTB/RIF檢測對涂陰肺結核的診斷價值。

相關研究表明，Xpert MTB/RIF檢測陽性率高于PCR-反向斑點雜交技術[14-15]。本研究中，兩種方法的檢測陽性率差異并無統計學意義，可能與病例數較少有關。Xpert MTB/RIF作為一種分子信標檢測方法，其通過檢測MTB中DNA特定基因序列，進而判斷是否存在MTB感染，相較于長時間的痰標本檢測，該方法僅需2 h即可獲得最終診斷結果，有研究證實Xpert MTB/RIF檢測還可用于評估RIF耐藥性[16-18]。本次研究中，200例肺結核患者中，確診為涂陰肺結核的患者共137例，占比68.50%，Xpert MTB/RIF檢測結果與金標準確診結果一致性高于PCR-反向斑點雜交技術。Xpert MTB/RIF檢測涂陰肺結核的特異度、敏感度等均較高，與前人結果一致[19]，故可判斷XpertMTB/RIF檢測較PCR-反向斑點雜交技術檢測具有更優的診斷價值。此外，近年來還有研究探討Xpert MTB/RIF檢測與抗酸染色等其他檢測聯合應用的價值[20]，由此可見Xpert MTB/RIF檢測具有廣泛應用前景。

綜上所述，Xpert MTB/RIF診斷涂陰肺結核的診斷效能高于PCR-反向斑點雜交技術，可作為涂陰肺結核的早期診斷方法。但目前其檢測價格偏高，期待價格更低廉，特異度、準確度更高的檢測方法出現。此外，本研究樣本量偏少，期待未來擴大樣本量，得出更精準的結論。

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（收稿日期：2024-08-09） （本文編輯：陳韻）