七葉苷抑制PERK/eIF2A/ATF4信號通路改善肝細胞脂質堆積的研究

[摘要]"目的"探討七葉苷通過抑制蛋白激酶RNA樣內質網激酶（protein"kinase"RNA-like"endoplasmic"reticulum"kinase，PERK）/真核翻譯起始因子2A（eukaryotic"translation"initiation"factor"2A，eIF2A）/激活轉錄因子4（activating"transcription"factor"4，ATF4）信號通路改善肝細胞脂肪變性的治療作用和機制。方法"采用人源正常肝細胞系HL-7702，利用0.5mmol/L游離脂肪酸（free"fatty"acid，FFA）（油酸"："棕櫚酸=2"："1）誘導體外肝細胞脂肪變性模型，經50μmol/L、200μmol/L七葉苷處理24h。測定細胞內生化指標丙氨酸轉氨酶（alanine"transaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate"transaminase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和三酰甘油（triacylglycerol，TG）含量。采用尼羅紅脂肪熒光染色法檢測細胞內脂滴；采用定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）檢測細胞內脂質代謝過程相關基因的轉錄水平。采用蛋白質印跡（Western"blot，WB）檢測細胞內促凋亡因子Caspase-3和Bax的蛋白表達量及PERK/eIF2A/ATF4信號通路相關蛋白和磷酸化水平。"""""結果"生化指標檢測結果證實，50μmol/L和200μmol/L的七葉苷可顯著降低FFA誘導肝細胞內MDA、ALT和AST水平（Plt;0.05），并顯著增加細胞內GSH水平（Plt;0.05）。WB結果顯示七葉苷可顯著降低細胞內促凋亡因子Caspase-3和Bax的蛋白表達量（Plt;0.01）。尼羅紅染色和TG含量檢測結果證實七葉苷可顯著減少細胞內脂滴堆積和TG含量（Plt;0.05）。qRT-PCR結果顯示七葉苷處理后肝細胞內PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk、Acaca的表達量均顯著降低（Plt;0.05）。在機制方面，七葉苷可顯著降低肝細胞中PERK、eIF2A和ATF4的磷酸化水平（Plt;0.05）。結論"七葉苷可通過調控PERK/eIF2A/ATF4信號通路改善肝細胞脂質堆積，對維護肝細胞健康狀態起到積極作用。

[關鍵詞]"肝細胞；脂肪變性；脂質代謝；蛋白激酶RNA樣內質網激酶/真核翻譯起始因子2A/激活轉錄因子4

[中圖分類號]"R575.5""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.33.013

Study"on"esculin"improve"lipid"accumulation"in"hepatocytes"by"inhibiting"the"PERK/eIF2A/ATF4"signaling"pathway

XU"Shuang，"HONG"Liang，"PAN"Anna，"WU"Yanghe，"YE"Xiaoting

Department"of"Infectious"Disease，"the"Third"Affiliated"Hospital"of"Wenzhou"Medical"University，"Wenzhou"325200，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"effect"and"mechanism"of"esculin"on"hepatocyte"steatosis"by"inhibiting"protein"kinase"RNA-like"endoplasmic"reticulum"kinase"（PERK）/eukaryotic"translation"initiation"factor"2A"（eIF2A）/activating"transcription"factor"4"（ATF4）"signaling"pathway."Methods"Human"normal"liver"cell"line"HL-7702"was"used"to"induce"a"fatty"degeneration"model"of"hepatocytes"in"vitro"with"0.5mmol/L"free"fatty"acid"（FFA）"（oleic"acid"："palmitic"acid"=2"："1）"and"treated"with"50μmol/L，"200μmol/L"esculin"for"24h."After"the"cell"samples"were"broken"by"ultrasound，"the"supernatant"was"collected"and"the"contents"of"alanine"transaminase"（ALT），"aspartate"transaminase"（AST），"malondialdehyde"（MDA），"glutathione"（GSH）"and"triacylglycerol"（TG）"were"detected."Using"Nile"red"fat"fluorescence"staining"to"detect"intracellular"lipid"droplets;"Quantitative"reverse"transcriptase-"mediated"polymerase"chain"reaction"（qRT-PCR）"was"used"to"detect"the"transcription"levels"of"genes"related"to"intracellular"lipid"metabolism"processes."Western"blot"（WB）"was"used"to"detect"the"protein"expression"levels"of"pro"apoptotic"factors"Caspase-3"and"Bax，"as"well"as"PERK/eIF2A/ATF4"signaling"pathway"related"proteins"and"phosphorylation"levels"in"cells."Results"The"results"confirmed"that"treatments"of"50μmol/L"and"200μmol/L"of"esculin"significantly"decreased"the"levels"of"FFA"induced"MDA，"ALT"and"AST"in"hepatocytes"（Plt;0.05），"and"significantly"increased"the"levels"of"intracellular"GSH"（Plt;0.05）."WB"results"showed"that"esculin"treatment"could"significantly"reduce"the"protein"expression"levels"of"Caspase-3"and"Bax"（Plt;0.01）."The"results"of"Nile"red"staining"and"TG"content"detection"confirmed"that"esculin"treatment"could"significantly"reduce"the"accumulation"of"intracellular"lipid"droplets"and"TG"content"（Plt;0.05）."The"results"of"qRT-PCR"showed"that"the"expression"levels"of"PPARγ，"FASN，"Srebf1，"Dgat2，"Mvk"and"Acaca"in"hepatocytes"were"significantly"decreased"after"esculin"treatment"（Plt;0.05）."In"terms"of"mechanism，"the"phosphorylation"levels"of"PERK，"eIF2A"and"ATF4"in"hepatocytes"were"significantly"reduced"by"esculin"treatment"（Plt;0.05）."Conclusion"Esculin"could"improve"lipid"accumulation"in"hepatocytes"by"regulating"the"PERK/eIF2A/ATF4"signalling"pathway，"which"plays"a"positive"role"in"maintaining"the"healthy"state"of"hepatocytes.

[Key"words]"Hepatocyte;"Fatty"degeneration;"Lipid"metabolism;"PERK/eIF2A/ATF4

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic"fatty"liver"disease，NAFLD）被視為代謝綜合征的肝臟表現，通常與肥胖、血脂異常、高血壓和糖尿病等癥狀相關[1-3]。內質網除在蛋白質加工中發揮作用外，還與肝細胞中的脂質合成密切相關[4-5]。內質網脂質過度堆積可誘發內質網應激（endoplasmic"reticulum"stress，ERS），加重肝臟脂肪變性。雖然ERS通過短暫的未折疊蛋白反應可防止脂肪變性，但NAFLD中長期且慢性的ERS可加重肝臟脂肪變性[6]。因此，通過減弱ERS可能是治療NAFLD的潛在策略。

在NAFLD中，蛋白激酶RNA樣內質網激酶（protein"kinase"RNA-like"endoplasmic"reticulum"kinase，PERK）/真核翻譯起始因子2A（eukaryotic"translation"initiation"factor"2A，eIF2A）/激活轉錄因子4（activating"transcription"factor"4，ATF4）信號通路調節脂肪生成和脂肪變性。七葉苷在急性肝損傷治療中具有顯著的抗氧化和抗炎作用[7]。研究表明七葉苷可改善單純性脂肪肝和NAFLD小鼠模型中肝臟脂肪變性[8-9]。在治療由蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導的NAFLD時，七葉苷通過增加沉默信息調節因子1的表達和抑制核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強信號通路，降低小鼠肝臟中的炎癥因子水平[10]。ATF4缺陷可降低肝臟PPARγ和抑制脂質合成過程的作用[11]。本研究探討七葉苷通過PERK/eIF2A/ATF4通路對肝細胞脂質堆積的作用和機制。

1""材料與方法

1.1""細胞系及造模

人源正常肝細胞系HL-7702購自上海澤葉生物科技有限公司。HL7702細胞分別在含有10%胎牛血清（美國ThermoFisher公司）和1%青霉素-鏈霉素抗生素濃縮液（美國ThermoFisher公司）的1640完全培養基（美國ThermoFisher公司）中，置于5%二氧化碳的37℃恒溫細胞培養箱中培養。

在細胞造模方面，按每孔35萬個細胞鋪于6孔板內，次日用含0.5%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素抗生素濃縮液的1640饑餓培養基饑餓處理24h。隨機分為對照組、模型組、50μmol/L七葉苷組、200μmol/L七葉苷組。然后，更換新的饑餓培養基后，除對照組外，其余組加入0.5mmol/L游離脂肪酸（free"fatty"acid，FFA）（油酸"："棕櫚酸=2"："1）處理1h。50μmol/L七葉苷組和200μmol/L七葉苷組分別加入50μmol/L和200μmol/L七葉苷孵育24h后繼續放入培養箱中培養24h，細胞經制樣后用于后續檢測實驗。油酸和棕櫚酸購自Sigma-Aldrich公司。

1.2""細胞內生化指標檢測

細胞經消化后，經180g常溫離心10min后收集細胞，并在冰浴條件下使用超聲破碎，條件為功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次。細胞破碎液經13"500g、4℃離心10min，收集上清液。丙氨酸轉氨酶（alanine"transaminase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉氨酶（aspartate"transaminase，AST）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，并用于檢測細胞上清液中上述生化指標。上清液蛋白濃度使用二喹啉甲酸（bicinchoninic"acid，BCA）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）測定。

1.3""細胞脂滴和三酰甘油檢測

采用尼羅紅脂肪熒光染色液（北京普利萊基因技術有限公司）染色10min后用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗熒光猝滅劑[翌圣生物科技（上海）股份有限公司]封片，用FV3000多光譜快速激光共聚焦顯微鏡（激發波長：488nm）拍照和分析細胞脂滴。超聲破碎細胞后，三酰甘油（triacylglycerol，TG）試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定細胞TG含量。

1.4""定量反轉錄聚合酶鏈反應

處理后的細胞樣品以Trizol法提取組織mRNA，用逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將mRNA逆轉錄為cDNA。利用SYBR"Green熒光染料（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative"reverse"transcriptase-mediated"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）檢測目的基因的表達水平。檢測目的基因為脂質代謝過程相關基因PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk、Acaca。用GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.5""蛋白質印跡

取處理后的細胞樣品加入100μl組織快速裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）裂解，用BCA試劑盒測定蛋白含量，使用濃度為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，300mA轉膜1.5h，用5%脫脂牛奶封閉1.5h，經一抗4℃孵育過夜，二抗（1"："10000，武漢三鷹生物技術有限公司）室溫孵育1h，用ChemiDoc"XRS+化學發光凝膠成像儀檢測（美國伯樂實驗公司）。一抗PERK（1"："1000）、eIF2A（1"："1000）、磷酸化eIF2A（1"："1000）購自杭州戴格生物技術有限公司。一抗磷酸化PERK（1"："1000）、磷酸化ATF4（1"："1000）購自北京博奧森生物技術有限公司。一抗ATF4（1"："2000）、Caspase-3（1"："2000）和Bax（1"："10000）及內參GAPDH（1"："50000）購自武漢三鷹生物技術有限公司。采用蛋白質印跡（Western"blot，WB）法對上述蛋白表達量進行檢測。

1.6""統計學方法

采用Graphpad"Prsim"version"9.0統計學軟件對數據進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用one-way"ANOVE分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""七葉苷改善FFA誘導肝細胞損傷和凋亡

七葉苷處理經FFA誘導的細胞后，細胞內MDA含量顯著下降（Plt;0.01），且與對照組比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見圖1A。與模型組比較，經200μmol/L七葉苷處理后細胞內GSH含量恢復至正常水平（Plt;0.05，Plt;0.01），見圖1B。七葉苷處理經FFA誘導的細胞后，細胞內ALT和AST含量恢復至正常水平（Pgt;0.05），見圖1C和圖1D。WB結果顯示模型組肝細胞內促凋亡因子Caspase-3和Bax的蛋白表達量較對照組顯著增加（Plt;0.01），200μmol/L七葉苷處理后其表達量較模型組顯著降低（Plt;0.05，Plt;0.01），見圖1E和圖1F。

2.2""七葉苷通過脂質代謝改善FFA誘導的細胞脂肪變性

尼羅紅脂肪熒光染色結果表明，模型組細胞內綠色熒光顯示陽性的脂滴含量顯著增加（Plt;0.01），并廣泛分布在細胞質中，見圖2A和圖2B。與模型組比較，50μmol/L和200μmol/L七葉苷處理后，細胞內脂滴含量顯著下降（Plt;0.05，Plt;0.01），且隨著七葉苷濃度升高，細胞內脂滴含量顯著降低（Plt;0.01）。與模型組比較，50μmol/L和200μmol/L七葉苷處理后，細胞內TG含量檢測結果顯示細胞內TG含量顯著降低（Plt;0.01），見圖2C。與對照組比較，qRT-PCR結果顯示模型組肝細胞內PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk、Acaca的轉錄水平顯著增加（Plt;0.01），經200μmol/L七葉苷處理后其表達量均顯著降低（Plt;0.05，Plt;0.01），見圖2D。

2.3""七葉苷下調PERK/eIF2A/ATF4信號通路

與對照組比較，模型組肝細胞中eIF2A的蛋白表達量及磷酸化PERK（Thr980）、磷酸化eIF2A（Ser51）和磷酸化ATF4（Ser245）水平顯著增加（Plt;0.05，Plt;0.01），但其PERK和ATF4的蛋白表達量未顯著改變（Pgt;0.05），見圖3。200μmol/L七葉苷處理可顯著降低肝細胞中eIF2A的蛋白表達量（Plt;0.01），同時顯著降低其磷酸化PERK（Thr980）、磷酸化eIF2A（Ser51）和磷酸化ATF4（Ser245）水平（Plt;0.05，Plt;0.01）。

3""討論

NAFLD正逐漸演變為全球范圍內的主要慢性肝病[12-13]。據估算，全球約有24億人患有NAFLD，約占全球人口的30%[14]。目前，一些用于治療高脂血癥和糖尿病的藥物被發現對NAFLD有一定的治療效果。七葉苷也稱作秦皮甲素，是從七葉樹或中藥材秦皮等多種藥用植物中提取的有效成分[15]。這些植物中的七葉苷含量為15.96～38.70mg/g[16]。藥理學研究顯示，秦皮甲素在抗炎和抗氧化應激方面表現出顯著效果[17-18]。此外，七葉苷還具有抗糖尿病的特性，這與其在改善胰腺損傷、促進胰島素釋放及增強血糖穩態方面的作用密切相關[19-20]。盡管已有研究表明七葉苷可改善NAFLD小鼠模型的肝脂肪變性，但其在調控ERS方面的具體作用機制尚不十分明確。本研究證實七葉苷通過抑制PERK/"eIF2A/ATF4信號通路改善肝細胞脂質堆積的治療作用和機制。

肝細胞是機體內脂肪代謝和儲存的主要場所，在NAFLD的發病過程中，肝細胞內脂肪的過度積累成為該病的一個顯著標志。本研究結果顯示，使濃度的用50μmol/L和200μmol/L七葉苷處理均可顯著改善肝細胞內的脂質氧化情況，提升其抗氧化能力，并減輕肝細胞的損傷。這些細胞狀態的改善與七葉苷降低細胞內凋亡因子Caspase-3和Bax蛋白表達量的作用相吻合，進一步證實七葉苷在抗脂質氧化、提高抗氧化性及降低細胞凋亡方面的重要作用。值得注意的是與50μmol/L濃度相比，200μmol/L七葉苷處理在降低細胞內Caspase-3蛋白表達量方面表現出更為顯著的效果。這一結果說明不同濃度的七葉苷可能對不同凋亡因子存在差異性調控或在調控時間上存在差異，這需要進一步深入探究以更全面地了解七葉苷的作用機制和最佳用藥劑量。

為驗證七葉苷對FFA誘導的肝細胞的保護作用是否與改善脂質代謝相關，本研究探討七葉苷對肝細胞內脂質積累和代謝的影響。本研究檢測肝細胞內的脂滴數量、TG含量及涉及脂質代謝的相關基因表達。實驗結果顯示七葉苷處理可顯著減少肝細胞內的脂滴積累和TG含量，說明七葉苷可顯著改善肝細胞的脂肪變性，這與NAFLD的治療目標高度契合。本研究還發現七葉苷處理可顯著降低與脂質代謝途徑相關的基因如PPARγ、FASN、Srebf1、Dgat2、Mvk和Acaca的轉錄水平。這些基因在TG及膽固醇合成等代謝途徑中發揮關鍵作用。這一結果提示七葉苷可通過這些途徑潛在調控肝細胞的脂質代謝，但其具體機制有待進一步研究。

本研究顯示七葉苷可顯著降低肝細胞中PERK、eIF2A和ATF4的磷酸化水平，表明七葉苷對FFA誘導的肝細胞ERS有顯著調控作用，且這種調控與肝細胞脂質合成密切相關。進一步研究發現七葉苷不僅可降低eIF2A的磷酸化水平，還顯著降低eIF2A蛋白的表達量；但對PERK和ATF4的蛋白表達量未產生明顯影響。該結果說明七葉苷可能不僅通過影響PERK/eIF2A/ATF4信號通路的磷酸化發揮作用，還可能通過其他途徑調控eIF2A的表達。

綜上，本研究結果表明七葉苷在FFA誘導的肝細胞中對PERK/eIF2A/ATF4信號通路具有顯著的調控作用。七葉苷可有效抑制肝細胞的脂質合成過程，進而改善肝細胞的脂肪變性、損傷及凋亡。本研究有望為七葉苷治療NAFLD的機制研究提供新的思路，同時為其作為潛在藥物的開發提供理論基礎。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–08–08）

（修回日期：2024–10–27）