DSE 胞外代謝物施用方法對煤礦復墾區蛋白桑生長、光合效率和營養品質的影響

摘要： 【目的】綠色、可持續及高經濟效益是礦區生態修復的重要要求。研究由深色有隔內生真菌（dark septateendophytes，DSE） 制備的微生物制劑的不同施用方法，對蛋白桑（Morus alba L.） 生長、營養品質和光合效率的影響，為礦區生態修復提供有效方法?！痉椒ā吭囼炘O在陜西省神木市哈拉溝煤礦復墾區蛋白桑種植區，將DSE 胞外代謝物采用葉面涂抹、灌根、葉面涂抹+灌根3 種方式施用，以葉面涂抹和灌根等量蒸餾水作為對照。測定蛋白桑生長、光合效率指標以及養分含量和營養品質，通過主成分分析法評價不同施用方法提高復墾區蛋白桑生態修復的效應?！窘Y果】DSE 胞外代謝物3 種施用方法均促進了蛋白桑生長和養分吸收，增加了蛋白桑株高、地徑、葉片氮、磷和鉀含量。葉面涂抹、灌根顯著提高了蛋白桑纖維素和蛋白質含量。葉面涂抹+灌根提高了蛋白桑葉片蒸騰速率、凈光合速率、可溶性糖含量，與對照相比，分別提高329.4%、207.1%、19.8%。根據復墾區蛋白桑生長、養分、品質和土壤性狀指標進行主成分分析，葉面涂抹+灌根處理的綜合得分最高，對照處理綜合得分最低?！窘Y論】葉面涂抹+灌根施用DSE 胞外代謝物可有效促進蛋白桑生長，提高葉片光合效率，提升營養品質，有利于提升復墾區的生態修復效應，是較為適宜的施用方法。

關鍵詞： DSE 胞外代謝物；施用方式；蛋白桑；礦山生態修復；生態效應評價

我國煤炭資源分布呈現“西多東少，北富南貧”的特點，西部煤炭擔負能源供給的核心角色[1]。然而，西部煤炭資源多處于干旱半干旱生態脆弱區，水資源匱乏，地表植被稀少。煤炭開采導致土壤結構破壞，造成土壤水分和養分流失[2]、植被退化[3]、土壤微生物生物量和多樣性降低[4]等生態環境問題，使西部生態環境問題加劇惡化。隨著“雙碳”目標的逐步推進，我國深刻把握“綠水青山就是金山銀山”的發展理念，并著重強調礦區生態修復的必要性和緊迫性，充分重視煤礦區生態環境的保護與可持續發展。

在我國西部采煤沉陷區，采用叢枝菌根真菌（AMF）[5]、深色有隔內生真菌（dark septate endophytes，DSE）[6]等微生物技術進行礦區環境治理，可以將本土植物與微生物相結合，形成微生物?植物共生體[7]，由植物提供微生物生長代謝所需的碳水化合物，同時微生物促進宿主植物獲取礦質養分[8]。微生物復墾技術在礦區生態重建中被廣泛應用，可提高礦區植被覆蓋率，改善土壤結構和質量，增強生態系統穩定性[9]。

DSE 是一種生長在植物根系維管組織細胞內或細胞間隙的內生真菌[10]，在不同生境和不同植物種類中分布十分廣泛[11]。DSE 能夠增加宿主植物對土壤中水分和養分的吸收能力[12]，在促進植物生長，提高植物生物和非生物脅迫抗性[13]等方面有著重要的生態功能。DSE 作為普遍存在并具有生態功能的內生真菌，將其用作微生物復墾技術材料具有普適性。Gao等[14]研究發現，在西部干旱半干旱采煤沉陷區蕎麥?苜蓿間作系統中接種DSE 可以提高作物產量。此外，有研究表明DSE 胞外代謝物對宿主植物的養分有效性發揮積極作用，為植物生長發育提供有利條件[15]。Tienaho 等[16]從樟子松（Pinus sylvestris L.） 分離的DSE 水溶性化合物主要是氨基酸和肽，以此推斷DSE 代謝物可能促進植物生長。Wang 等[17]研究表明，DSE 胞外代謝物可以通過提高甘油磷脂代謝、氨基酸糖和核苷酸糖代謝促進玉米生長。因此，DSE胞外代謝物在礦區生態修復方面具有較大開發潛力，但目前此方面的研究較少。

蛋白桑（Morus alba L.） 屬?？?，多年生灌木，適應性強，有改善環境的作用，具有較高的生態價值。蛋白桑根系分蘗能力強，壓條于沙土中生根，形成新植株而向外擴散，從而覆蓋沙土表面，達到防風治沙目的[18]。除此之外，蛋白桑是一種新型植物蛋白質飼料資源，具有較高的營養價值。桑葉中富含蛋白質、纖維素、礦物質元素和多種氨基酸等動物生長必需物質[19]，可以明顯提高養殖畜禽的免疫力與營養價值[20]。綜上，蛋白桑區域性適應強，有較高的生態和飼用價值，開發前景十分廣闊。我們前期通過盆栽試驗表明，葉面涂抹和灌根DSE 可以提高蛋白桑飼用品質，促進蛋白桑生長和養分吸收[21?22]。然而，DSE 作為微生物菌劑在礦區生物修復蛋白桑的生態效應仍有待研究。同時，DSE 胞外代謝物作為DSE 菌劑的重要組成成分，關于其葉面涂抹和灌根方式對植物和土壤生態功能的影響還鮮有報道。

本研究選取陜北神東哈拉溝煤礦復墾區，以蛋白桑為研究對象，設置DSE 胞外代謝物不同施用方式處理，分析不同處理對蛋白桑生長、品質指標，以及土壤理化性質的影響，探究DSE 胞外代謝物不同施用方式下蛋白桑復墾區的生態效應，篩選最佳的DSE 胞外代謝物施用方式，旨在通過施用DSE 胞外代謝物實現蛋白桑的提質增產效果，提高生態效益，加速西部礦區土地復墾與生態修復，促進西部礦區煤炭開采與生態環境協調可持續發展。

1 研究區概況與研究方法

1.1 研究區概況

研究區位于陜西省神木市大柳塔鎮神東哈拉溝煤礦生態示范基地（109°40′～110°55′E，38°12′～39°27′N），海拔1100～1200 m，位于毛烏素沙漠與黃土高原中間位置，地貌類型以風沙地貌為主（圖1）。該地屬于干旱半干旱大陸性溫帶季風氣候，日照時間充足，氣候干燥，風沙較多。年平均日照時間2875.9 h，年平均氣溫8.9℃，年平均無霜期199 天。降雨主要集中在7—9 月，年平均降水量440.8 mm，年平均水面蒸發量1336.6 mm。土壤類型為淡栗鈣、栗鈣土和灰鈣土，地表沙質土壤疏松，養分貧瘠。2019 年種植1 年生蛋白桑樹苗，株行距為1.0 m×2.5 m，各項管理措施均一致。

1.2 試驗材料

DSE 供試菌株屬于鏈格孢屬（Alternaria sp.），保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC No.17463。該菌株分離自內蒙古自治區錫林浩特市勝利露天礦外圍草原區克氏針茅Stipa krylovii根部，純化后保存于中國礦業大學（北京）。無菌條件下，將直徑為7 mm 的DSE 菌片從DSE 固體平板接種在150 mL Modified Melin-Norkra （MMN） 液體培養基上，在27℃ 黑暗條件下以170 r/min 振蕩培養8 天后收獲。將DSE 培養液進行5550 ×g 離心，分離15 min 后獲得DSE 菌絲和胞外代謝物，最后DSE胞外代謝物通過0.22 μm 過濾器完成制備，供野外試驗。

1.3 試驗設計

試驗地為蛋白桑種植區，于2022 年6 月在樣地設置DSE 胞外代謝物不同施用方式處理：葉面涂抹（L）、灌根（R）、葉面涂抹＋灌根（LR） 以及對照（CK）。其中，葉面涂抹方式施用DSE 胞外代謝物用量為5 mL/株，選取植株上、中、下部各10 片葉子，為保證蛋白桑葉面涂抹DSE 胞外代謝物用量相同，用毛刷涂抹葉片表面，無水珠滴落。灌根DSE 胞外代謝物用量為50 mL/株，施入距根部5 cm，深度10 cm 的土壤層。對照區葉面涂抹和灌根等量蒸餾水。每個樣地處理54 株蛋白桑。2022 年9 月中旬測定蛋白桑生長狀況并采集樣品，每個處理樣地設置5 個樣方（2.5 m×2.5 m），記錄蛋白桑株高、地徑和SPAD 值。將蛋白桑地上部進行收獲，60℃ 烘干后測定品質指標等。在每個樣方內采用五點取樣法，去除腐殖質和地表枯落物，用土鉆取植株下0—20cm 根區土壤，帶回實驗室自然風干，過2 mm 和0.15 mm 篩后進行土壤理化性質的測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 植物指標測定 蛋白桑株高和地徑分別用卷尺和游標卡尺測定；葉片SPAD 值用SPAD-502 Plus（Konica） 葉綠素測定儀測定植株上、中、下部各5 片葉子；植物蒸騰速率、凈光合速率、胞間CO2 濃度、氣孔導度光合參數，用Li-6400 型便攜式光合作用系統（LI-COR，美國），于上午9：00—11：00 測定植株上、中、下部各1 片葉子；葉片氮、磷和鉀含量使用粉碎的葉片烘干樣品，經H2SO4?H2O2 消煮后，用凱氏定氮法測定氮含量，用電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES） 測定磷和鉀含量；植物可溶性蛋白質采用考馬斯亮藍G-250 法測定[23]；植物可溶性糖采用蒽酮?硫酸法測定[24]；植物纖維素采用蒽酮比色法測定[25]。

1.4.2 土壤指標測定 土壤pH 和電導率用Seven-Excellence pH 計（梅特勒托利多，瑞士） 測定；土壤碳通量用LI-8100 系列土壤碳通量測量系統（LICOR，美國） 測定；土壤含水率用TDR 土壤水分測定儀測定。

1.5 數據處理

植物和土壤數據采用Excel 2016 和IBM SPSSStatistics 20.0 進行單因素方差分析（ANOVA），采用Duncan’s 法進行多重比較，顯著性水平選擇α=0.05。所有植物和土壤測定結果均為平均值±標準誤差（SE），使用Origin 2021 作圖。

蛋白桑復墾區生態效應評價采用植物生長、養分、品質和土壤理化性質4 類共17 個指標，將上述指標定義為X1，X2······X16，X17，得到原始數據矩陣。通過SPSS 20.0 將實測原始數據進行標準化處理，并進行主成分分析，建立指標之間的相關系數矩陣，得到主成分的特征值及貢獻率。

2 結果與分析

2.1 DSE 胞外代謝物不同施用方式對蛋白桑生長的影響

由圖2 可知，不同方式施用DSE 胞外代謝物的蛋白桑株高和地徑均顯著高于對照組（Plt;0.05）。其中，葉面涂抹施用DSE 胞外代謝物的蛋白桑株高最高，比對照提高55.62%。

葉片SPAD 值、蒸騰速率、凈光合速率、胞間CO2 濃度和氣孔導度反映蛋白桑光合作用的強度和效率，可以綜合反映蛋白桑的生長發育狀況。不同方式施用DSE 胞外代謝物的蛋白桑SPAD 值均顯著高于對照組（Plt;0.05）。灌根、葉面涂抹+灌根DSE 胞外代謝物處理的蛋白桑蒸騰速率分別顯著高于對照組3.8 和3.4 倍左右（329.4%，Plt;0.05）。與對照相比，葉面涂抹+灌根DSE 胞外代謝物處理的蛋白桑凈光合速率顯著提高207.10% （Plt;0.05），葉面涂抹和灌根DSE 胞外代謝物處理的葉片胞間CO2 濃度分別顯著增加142.72% 和158.95% （Plt;0.05），施用DSE胞外代謝物處理的葉片氣孔導度無顯著差異。結果表明，施用DSE 胞外代謝物提高蛋白桑光合作用，促進植物生長。

2.2 DSE 胞外代謝物不同施用方式對蛋白桑養分含量的影響

從圖3 可知，相比對照組，不同方式施用DSE胞外代謝物處理的蛋白桑葉片氮、磷和鉀含量均有顯著提高（Plt;0.05）。其中，葉面涂抹+灌根DSE 胞外代謝物處理的蛋白桑葉片氮含量最高，分別顯著高于對照和灌根處理49.24% 和17.24% （Plt;0.05）。不同方式施用DSE 胞外代謝物處理的蛋白桑葉片磷和鉀含量無顯著差異。

2.3 DSE 胞外代謝物不同施用方式對蛋白桑品質的影響

如圖4 所示，葉面涂抹與灌根DSE 胞外代謝物與對照組相比顯著提高蛋白桑可溶性蛋白、纖維素含量，分別提高100.30% 和79.79%、45.08% 和33.59% （Plt;0.05）。葉面涂抹+灌根DSE 胞外代謝物的蛋白桑可溶性糖含量最高，相比對照組顯著提高19.78% （Plt;0.05），但葉面涂抹與灌根DSE 胞外代謝物處理與對照組之間無顯著差異。

2.4 DSE 胞外代謝物不同施用方式對土壤理化性質的影響

如表1 所示，葉面涂抹、葉面涂抹+灌根DSE胞外代謝物相比對照組，顯著降低土壤pH，并顯著提高土壤電導率（Plt;0.05）。葉面涂抹+灌根DSE 胞外代謝物顯著提高土壤含水率（Plt;0.05）。不同處理之間的土壤碳通量無顯著差異。結果表明，施用DSE 胞外代謝物可以改善土壤酸堿性，增加土壤含水率。

2.5 DSE 胞外代謝物不同施用方式下蛋白桑復墾區的生態效應評價

為了綜合評價不同施用方式下蛋白桑復墾區的生態修復效應，探究DSE 胞外代謝物野外施用的最佳方式，對包括蛋白桑生長、養分和品質指標，以及土壤理化性質在內的17 個指標進行了主成分分析。由圖5 可知，蛋白桑株高、葉片磷、鉀含量和纖維素含量等作為第1 主成分主要指標，蒸騰速率、凈光合速率、氣孔導度等作為第2 主成分主要指標。由此看出，第1 主成分主要反映蛋白桑的促生效應和品質提升情況，第2 主成分主要反映蛋白桑光合相應指標。最終篩選特征值大于1 的4 個主成分，以每個主成分所對應的特征值的權重計算綜合主成分值，并對綜合主成分值進行排序。由表2可知，綜合得分排名：葉面涂抹+灌根gt;葉面涂抹gt;灌根gt;對照組，說明葉面涂抹+灌根DSE 胞外代謝物對蛋白桑復墾區生態修復效果最佳。

3 討論

采礦過程導致表土流失和植被破壞。礦區復墾不僅要重建礦區土壤，更要恢復土壤肥力和土壤功能。植被恢復是礦區生態修復重要舉措[26]。微生物修復作為一種綠色、可持續的修復方式，可以促進植被生長，加速礦區生態修復。DSE 已成為生態恢復和植被重建的一種有效和綜合的生物技術方法?；贒SE 菌劑的研究被大量報道[27?28]，然而，DSE 代謝物的開發利用在很大程度上被忽視了。微生物代謝物可以通過降低土壤pH 值、螯合作用和礦化作用，誘導養分從不溶性絡合物中釋放出來促進植物養分吸收[29]，還可以通過刺激植物細胞、組織和器官之間的協調，以及保留某些功能來調節植物在各個發育階段的生長[30]。

DSE 胞外代謝物主要成分為氨基酸和肽類化合物[15?16]。氨基酸是植物氮營養的重要貢獻者[31]。肽類化合物在植物中主要作為化學信號來感知和響應營養物質[32]。多肽信號轉導在植物發育和生長調控的各個方面都具有重要作用，包括分生組織、葉片形態發生以及生物和非生物脅迫下的防御反應[33]。植物根系中的氨基酸可以通過木質部蒸騰流輸送到葉片[34]。氨基酸也可以直接被植物吸收利用，在沒有光合作用的情況下可直接參與機體的蛋白質合成，促進干物質的有效積累[35]。野外試驗表明，施用DSE 胞外代謝物提高蛋白桑葉片的氣孔導度和胞間CO2 濃度，促進蛋白桑進行光合作用。與此類似，有研究表明噴施小分子有機物可以明顯提高小油菜SPAD值，增加小油菜葉片的葉綠素含量，提高小油菜的光合作用[36]。研究發現，施用DSE 胞外代謝物可以提高蛋白桑葉片的養分含量。Enggrob 等[37]研究表明，植物可以直接將氨基酸、酰胺，甚至二肽、三肽和寡肽作為氮素吸收。本研究表明，施用DSE 胞外代謝物處理蛋白桑中蛋白質含量顯著提高，且葉面涂抹效果最好。于會麗等[36]研究表明，噴施甘氨酸使油菜產量提高35%。噴施適量的低分子量有機化合物可顯著提高油菜對養分的吸收，增加可溶性糖和蛋白質含量，降低硝酸鹽含量。在綠蘿、西蘭花和洋蔥等植物上施用氨基酸也發現了類似的效果，促進了植物生長，提高了產量和果實質量[38?40]。因此，在煤礦復墾區經濟植物的栽培和管理過程中，優化DSE 胞外代謝物的施用可以提高產量和產品經濟價值。

植物葉片表皮含有的特殊細胞（包括毛狀體或氣孔） 影響葉片的營養吸收[41]。與根部施肥相比，葉面施肥可以通過植物地上部分將養分直接輸送到目標部位[42]。有研究表明，在沒有外部壓力或表面活性成分的情況下，氣孔可吸收水分和溶質[43]。然而，DSE胞外代謝物的物理化學性質，如分子大小、溶解度或電荷、pH、表面張力、滯留、擴散的融點，這些因素均對葉片吸收營養溶液的效果都具有顯著影響，但仍需開展更深入的研究。植物表面成分的物理結構、極性和疏水性以及表面沉積液體的綜合效應是葉面肥料吸收的關鍵影響因素。肥料滴與植物表面的接觸面積越大，通過表皮或氣孔吸收的機會就越大[41]。

植物主要通過根系吸收土壤或營養液中的養分進行生長發育。土壤性質在很大程度上決定了植物對營養元素的反應。土壤pH 可以決定養分對植物的可利用程度[44]。研究表明，施用DSE 胞外代謝物降低復墾區堿性土壤的pH，增加土壤電導率和含水率。DSE 胞外代謝物以及植物根系會釋放質子降低根際土壤pH，促進不溶性含磷礦物或化合物的溶解[45]。土壤碳通量主要由根系自養產生和分解土壤有機質的土壤微生物異養產生[46]。研究表明，灌根DSE胞外代謝物處理相比對照組可提高土壤碳通量，說明灌根處理可能促進蛋白桑根系發育，并招募更多土壤微生物，促進土壤微生物群落多樣性，但還需要進一步開展試驗進行驗證。此外，DSE 胞外代謝物具有黏附性[47]。將干燥的微生物胞外聚合物混合到土壤中，可以在土壤基質中形成凝膠，并與土壤分子結合，在形成保護膜、吸水、營養物質積累等方面發揮重要作用[48]。研究結果表明，添加DSE 胞外代謝物提高土壤含水率，微生物胞外聚合物可以通過吸附在礦物表面來聚集礦物顆粒，在不同類型的礦物之間建立連接，增強它們的保水能力[49]。

生態效應評價結果表明，葉面涂抹和根部施加相結合方式施用DSE 胞外代謝物的蛋白桑復墾區生態效應最佳。Phattarakul 等[50]研究表明，在增加糙米中的鋅濃度方面，土壤和葉面施用的組合優于單獨土壤施用或葉面施用。結合圖2 和圖4 可以看出，葉面涂抹處理主要在蛋白桑生長指標（如SPAD 值、纖維素、蛋白質含量等） 中表現出正效應，灌根處理主要在土壤性質（如碳通量和電導率等） 中表現出正效應。葉面施肥與土壤施肥相結合，既可減少菌劑用量，又可獲得良好的生產效應，是改善土壤環境的有效措施。葉片的養分可以通過莖部吸收并輸送到根系，提高根系活性，防止根系過早衰老，從而增強根系的吸收能力[51]。加之西部礦區復墾面積大，且地形復雜多變，采用DSE 胞外代謝物葉面肥可以高效、低成本地進行礦區立體快速生態修復。根據復墾區條件，綜合評估土壤肥力狀況，確定最佳施肥量和施肥方法，需要系統研究不同葉面施肥與土壤施肥的比例及其利用效率，探究植物葉面養分與土壤養分的相互作用，以建立系統科學的施用模式，促進葉面肥在礦區生態修復的廣泛應用。

4 結論

施用DSE 胞外代謝物可顯著提升蛋白桑葉片養分含量、蒸騰速率和凈光合速率，提高生物量；而且葉面涂抹配合灌根施用還可提高蛋白桑蛋白質、纖維素和可溶性糖含量。因此，DSE 菌劑采用葉面涂抹與灌根相結合的施用方式是提升復墾區蛋白桑修復效果的最佳方法。

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