芪紅膠囊對缺血性心力衰竭大鼠心肌線粒體能量代謝及AKT/AMPK－mTOR信號通路的影響

摘要 目的：探討芪紅膠囊基于蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶（AKT/AMPK）－哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路對缺血性心力衰竭（IHF）大鼠線粒體能量代謝的影響及調(diào)控機制。方法：將36只雄性SD大鼠隨機選取6只作為假手術(shù)組，另30只作為模型組。模型組采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法制備IHF模型。將造模成功的大鼠按體質(zhì)量隨機分為5組：模型組、陽性藥組、芪紅膠囊低劑量組［QH－L組，0.324 g/（kg·d）］、芪紅膠囊中劑量組［QH－M組，0.648 g/（kg·d）］、芪紅膠囊高劑量組［QH－H組，1.296 g/（kg·d）］，給予相應(yīng)濃度的藥物溶液灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積的生理鹽水（10 mL/kg），各組均每日灌胃1次。連續(xù)干預4周后，選用M型超聲測定左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）判定心臟結(jié)構(gòu)及心功能；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）染色法觀察心肌組織病理形態(tài)；酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清葡萄糖（Glu）、乳酸（LD）、酮體（KB）、游離脂肪酸（FFA）水平；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC－1法）檢測細胞線粒體膜電位；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）檢測試劑盒檢測其熒光強度；MitoSOXTMRed 線粒體超氧化物指示劑檢測線粒體活性氧（ROS）的含量；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織AKT、AMPK、mTOR的蛋白表達量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組LVEDD、LVESD、凋亡率、Glu、LD、FFA、KB、線粒體膜電位、ROS、磷酸化AMPK（p－AMPK）蛋白表達水平均升高（P＜0.05），LVEF、FS、mPTP及磷酸化AKT（p－AKT）、磷酸化mTOR（p－mTOR）蛋白表達水平均下降（P＜0.05）；與模型組比較，芪紅膠囊低、中、高劑量組和陽性藥組Glu、LD、FFA、KB、線粒體膜電位、ROS水平明顯下降（P＜0.05），線粒體mPTP、p－AKT蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；芪紅膠囊中、高劑量組LVEDD、凋亡率、p－AMPK明顯降低（P＜0.05），LVEF、FS明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與芪紅膠囊低劑量組比較，芪紅膠囊高劑量組和陽性藥組大鼠LVEF、FS、線粒體mPTP、p－AKT水平明顯升高，LVESD、ROS、p－AMPK表達水平下降（P＜0.05）。結(jié)論：芪紅膠囊可以調(diào)節(jié)IHF大鼠心肌代謝底物進程，減少ROS的過度生成保護線粒體功能，激活AKT上調(diào)mTOR活性抑制細胞凋亡，減輕心肌細胞損傷，調(diào)控能量代謝，發(fā)揮心肌保護作用，其機制可能與AKT/AMPK－mTOR信號通路蛋白的表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 缺血性心力衰竭；芪紅膠囊；能量代謝；線粒體功能障礙；蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶－哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.12.006

Effect of Qihong Capsule on Myocardial Mitochondrial Energy Metabolism and AKT/AMPK－mTOR Signaling Pathway in Rats with Ischemic Heart Failure

ZHAI Xueqin， ZHU Pengcheng， WANG Xiaofeng， FAN Hui， JIANG Haibing， YANG Yi

State Key Laboratory of Pathogenesis， Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia， The Fourth Clinical College of Xinjiang Medical University， Urumqi， 830000， China

Corresponding Author WANG Xiaofeng， E－mail： wxf87112008@163.com

Abstract Objective：To explore the effect of Qihong capsule on mitochondrial energy metabolism in rats with ischemic heart failure（IHF） and its regulatory mechanism.Methods：Thirty－six male sprague－dawley rats were randomly divided into sham operation group（n＝6） and model group（n＝30） .The IHF model was prepared by ligation of the left anterior descending coronary artery.Sucessfully molded rats were randomly divided into 5 groups according to their body weight：model group，positive drug group，low－dose Qihong capsule group［QH－L，0.324 g/（kg·d）］，medium－dose Qihong capsule group［QH－M，0.648 g/（kg·d），high－dose Qihong capsule group ［QH－H，1.296" g/（kg·d）］，the rats in sham operation group and model group were given the same volume of normal saline （10 mL/kg） by gavage once a day.After four weeks of continuous intervention，left ventricular end－diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end－systolic diameter（LVESD），left ventricular ejection fraction（LVEF） and fractional shortening of short axis（FS） were measured by M－mode ultrasound to determine the structure and function of the heart.Deoxyribonucleotide end transferase mediated notch end labeling（TUNEL） staining was used to observe the pathological morphology of myocardial tissue.Enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the levels of serum glucose（Glu），lactate（LD），ketone bodies（KB），and free fatty acids（FFA）.Mitochondrial permeability transition pore（mPTP） detection kit was used to detect the fluorescence intensity.Mitochondrial membrane potential detection kit（JC－1 method） was used to detect mitochondrial membrane potential.MitoSOXTM Red mitochondrial superoxide indicator was used to detect the content of reactive oxygen species（ROS），and Western Blot was used to detect the protein expression of protein kinase B（AKT），AMP－activated protein kinase（AMPK），and mammalian target of rapamycin（mTOR） in the myocardium.Results：Compared with sham operation group，LVEDD，LVESD，apoptosis rate，Glu，LD，F(xiàn)FA，KB，mitochondrial membrane potential，ROS，phosphorylated AMPK（p－AMPK） protein expression levels increased in model group（P＜0.05）.The expression levels of LVEF，F(xiàn)S，mPTP，phosphorylated AKT（p－AKT），and phosphorylated mTOR（p－mTOR） decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the levels of Glu，LD，F(xiàn)FA，KB，mitochondrial membrane potential，and ROS in QH－L group，QH－M group，QH－H group，and positive drug group significantly decreased（P＜0.05），and the expression levels of mitochondrial mPTP and p－AKT significantly increased（P＜0.05）.The LVEDD，apoptosis rate，and p－AMPK in QH－M group and QH－H group significantly decreased（P＜0.05），while LVEF and FS significantly increased（P＜0.05）.Compared with QH－L group，the levels of LVEF，F(xiàn)S，LD，mitochondrial mPTP and p－AKT in QH－H" group and positive drug group" significantly increased，while the expression levels of LVESD，ROS and p－AMPK decreased（P＜0.05）.Compared with QH－L group，the levels of LVEF，F(xiàn)S，mitochondrial mPTP，and p－AKT in QH－H group and positive drug group significantly increased，while the expression levels of LVESD，ROS and p－AMPK decreased（P＜0.05）.Conclusion：Qihong capsule can regulate the process of myocardial metabolic substrate in IHF rats，reduce the over－production of ROS，protect the function of mitochondria，activate AKT to up－regulate the activity of mTOR，inhibit the apoptosis and alleviate the injury of myocardial cells，the mechanism of myocardial protection by regulating energy metabolism may be related to the expression of AKT/AMPK－mTOR signaling pathway protein.

Keywords ischemic heart failure; Qihong capsule; energy metabolism; mitochondrial dysfunction;" protein kinase B/AMP－activated protein kinase－mammalian target of rapamycin signaling pathway

缺血性心力衰竭（ischemic heart failure，IHF）是冠狀動脈粥樣硬化病變使心肌的供氧和需氧不平衡導致心肌細胞凋亡、壞死，心腔擴大，發(fā)生心力衰竭［1］，是冠心病嚴重的并發(fā)癥，每年死亡人數(shù)高達900萬人，是全球主要的死亡原因［2］。盡管及時行經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）術(shù)，仍不能降低其死亡率及發(fā)病率。有研究表明，心肌線粒體功能障礙可導致心肌病，長期的線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡會導致心力衰竭［3］，線粒體作為心肌細胞能量代謝的主要調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)細胞代謝和細胞凋亡［4］，是細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源［5］，ROS過度生成可損傷線粒體，導致線粒體功能失調(diào)，繼而線粒體膜電位降低，線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）異常開放，導致線粒體功能障礙及細胞凋亡［6－8］。心室重構(gòu)是導致心力衰竭的重要機制，而細胞凋亡是加重心室重構(gòu)和心力衰竭的重要因素［9］。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶AKT/AMPK－哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路是線粒體細胞凋亡的重要通路，通過調(diào)節(jié)心肌細胞能量代謝，維持能量穩(wěn)態(tài)［10］。mTOR主要受上游信號AKT和AMPK的調(diào)控，AKT激活后通過上調(diào)mTOR抑制細胞凋亡，AMPK激活后可下調(diào)mTOR活性促進細胞凋亡［11］。因此，AKT/AMPK－mTOR信號通路對線粒體細胞能量具有雙向調(diào)節(jié)作用，干預該信號通路可能是發(fā)揮能量穩(wěn)態(tài)作用、防治心力衰竭的有效途徑。

中醫(yī)認為IHF屬于“心衰”的范疇，“心衰”一詞最早見于西晉王叔和《脈經(jīng)·脾胃病》：“心衰則伏，肝微則沉，故令脈伏而沉”。國醫(yī)大師沈?qū)毞淌谡J為心衰病臨床表現(xiàn)為心悸、水腫、胸痛、呼吸困難、喘憋等不同證候，以痰瘀互結(jié)、痰瘀同病為其主要的病機?；谠摬C特征，第七批全國老中醫(yī)藥專家學術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導老師王曉峰教授在學習傳承國醫(yī)大師沈?qū)毞淌诘膶W術(shù)思想及臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制了具有痰瘀同治、扶正祛邪治療心衰病的中藥芪紅膠囊，其主要由黃芪、桂枝、紅景天、丹參、葶藶子、澤瀉組成。本課題組前期研究基礎(chǔ)已證實，該方可以提高心力衰竭大鼠Na＋－K＋－ATPase及Ca2＋－ATPase含量，為心肌提供能量，改善心力衰竭癥狀，提高心功能［12］。因此，本研究基于線粒體介導的細胞凋亡在能量代謝領(lǐng)域的新熱點，以AKT/AMPK－mTOR信號通路為切入點，采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法制備大鼠IHF模型探討芪紅膠囊對IHF大鼠線粒體能量代謝及AKT/AMPK－mTOR信號通路的影響，為芪紅膠囊防治IHF發(fā)揮心肌保護機制提供新的實驗室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇6～8周齡健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量210～230 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號 SYXK（新）2021－0003，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對濕度60%～80%，晝夜節(jié)律，自由進食、飲水。所有動物實驗程序及處置符合實驗動物照料和使用原則，均經(jīng)新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：IACUC－20230227－22）。

1.2 實驗藥物

1）干預藥物：芪紅膠囊（購自新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司，批號：9220409，每粒0.4 g）。芪紅膠囊的臨床用藥量為7.2 g/d，根據(jù)“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”計算（人的用量/70 kg×6.3）［13］，分別給予芪紅膠囊干預，低劑量組0.324 g/（kg·d）、中劑量組0.648 g/（kg·d）、高劑量組1.296 g/（kg·d）。用開水溶解，放至4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）陽性藥物：曲美他嗪片［施維雅（天津）制藥有限公司，生產(chǎn)批號2020668］。3）麻醉藥物：舒泰509（法國維克有限公司，生產(chǎn)批號8SKGA），鹽酸賽拉嗪注射液（圣達動物藥品有限公司，生產(chǎn)批號20220301）。

1.3 試劑

葡萄糖（Glu）、乳酸（LD）、游離脂肪酸（FFA）、酮體（KB）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A154－1－1，A019－2－1，A042－2－1，H539－1－1），脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）凋亡檢測試劑盒－POD（武漢博士德，批號MK1020），mPTP檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C2009S），線粒體膜電位檢測試劑盒（JC－1法，南京建成生物工程研究所，批號G009－1－3），MitoSOXTMRed線粒體超氧化物指示劑（賽默飛世爾科技公司，批號M36008），蛋白酶抑制劑（博士德生物公司，批號AR1178），蛋白預染Marker（北京索萊寶科技有限公司，批號PR1910），山羊抗兔IgG Hamp;L（HRP），山羊抗小鼠IgG Hamp;L（HRP），AKT（pan）（C67E7）Rabbit mAb #4691，Phospho－AKT（Ser473）抗體，重組Anti－mTOR抗體［EPR390（N）］，重組Anti－mTOR（phospho S2448）抗體［EPR426（2）］，均為美國Abcam公司生產(chǎn)，批號分別為ab205718，ab205719，4691S，ab81283，ab134903，ab109268；AMPKα Antibody #2532，Phospho－AMPKα（Thr172）（40H9）Rabbit mAb #2535（美國CST公司，批號分別為2532S，2535S）。

1.4 儀器

5415D Centrifuge離心機（德國Eppendorf公司），xMarkTM型酶標儀（Bio－Rad），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏試驗設(shè)備有限公司），免疫組化染色孵育盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），顯微鏡（Nikon生物顯微鏡），BF－700流式細胞儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司），DW－HL388型－80 ℃低溫冰箱、BCD－249LCK型－20 ℃低溫冰箱（合肥美菱公司），DNP－9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏試驗設(shè)備有限公司），MadLab生物信息化醫(yī)學信號采集處理系統(tǒng)（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司），化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司），免疫組化染色孵育盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio－Rad公司），電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 模型構(gòu)建及評價

36只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機抽取6只為假手術(shù)組（SOG），30只為模型組。模型組采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法［14－15］制備IHF大鼠模型，大鼠術(shù)前12 h禁食水，稱體質(zhì)量，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液22.5 mL、舒泰50（60 mg/kg）與鹽酸賽拉嗪（0.5 mg/kg）混合麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，腹部手術(shù)區(qū)備皮、消毒，術(shù)者手部同時用乙醇擦拭消毒。大鼠皮下插針記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖（ECG），先記錄穩(wěn)定1 min的心電圖，連接無創(chuàng)氣管插管及小動物人工呼吸機，于大鼠第3肋與第4肋間打開胸腔，暴露心臟，分離并結(jié)扎左冠狀動脈前降支，進針深度控制在1.5 mm左右，于血管與結(jié)扎線之間穿硅膠管，缺血30 min后剪斷結(jié)扎線，取出硅膠管，再灌注2 h，結(jié)扎后觀察并記錄心電圖，以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白視作造模成功，然后縫合皮膚。假手術(shù)組只進行開胸手術(shù)，暴露心臟，但不進行結(jié)扎，其余操作同模型組。術(shù)后將大鼠仰臥放回單籠飼養(yǎng)并給予保溫直到蘇醒歸籠。蘇醒后，每只腹腔注射40×104 U青霉素，連續(xù)注射3 d。

1.5.2 分組及干預

造模成功后連續(xù)喂養(yǎng)7 d，術(shù)后按體質(zhì)量隨機分為5組：模型組、陽性藥組、芪紅膠囊低劑量組［QH－L組，0.324 g/（kg·d）］、芪紅膠囊中劑量組［QH－M組，0.648g/（kg·d）］、芪紅膠囊高劑量組［QH－H組，1.296 g/（kg·d）］，每組6只。其中QH－L組、QH－M組、QH－H組大鼠分別給予相應(yīng)濃度的芪紅膠囊溶液灌胃，陽性藥組給予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積的生理鹽水，均按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)干預4周。每天觀察大鼠精神、運動、糞便、皮毛等狀態(tài)及飲食飲水行為有無異常。

1.5.3 樣本采集及制備

1.5.3.1 血標本

灌胃4周后，各組大鼠均禁食不禁水12 h，按照以下操作進行標本采集：大鼠從腹主動脈取血，分離血清，3 500 r/min，4 ℃，離心15 min，使血清分離，－80 ℃冰箱保存，用于血清學檢測。

1.5.3.2 心肌組織標本

取血后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g，麻醉后打開胸腔，無菌條件下取心臟組織標本，預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干。再將心臟沿左室長軸分為2份，取材過程盡量減小對組織的牽拉、挫傷與擠壓等機械損傷，其中一份迅速投入2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定，以備病理組織檢測；另一份心臟組織置于液氮中保存，以備蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測。

1.6 指標檢測

1.6.1 心臟結(jié)構(gòu)及功能檢測

實驗結(jié)束后，各組大鼠麻醉后，仰臥位固定，胸部備皮，選用高頻探頭（頻率為6～13 MHz），與胸骨成20～30°夾角，顯示心臟沿二尖瓣口至心尖方向的左室長軸切面。在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動圖，測定左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）。每組數(shù)據(jù)取連續(xù)3個心動周期的平均值。

1.6.2 TUNEL染色觀察心肌組織病理形態(tài)

制備大鼠心肌組織后，按照TUNEL凋亡檢測試劑盒方法檢測，采用TUNEL標記凋亡的細胞核，光學顯微鏡下觀察心肌細胞有無肥大、變性、壞死； 間質(zhì)有無充血、水腫、炎性細胞浸潤、纖維結(jié)締組織增生；心內(nèi)膜、心外膜有無充血、水腫、炎性細胞浸潤。于400倍視野計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算細胞凋亡率。細胞凋亡

率（%）＝凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6.3 血清學檢測

應(yīng)用ELISA檢測各組大鼠血清Glu、LD、KB和FFA的含量，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書執(zhí)行，測量標準孔和樣本孔的吸光度A，根據(jù)所得標準曲線計算出樣品濃度。

1.6.4 線粒體膜電位檢測

收集各組新鮮采集的大鼠心臟組織，剪碎后放在篩網(wǎng)上，以眼科鑷或刮刀輕研磨組織塊，邊研磨邊用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，將組織研磨完。收集細胞懸液，500×g離心10 min，去上清留沉淀。用預冷的PBS洗滌2遍，加入500 μL 1×JC－1染色液重懸細胞，37 ℃孵育30 min，加入500 μL PBS重選細胞，過200目篩網(wǎng)，制成單細胞懸液，按照

JC－1法檢測細胞線粒體蛋白濃度，用陰性對照管調(diào)節(jié)前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）和熒光通道的電壓，并在此電壓條件下，觀察樣本線粒體膜電位△Ψm水平變化。

1.6.5 mPTP檢測

收集各組新鮮采集的大鼠心臟組織，加入1 mL Calcein AM染色液，取10 μL的Calcein AM （1 000×）和100 μL促溶劑（100×），加入到10 mL的檢測緩沖液（Assay buffer）中混勻，重懸細胞，同時添加100 μL的氯化鈷（CoCl2）（100×）溶液；37 ℃孵育30 min，孵育完成后，1 000 r/min室溫離心5 min收集細胞。加入500 μL PBS重懸細胞，過200目篩網(wǎng)，制成單細胞懸液，在最佳激發(fā)波長494 nm、發(fā)射波長517 nm下［異硫氰酸熒光素（FITC）通道］使用mPTP檢測試劑盒檢測其熒光強度。

1.6.6 線粒體ROS含量檢測

收集各組新鮮采集的大鼠心臟組織，制備單細胞懸液。每管加入1 mL PBS與1 μL 5 mmol/L MitoSOXTM Red指示劑，MitoSOXTM Red終濃度為5 μmol/L。置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育30 min，收集細胞，PBS洗滌2次，用PBS重懸細胞至1×106個/mL，取500 μL細胞懸液至5 mL流式管中，在最佳激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長580 nm下（PE通道），使用MitoSOXTM Red 線粒體超氧化物指示劑，流式細胞儀檢測其熒光強度。

1.6.7 Western Blot檢測大鼠心肌組織AKT、AMPK、mTOR蛋白表達

提取各組大鼠心臟組織樣本，首先在組織樣本中加入RIPA裂解液提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法測定目標蛋白濃度以及p－AKT、p－AMPK、p－mTOR蛋白磷酸化水平，經(jīng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺（SDS－PAGE）凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)染至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，浸泡于Western Blot封閉液后封閉，加入相應(yīng)一抗，稀釋比例AKT（1∶1000），p－AKT（1∶1000），AMPK（1∶800），

p－AMPK（1∶800），mTOR（1∶800），p－mTOR（1∶500），β－actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min。加入相應(yīng)稀釋的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min。用ChemiScope mini化學發(fā)光儀檢測顯影，Western Blot檢測并分析AKT、AMPK、mTOR蛋白表達以及p－AKT、p－AMPK、p－mTOR蛋白磷酸化水平。條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進行讀取處理，以β－actin為內(nèi)參，用實驗所得灰度值除以內(nèi)參灰度值得到相應(yīng)灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗（方差齊）或Dunnett′s－T3檢驗（方差不齊）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應(yīng)用GraphPad Prism 5.0進行圖像繪制。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

假手術(shù)組大鼠活動自如，兩眼有神，反應(yīng)迅速，飲食、飲水自如，糞便成形，皮毛有光澤；模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組大鼠活動稍有笨拙，精神不振，毛發(fā)無光澤，進食、飲水量減少，6組均無大鼠死亡。

2.2 造模后心電圖表現(xiàn)

大鼠皮下插針記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，于左冠狀動脈前降支結(jié)扎后模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組QRS波群增高、增寬、ST段抬高。假手術(shù)組大鼠心電圖基本正常，無QRS波群增高、增寬、ST段抬高現(xiàn)象。詳見圖1。 造模后觀察心肌，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組均以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白，提示造模成功。

2.3 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能比較

與假手術(shù)組比較，模型組LVEDD、LVESD均明顯升高，LVEF、FS均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－M組、QH－H組LVESD明顯縮小，QH－L組、QH－M組、QH－H組LVEF、FS明顯升高，陽性藥組LVEDD、LVESD明顯降低，LVEF、FS明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組LVESD明顯降低，QH－M組、QH－H組LVEF、FS明顯升高，陽性藥組LVEDD、LVESD明顯縮小，LVEF、FS明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組彩超結(jié)果見圖2，心臟參數(shù)見表1。

2.4 各組大鼠心肌細胞形態(tài)學及凋亡情況比較

TUNEL染色顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)量增多，心肌細胞肥大、變性、壞死，間質(zhì)充血、水腫、炎性細胞浸潤、纖維結(jié)締組織增生，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組心肌細胞凋亡數(shù)量未見明顯減少，部分心肌細胞輕度肥大，間質(zhì)充血、水腫、炎性細胞浸潤，凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），QH－M組、QH－H組及陽性藥組心肌細胞凋亡數(shù)量減少，少量心肌細胞肥大、變性，少量壞死，凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2、圖3。

2.5 各組大鼠血清中Glu、LD、FFA、KB含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清Glu、LD、FFA、KB含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組Glu、LD、FFA、KB含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組LD降低，陽性藥組Glu、LD、FFA含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.6 各組大鼠線粒體膜電位比較

與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體膜電位水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體膜電位水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，陽性藥組線粒體膜電位水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.7 各組大鼠線粒體mPTP水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體mPTP水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體mPTP水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組、陽性藥組線粒體mPTP水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.8 各組大鼠線粒體ROS水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體ROS水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體ROS水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組和陽性藥組線粒體ROS水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.9 各組大鼠心肌組織中AKT、AMPK、mTOR通路蛋白表達比較

Western Blot檢測結(jié)果顯示，各組AKT、AMPK、mTOR總蛋白含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），p－AKT、p－AMPK、p－mTOR通路具有可比性。與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組心肌組織p－AKT、p－mTOR蛋白表達水平下降，p－AMPK蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組大鼠心肌組織p－AKT蛋白表達水平明顯升高，QH－M組、QH－H組和陽性藥組大鼠心肌組織p－AMPK蛋白表達水平下降，QH－H組和陽性藥組大鼠心肌組織p－mTOR蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－M、QH－H組和陽性藥組大鼠心肌組織p－AKT蛋白表達水平升高，p－AMPK蛋白表達水平下降，陽性藥組p－mTOR蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表5及圖4。

3 討 論

近年來，中華中醫(yī)藥學會、中國中西醫(yī)結(jié)合學會先后發(fā)布了《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識》《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》等，對心衰病的基本證候特征、證候演變規(guī)律、臨床辨治等進行梳理、總結(jié)、歸納、評價，為進一步規(guī)范慢性心力衰竭的中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合診治發(fā)揮了積極的作用。共識中以病證結(jié)合為切入點，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)家臨床經(jīng)驗對心衰病因病機進行總結(jié)，心衰病的基本證候特征為虛實夾雜，痰、瘀是心衰的重要致病病因，相互轉(zhuǎn)化，相互滋生，以血瘀為主，兼雜痰濕、水飲，更有氣血、陰陽的虛損，痰與瘀互為因果，共同致病，在證候演變中血瘀、痰飲始終貫穿于心衰病發(fā)生、發(fā)展，二者分別為氣血和津液的病理性改變，兩者又不斷疊加促進心衰病演變惡化［16－20］。結(jié)合以上病因病機，芪紅膠囊組方中重用黃芪為君，善補胸中大氣，大氣壯旺，氣行瘀血則通，痰濁則化，即“大氣一轉(zhuǎn)，其結(jié)乃散”。桂枝、紅景天共為臣藥，桂枝祛痰通脈、痰瘀均治。紅景天為氣中血藥，補氣養(yǎng)血，扶正固本。丹參、葶藶子、澤瀉為佐使藥，下氣平喘、降氣化痰、利水消腫。諸藥配伍，補中有通、通中有補、通補并用，扶正祛邪。本課題組前期研究表明，芪紅方能夠增加冠狀動脈血流量及靜脈血氧含量，使得心肌氧供應(yīng)充分，降低氧利用率，在此基礎(chǔ)上，進一步增加心輸出量和改善心臟功能。研究表明，心力衰竭是一種具有嚴重線粒體功能障礙的生物能量疾?。?1］，線粒體中Glu、LD、FFA、KB的氧化有助于心肌細胞三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，IHF存在代謝產(chǎn)物的過度堆積，Glu、LD、FFA、KB不能被充分利用，降低代謝物活力，經(jīng)過芪紅膠囊干預后調(diào)節(jié)心肌底物代謝進程，顯著提高模型大鼠的心功能，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，抑制心肌細胞凋亡。心肌對代謝底物的如何選擇和利用，具體調(diào)控機制是目前研究的熱點。線粒體能量代謝在心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，甚至決定性作用［23］。新的證據(jù)表明ROS在正常生理狀態(tài)下，心肌細胞產(chǎn)生少量的ROS，其在細胞信號傳導中起作用，并且很容易從細胞中清除。在病理狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生的速率超過清除的速率，導致氧化應(yīng)激，ROS與細胞和線粒體組分（如蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)和其他分子）相互作用，觸發(fā)線粒體功能障礙，導致線粒體膜電位消失和mPTP持續(xù)開放［24］，并伴隨嚴重的心臟損傷［25］。本研究通過左冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立IHF模型，以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白，提示造模成功，亦證實心肌細胞缺血、缺氧，衰竭的心肌細胞線粒體內(nèi)ROS的大量生成，導致線粒體功能受損［26］。芪紅膠囊干預后可以減少IHF大鼠心肌細胞ROS的產(chǎn)生，降低mPTP的通透性，減輕線粒體功能障礙，緩解心肌損傷。

研究表明，AKT/AMPK－mTOR信號通路具有雙向調(diào)節(jié)能量的作用，AMPK通過感知一磷酸腺苷（AMP）、ATP和二磷酸腺苷（ADP）的比率變化而被激活，參與ATP的代謝過程，恢復能量平衡。當心功能低下時，機體會對心肌“能量饑餓狀態(tài)”產(chǎn)生應(yīng)激性代償反應(yīng)，通過心肌細胞AMPK調(diào)節(jié)組織的代謝來控制能量平衡，是調(diào)節(jié)機體能量平衡的總開關(guān)［27］。mTOR主要受上游信號AKT和p－AMPK的調(diào)控發(fā)揮能量雙向調(diào)節(jié)作用［28］。本研究結(jié)果顯示，IHF大鼠心肌p－AMPK蛋白含量升高，p－AKT、p－mTOR的蛋白含量下降，提示AKT/AMPK－mTOR信號通路參與了心力衰竭細胞線粒體能量代謝的生物發(fā)生進程，芪紅膠囊干預后能夠明顯升高p－AKT的蛋白含量，降低p－AMPK的蛋白含量，表明AKT高表達后通過激活mTOR抑制心肌細胞凋亡，改善線粒體功能。而QH－H組AKT激活程度更強，表現(xiàn)為AMPK、mTOR活性表達下調(diào)，促進心肌能量生成，進一步改善心力衰竭［29］，機制可能與AKT/AMPK－mTOR信號通路蛋白的表達有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芪紅膠囊可以提高IHF大鼠的心功能，抑制細胞凋亡，抑制mPTP的開放程度，減輕線粒體功能障礙，緩解心肌損傷，AKT/AMPK－mTOR信號通路參與心力衰竭細胞線粒體能量代謝的生物發(fā)生進程，并能夠通過激活p－AKT活性，下調(diào)p－AMPK、ROS蛋白表達，發(fā)揮改善心力衰竭的作用。本研究為深入探索芪紅膠囊治療心力衰竭獨特的生物學效應(yīng)機制提供了新的參考依據(jù)。

參考文獻：

［1］RAMACHANDRA C J A，HERNANDEZ－RESENDIZ S，CRESPO－AVILAN G E，et al.Mitochondria in acute myocardial infarction and cardioprotection［J］.EBioMedicine，2020，57：102884.

［2］WHO.Global health" estimates 2016：deaths by cause，age，sex，by country and by region，2000－2016［R］.Geneva，Switzerland：World Health Organization，2018.

［3］FORTE M，SCHIRONE L，AMERI P，et al.The role of mitochondrial dynamics in cardiovascular diseases［J］.British Journal of Pharmacology，2021，178（10）：2060－2076.

［4］MONGELLI A，MENGOZZI A，GEIGER M，et al.Mitochondrial epigenetics in aging and cardiovascular diseases［J］.Frontiers in Cardiovascular Medicine，2023，10：1204483.

［5］ATICI A E，CROTHER T R，NOVAL RIVAS M.Mitochondrial quality control in health and cardiovascular diseases［J］.Frontiers in Cell and Developmental Biology，2023，11：1290046.

［6］LONG K L，ZHAO Z Y，CHEN J，et al.Yang－Xin－Xue Keli exerts therapeutic effects via regulating mitochondrial homeostasis and function in doxorubicin－induced rat heart failure［J］.Frontiers in Pharmacology，2022，13：931453.

［7］CAI C，WU F，ZHUANG B J，et al.Empagliflozin activates Wnt/β－catenin to stimulate FUNDC1－dependent mitochondrial quality surveillance against type－3 cardiorenal syndrome［J］.Molecular Metabolism，2022，64：101553.

［8］LI A Q，GAO M，LIU B L，et al.Mitochondrial autophagy：molecular mechanisms and implications for cardiovascular disease［J］.Cell Death amp; Disease，2022，13：444.

［9］任培華，王鵬，廖東江，等.養(yǎng)心康片通過（Akt/AMPK）－mTOR通路抑制心梗后心力衰竭模型兔心肌細胞凋亡的機制［J］.中國實驗方劑學雜志，2018，24（16）：124－130.

［10］LUO Q，SONG Y Z，KANG J J，et al.mtROS－mediated Akt/AMPK/mTOR pathway was involved in copper－induced autophagy and it attenuates copper－induced apoptosis in RAW264.7 mouse monocytes［J］.Redox Biology，2021，41：101912.

［11］陳可冀，吳宗貴，朱明軍，等.慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（2）：133－141.

［12］陳繼紅，李秀芬，何英，等.益氣溫陽通瘀化痰法對心力衰竭大鼠心肌能量代謝作用機制的研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14（16）：1854－1856.

［13］徐叔云.藥理實驗方法學［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1861－1863.

［14］任建勛，尹春園，史雅紅，等.睡眠剝奪復合冠狀動脈左前降支結(jié)扎建立心力衰竭氣虛血瘀證大鼠模型的評價［J］.中醫(yī)雜志，2020，61（5）：428－434.

［15］ZHANG Y H，DEDKOV E I，LEE B C，et al.Thyroid hormone replacement therapy attenuates atrial remodeling and reduces atrial fibrillation inducibility in a rat myocardial infarction－h(huán)eart failure model［J］.Journal of Cardiac Failure，2014，20（12）：1012－1019.

［16］胡鏡清.痰瘀互結(jié)證新論［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2023，29（1）：12－13.

［17］孫會君，丁麗，李廣兵，等.化痰活血通脈方聯(lián)合心臟康復運動治療慢性心力衰竭痰瘀互結(jié)型患者的臨床研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2023，18（10）：2070－2075.

［18］周雯姣，張漢芹，周小盼，等.從“痰瘀互結(jié)”與NF－κB的關(guān)系探討慢性心力衰竭病機［J］.福建中醫(yī)藥，2021，52（6）：33－35.

［19］傅俊銘，孫藝榕，羅鈺山，等.黃春林教授治療慢性心衰經(jīng)驗［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2023，21（21）：65－67.

［20］黃春輝，李七一.化痰祛瘀法治療慢性心力衰竭［J］.中醫(yī)雜志，2018，59（6）：530－531.

［21］BERTERO E，MAACK C.Metabolic remodelling in heart failure［J］.Nature Reviews Cardiology，2018，15（8）：457－470.

［22］BEDI K C Jr，SNYDER N W，BRANDIMARTO J，et al.Evidence for intramyocardial disruption of lipid metabolism and increased myocardial ketone utilization in advanced human heart failure［J］.Circulation，2016，133（8）：706－716.

［23］張冀鑫，劉芬，張桐，等.抑制P53上調(diào)GLUT4改善高糖合并缺血缺氧誘導的心肌細胞糖代謝紊亂及減輕細胞凋亡［J］.中國動脈硬化雜志，2023，31（3）：212－217.

［24］WU T T，LI Z G，WEI Y J.Advances in understanding mechanisms underlying mitochondrial structure and function damage by ozone［J］.The Science of the Total Environment，2023，861：160589.

［25］孫俠，趙倩茹，袁偉.心肌線粒體能量代謝在心血管疾病中的研究進展［J］.中國心血管雜志，2022，27（1）：90－93.

［26］PEOPLES J N，SARAF A，GHAZAL N，et al.Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in heart disease［J］.Experimental amp; Molecular Medicine，2019，51：1－13.

［27］陳翊，林凱旋，李雪山，等.益氣溫陽逐水方通過調(diào)控水通道蛋白和心肌能量代謝改善心力衰竭的作用及機制研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2023，41（10）：48－52.

［28］任培華，王鵬，廖東江，等.養(yǎng)心康片通過Akt/AMPK－mTOR通路對心肌梗死后心力衰竭模型兔心肌細胞自噬的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2020，31（1）：16－19.

［29］TIMM K N，TYLER D J.The role of AMPK activation for cardioprotection in doxorubicin－induced cardiotoxicity［J］.Cardiovascular Drugs and Therapy，2020，34（2）：255－269.

（收稿日期：2023－12－03）

（本文編輯王麗）

基金項目 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金資助項目（No.2022D01C558）；省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室開放課題資助項目（No.SKL－HIDCA－2021－42）

通訊作者 王曉峰，E－mail：wxf87112008@163.com

引用信息 翟雪芹，朱鵬程，王曉峰，等.芪紅膠囊對缺血性心力衰竭大鼠心肌線粒體能量代謝及AKT/AMPK－mTOR信號通路的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（12）：2150－2158.