基于SSR標記的MCID法鑒定新疆地方梨品種及其遺傳多樣性分析

收稿日期：2023-11-18

基金項目：新疆維吾爾自治區天池博士計劃項目；新疆維吾爾自治區高校基本科研業務費科研項目（XJEDU2022P045）

作者簡介：畢清芮（1998-），女，新疆塔城人，碩士研究生，研究方向為果樹種質資源。（E-mail）bb957707@163.com

通訊作者：牛瑩瑩，（E-mail）1170791833@ qq.com

摘要： 為深入探究新疆地方梨品種的遺傳關系，本研究采用簡單重復序列（SSR）標記技術對28個新疆地方梨品種進行遺傳多樣性分析。同時，利用人工繪制品種鑒別示意圖（MCID）法建立品種鑒定圖（CID）。結果表明，新疆地方梨品種間遺傳差異較小，遺傳分化為中等程度。通過構建新疆地方梨品種的聚類樹狀圖，發現28個新疆地方梨具有較高的遺傳多樣性，遺傳相似性系數為0.52～0.98。群體結構分析結果表明，最佳群體群組數值（K）=3時新疆地方梨品種被劃分為3個組，各品種之間存在普遍的基因交流。采用MCID法構建新疆地方梨品種的CID圖譜，并驗證了該方法的有效性。本研究結果可為今后梨種質資源評價和利用提供理論依據。

關鍵詞： 梨；簡單重復序列（SSR）；遺傳多樣性；品種鑒定

中圖分類號： S661.2"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）10-1933-09

Identification of local pear cultivars in Xinjiang Uygur Autonomous Region by MCID method based on SSR markers and analysis of their genetic diversity

BI Qingrui¹， MA Xinyuan¹， XUE Yuran¹， FAN Guoquan²， WANG Shaopeng²， NIU Yingying¹

（1.College of Horticulture， Xinjiang Agricultural University/Research Center of Featured Fruit Trees， Urumqi 830052， China;2.Luntai Fruit Tree Resource Nursery， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Luntai 841600， China）

Abstract： To further explore the genetic relationship of local pear cultivars in Xinjiang Uygur Autonomous Region， the genetic diversity of 28 local pear cultivars was analyzed by simple sequence repeat （SSR） marker technology. At the same time， the cultivar identification diagram （CID） was established by manual cultivar identification diagram （MCID）. The results showed that the genetic differences among the local pear cultivars in Xinjiang Uygur Autonomous Region were small， and the genetic differentiation was moderate. By constructing the clustering tree diagram of local pear cultivars in Xinjiang Uygur Autonomous Region， it was found that 28 local pear cultivars had high genetic diversity， and the genetic similarity coefficient ranged from 0.52 to 0.98. The results of population structure analysis showed that the local pear cultivars in Xinjiang Uygur Autonomous Region were divided into three groups when the best group value （K） was three， and there was a general gene exchange among cultivars. The CID of Xinjiang local pear cultivars was constructed by MCID method， and the effectiveness of the method was verified. The results of this study provide a theoretical basis for the evaluation and utilization of pear germplasm resources in the future.

Key words： pear；simple sequence repeat （SSR）；genetic diversity；cultivars identification

梨屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomoideae）梨屬（Pyrus SPP.），目前得到分類學認可的梨屬植物約30種^[1]。中國是梨屬植物的重要起源地之一，擁有豐富的種質資源儲備。這些種質資源在中國得到了廣泛的研究和應用。新疆是梨屬植物的原生分布地之一，新疆梨、白梨、秋子梨、杏葉梨、西洋梨、杜梨、木梨及褐梨都是新疆地方梨品種 ^[2]。隨著果樹生物信息學技術和分子生物學技術的不斷進步，育種工作者在果樹遺傳多樣性研究、品種鑒定、功能基因定位與注釋、基因圖位克隆及遺傳圖譜構建等方面取得了極大的研究進展，為梨的分子育種奠定了良好的基礎。

簡單重復序列（SSR）標記技術由Zietkiewicz等首次開發，具有數量豐富、多態性高、操作簡便快捷、結果穩定等優點，這種標記技術能夠直接揭示DNA分子水平上的差異，而且不受環境因素的影響^[3]。研究結果表明，SSR標記技術對植物遺傳多樣性、親緣關系、植物分類、種質資源鑒定、物種進化及基因精細定位等研究具有重要意義。SSR在基因組中隨機分布，并且數量多、重復性好、多態性豐富，在葡萄^[4]、杏^[5]、柑橘^[6]、梨^[7]、李^[8]、核桃^[9]等遺傳變異程度較高的植物上均已廣泛應用。為了解決品種鑒定的問題，Wang等^[10]于2011年開發出一種基于DNA標記的植物品種快速鑒定方法-人工繪制品種鑒別示意圖（MCID）法，該方法僅需幾對引物就能鑒定多個品種，該方法是對當前DNA標記信息分析方法的改進，它充分展現了DNA標記在植物品種鑒定中的獨特優勢。目前，MCID法已被應用于葡萄^[11]、柿^[12]、茶樹^[13]、蘋果^[14]等植物品種鑒定工作中，為植物的品種鑒定提供了有效的手段。目前利用SSR分子標記鑒定梨品種的研究較多^[15-17]，而MCID法的應用較少。

本研究擬以公開發表的碭山酥梨基因組為參考，對28份新疆地方梨種質資源的基因組重測序數據進行匹配。同時開發SSR標記，對28個新疆地方梨品種進行多樣性研究，通過MCID法建立品種鑒別圖（Cultivar identification diagram，CID）。本研究結果可為梨種質資源的鑒定、保護和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

如表1所示，選取28個新疆地方梨品種。所有品種來自新疆農業科學院輪臺果樹資源圃，春季梨樹展葉后，采集新鮮葉片，采用硅膠干燥劑保存葉片。

1.2 梨基因組DNA提取

利用試劑盒（天根生化科技有限公司產品，貨號DP360）提取梨幼葉中DNA。提取的DNA置于-20 ℃保存備用，采用1%瓊脂糖凝膠檢驗DNA質量。

1.3 SSR位點搜索與引物設計

利用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）軟件 ^[18]將干凈數據（Clean data）比對到參考基因組序列上，使用Primer3（http：//www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/Primer3）進行引物設計，用Oligo5.0軟件（http：//www.oligoarchitect.com/）對引物進行評估^[19]。引物合成由上海生物工程股份有限公司完成。

1.4 PCR擴增與產物的檢測

從17 216條引物中隨機挑選104條引物，用于PCR擴增，PCR擴增產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.5 利用SSR標記技術分析遺傳多樣性指標及分化

使用二進制的方式構建（0，1）矩陣，通過Datatrans 2007宏程序 ^[20]轉換數據格式，并采用POPGENE version2.0 ^[21]和GenAlEx 6.50軟件 ^[22]對基因型數據進行計算分析。分析指標包括觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s基因多樣性指數（H）以及Shannon’s多樣性指數（I）和固定指數（F）。利用PowerMarker ver 3.25 ^[23]進行雜合度和多態信息含量（PIC）分析，同時確定了最小等位基因頻率（MAF）和遺傳多樣性。最后，利用NTSYS-pc程序中的UPGMA（Unweighted pair-group method with arithmetic means）生成系統樹^[24]。利用STRUCTURE2.3.4^[25]分析最佳群體群組數值（K），從K=2運行到K=10，每次運行迭代10次。最佳K值使用在線工具Structure Harvester（https：//taylor0.biolo gy.ucla.edu/structure Harvester）估算。

1.6 利用SSR標記技術構建CID圖譜

用100對引物擴增梨基因組DNA，選取擴增出的條帶分辨率高、重復性好的10對引物，將清晰、多態性好的條帶用于品種鑒定，采用上述10對引物引物用于PCR擴增。

使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，在DYCZ-30型電泳槽中電泳，電壓200 V，電流100 mA，電泳90 min。通過銀染顯色，并拍照記錄凝膠圖像。條帶清晰，多態性好的引物被用于品種鑒定。當某個引物的指紋圖譜中存在特定條帶時，將其單獨分離出來，并將具有相同條帶模式的品種歸為同一亞群。隨著越來越多的具有多態性特異引物的應用，直到最后一個品種被成功分離。

1.7 MCID可重復性檢驗

參照劉更森 ^[14]的方法，隨機選擇3組梨品種驗證MCID的可重復性。

2 結果與分析

2.1 SSR位點分布及特點

在梨基因組序列中共搜索到43 310個SSR位點，其中，單核苷酸重復的SSR位點有4種，二核苷酸重復的SSR位點有12種，三核苷酸重復的SSR位點有60種，四核甘酸重復的SSR位點有180種，五核苷酸重復的SSR位點有387種，六核苷酸重復的SSR位點有778種。6種SSR類型中，單核苷酸重復的SSR有20 621個，占總SSR的47.61%；二核苷酸重復的SSR位點有14 419個，占總SSR的33.29%；三核苷酸重復的SSR有3 538個，占總SSR的8.17%；四核苷酸重復的SSR有2 414個，占總SSR的5.57%；五核苷酸重復的SSR有1 212個，占總SSR的2.80%；六核苷酸重復的SSR有1 106個，占總SSR的2.55%（圖1）。

2.2 SSR標記開發及多態性分析

采用Primer3.0軟件進行引物批量設計，共得到引物61 621對，對基因型與參考基因組存在差異的SSR標記進一步篩選，得到17 216對，從中隨機選擇均勻分布在17條染色體的104對SSR引物合成。如圖2所示，用碭山酥梨DNA模板進行篩選，其中100對引物顯示出了多態性，引物多態性占比為96.15%。

2.3 遺傳多樣性及UPGMA聚類分析

如表2所示，以條帶清晰、重復性好為原則篩選10對引物。10對引物的觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s基因多樣性指數（H）及Shannon’s信息指數（I）的平均值分別為2.000、1.540、0.326、0.496。全基因組SSR標記的最小等位基因頻率（MAF）的平均值為0.771，遺傳多樣性平均值為0.320，多態性信息含量（PIC）平均值為0.260，固定指數（F）的平均值為0.169，說明28個品種間的遺傳分化為中等程度。如圖3所示，利用NTSYS-pc2.0軟件構建了28個梨品種的聚類圖，遺傳相似性系數（GS）為0.52～0.98，表明梨品種具有較高的遺傳多樣性。當遺傳相似系數為0.52時，28個品種被分為2類，第1類包括26個品種，第2類包括耐西普特和庫爾勒香梨2個品種。在第1類中，分類存在分歧的可特阿木特在遺傳相似系數為0.72時與其他品種分開，表明該品種在遺傳進化的過程中與新疆梨和西洋梨發生基因交流的程度較小。當GS為0.95左右時，句句梨與綠梨聚為一類。遺傳相似系數為0.85左右時，奎可阿木特1號與伊犁紅句句梨、庫車阿木特聚為一類；當GS為0.91左右時，奎可阿木特1號與伊犁紅句句梨、庫車阿木特分離。當GS為0.80左右時，莎車晚香紅與黑酸梨、庫爾勒黃酸梨聚為一類；當GS為0.89左右時，黑酸梨與庫爾勒黃酸梨聚為一類，莎車晚香紅單獨成一類。當GS為0.92時，分類存在分歧的艾溫切可與歸屬于新疆梨系統的莎車耐西普特聚為一類。表明在基因進化的過程中，各品種間可能存在很大程度的基因交流。

2.4 基于SSR遺傳多態性的群體結構分析

如圖4所示，取△K（相鄰K值的對數似然值變化率）最大值對應的K值（最佳群體群組數值）為最優值，△K最大時K=3，即28個新疆地方梨品種可劃分為3個組，由圖5可以看出，3個組中都有混合現象，說明新疆地方梨品種之間存在不同程度的基因滲透。其中第一組和第三組混合結果有一定的相似性。

2.5 MCID法繪制CID圖譜

利用10對SSR引物對28個新疆地方梨品種進行鑒定，使用（0，1）矩陣進行條帶統計。如圖6所示，利用引物Y1920擴增梨基因組DNA，其中11個地方梨品種擴增出了清晰、可重復的大小為105 bp和115 bp的條帶，11個地方梨品種包括褐色句句梨、輪臺句句梨、霍城句句梨、黃句句梨、伊犁紅句句梨、庫車阿木特、綠梨、句句梨、霍城名名梨梨、棋盤梨、奎可阿木特1號，引物Y1920將28個新疆地方梨品種分成2組。引物Y128可進一步將2組新疆地方梨品種分為4組。庫車阿木特、霍城冬黃梨、奎可阿木特1號擴增出100 bp大小的條帶，與褐色句句梨、輪臺句句梨、黃句句梨、伊犁紅句句梨、綠梨、句句梨、霍城句句梨、棋盤梨區分開。引物Y480進一步將庫車阿木特單獨區分出來；利用引物Y632擴增霍城冬黃梨、奎可阿木特1號基因組DNA，霍城冬黃梨產生大小為225 bp的條帶，奎可阿木特1號產生大小為210 bp的條帶。以此類推，直至所有品種被完全分離。如圖6所示，28個品種間均存在差異，但其差異較小，可能是由于各品種間的親緣較近。

2.6 MCID法可重復性檢驗

如圖7所示，根據CID圖譜選取庫爾勒香梨、耐西普特、阿克蘇句句梨、莎車耐西普特、莎車晚香紅、奎可阿木特2號，利用引物Y35擴增基因組DNA，6個品種被分為2組。第1組為阿克蘇句句梨、莎車耐西普特、莎車晚香紅、奎可阿木特2號，擴增出500 bp條帶；第2組為庫爾勒香梨和耐西普特，擴增出430 bp條帶。引物Y128 將A組庫爾勒香梨（380 bp）和耐西普特（400 bp）區分開，在將莎車耐西普特（140 bp）和莎車晚香紅（180 bp）區分開，將奎可阿木特2號（110 bp）和阿克蘇句句梨（160 bp）區分開。本結果與CID預期結果一致，這6個品種都被區分出來。

3 討論

梨資源豐富，品種繁多，并且形態受環境等因素影響，僅用形態學方法難以在較短時間內對梨品種進行準確分類鑒定，利用分子標記可以實現快速高效的遺傳多樣性及品種鑒定，獲得品種間的遺傳相似度及親緣關系^[26]。本研究基于28個新疆地方梨基因組測序數據檢測到43 310個SSR位點，其中六核苷酸重復的類型最多，為778種。將新疆地方梨基因組與參考基因組比對，篩選出引物61 621對，進一步篩選得到17 216對引物，隨機選擇104對進行合成開發，聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示100對引物擴增的條帶清晰度較好。部分引物可能由于特異性不高等原因條帶擴增效果差^[27]。

Lācis等^[28]利用6個SSR標記對206份不同來源的梨種質資源進行基因型分析，并對其進行了遺傳多樣性評估，等位基因數為15～28，雜合度為0.519～0.956。有研究利用8個SSR位點對141份梨種質資源進行鑒定，同時利用13個梨品種公開的基因組作為參考，對141份梨種質資源進行親緣關系分析。研究結果表明，8對SSR引物共擴增出97個等位基因，雜合度為0.65～0.89，聚類結果顯示141份梨種質資源可劃分為3個類群，群體分化系數（Fst）為0.074 ^[29]。在本研究中，觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）、Shannon’s多樣性指數（I）分別為2.000、1.540、0.326、0.496。經過分析發現，這28個梨品種之間遺傳多樣性的水平相對較低；最小等位基因頻率（MAF）的平均值為0.771，遺傳多樣性平均指數為0.320，多態性信息含量（PIC）平均值為0.260，說明多態性水平較低（PIC≤0.5）^[30]，遺傳變異水平較低。Chen等^[31]認為Fst≥0.15為中等程度的分化，Fst≥0.4為較強程度的分化，而本研究中Fst為0.169，說明28個新疆地方梨品種間遺傳分化程度為中等。聚類結果顯示，遺傳相似性系數為0.52～0.98，當GS=0.52時，28個品種被分為2類，庫爾勒香梨與耐西普特被聚為一類，表明這2個品種親緣關系較近。牛瑩瑩^[1]基于形態學開展梨屬植物親緣關系分析，研究結果表明，庫爾勒香梨、耐西普特與新疆梨親緣關系更近，與本研究聚類結果不一致，這可能是由于基因重組表現出不同的基因型 ^[32]。群體遺傳結構能夠反映不同群體之間的遺傳背景復雜程度與基因交流程度，本研究中群體結構分析結果揭示了28個新疆地方梨品種之間存在不同程度的基因滲透，△K最大時K=3，即28個新疆地方梨品種可被劃分為3組，各品種之間普遍存在著基因交流，遺傳背景顯得較為復雜和多元化。

隨著分子生物學的發展，DNA分子標記技術成為品種鑒定的有力工具^[33]。而基于DNA分子標記的MCID法能夠直觀、快速地將各個品種區分開，目前已在多種果樹上應用。劉更森^[14]基于SSR分子標記結合MCID法對60個蘋果品種進行鑒定，成功利用8對引物構建了這些品種的CID圖譜。戚建鋒等^[12]基于SSR分子標記結合MCID法，對72個柿品種進行了準確的鑒定，僅使用了6對引物成功地構建了72個柿品種的CID圖譜。本研究采用MCID法，選取10對SSR引物，成功構建了28個新疆地方梨品種CID圖譜。CID圖譜能夠更加高效、準確地進行梨品種鑒定，為梨種質資源的研究和利用提供有力支持。鑒別其他不同梨品種時，可以依托已有的CID圖譜進行品種的鑒定。若遇到已有SSR引物無法區分的新品種，可以進一步增加新的引物，從而使現有的CID圖譜得以擴展，形成一個更全面的CID圖譜，為后續梨品種的鑒定工作奠定堅實基礎。

4 結論

利用104對核心SSR標記對28個新疆地方梨品種的遺傳多樣性進行研究。研究結果表明，新疆地方梨品種遺傳多樣性較高，遺傳相似性系數為0.52～0.98。聚類分析與群體結構分析結果表明，各地方梨品種之間存在基因交流，當K=3時，28個新疆地方梨品種被劃分為3組，各組之間存在混合現象，遺傳背景較為復雜。利用開發成功的SSR標記，采用MCID法構建新疆地方梨品種的CID圖譜，并驗證了該方法的有效性。本研究結果表明，MCID法快速、簡單，結果可靠，為今后梨種質資源評價和利用提供了理論依據。

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（責任編輯：成紓寒）