miR－483－3p靶向調(diào)節(jié)AT2R/AKT/NO通路對甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷的影響

摘要 目的：探討miR－483－3p通過調(diào)節(jié)血管緊張素2型受體/蛋白激酶B/一氧化氮（AT2R/AKT/NO）通路對甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷的影響。方法：將大鼠分為5組，即對照組、模型組、miR－483－3p mimics mock組、miR－483－3p mimics組和miR－483－3p mimics＋PD123319組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠均通過皮下注射280 μg/kg左旋甲狀腺素鈉制備甲狀腺功能亢進(jìn)癥模型，造模成功后，miR－483－3p mimics mock組、miR－483－3p mimics組分別給予尾靜脈注射miR－483－3p mimics mock、miR－483－3p mimics；miR－483－3p mimics＋PD123319組尾靜脈注射miR－483－3p mimics和3 mg/kg AT2R拮抗劑PD123319；對照組注射等量的生理鹽水，連續(xù)7 d。酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清中三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺素（TSH）以及白細(xì)胞介素（IL）－2、IL－10、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、IL－6水平；硝酸還原酶法檢測血清中NO水平；血糖儀檢測大鼠空腹血糖（FBG）含量；全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測胰島素（FINS）含量，并計算胰島素抵抗指數(shù)（IRI）值；蘇木精－伊紅染色觀察心血管病理損傷；TdT介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測心肌細(xì)胞凋亡；實時熒光定量PCR（qRT－PCR）檢測心臟組織中miR－483－3p水平；蛋白免疫印跡法檢測AT2R、AKT、磷酸化AKT（p－AKT）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷酸化eNOS（p－eNOS）水平。結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠心臟組織中miR－483－3p表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），血清中T3、T4、FT3、FT4、FBG水平、IRI值、IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6及心肌細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05），TSH、NO水平及心臟組織中AT2R蛋白水平、p－AKT/AKT、p－eNOS/eNOS明顯降低（P＜0.05），心血管炎性損傷加重。miR－483－3p過表達(dá)可使上述各項指標(biāo)均得到逆轉(zhuǎn)，炎性損傷得到改善（P＜0.05）。與miR－483－3p mimics組相比，miR－483－3p mimics＋PD123319組大鼠心血管損傷加重，血清中T3、T4、FT3、FT4、FBG水平、IRI值、IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6及心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），TSH、NO、AT2R蛋白水平以及p－AKT/AKT、p－eNOS/eNOS明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：miR－483－3p可通過激活A(yù)T2R/AKT/NO通路，改善甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷。

關(guān)鍵詞 甲狀腺功能亢進(jìn)癥；miR－483－3p；血管緊張素2型受體；心血管損傷；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.12.007

甲狀腺功能亢進(jìn)癥是常見的內(nèi)分泌疾病，主要是甲狀腺功能的加強和過多分泌甲狀腺激素導(dǎo)致的，臨床上表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增加、代謝及炎癥反應(yīng)增強，還會引起心血管疾病等并發(fā)癥［1－2］。甲狀腺功能亢進(jìn)癥可能發(fā)生在包括兒童在內(nèi)的所有年齡段，20～50歲居多，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量甚至危及生命［3］。研究表明，炎性因子可使胰島素敏感性降低，誘發(fā)甲狀腺功能亢進(jìn)癥病人出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致心臟病理性損傷，促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生［4－5］。miR－483－3p是miRNA家族的一員，除了在腫瘤細(xì)胞［6］中起作用外，還與心肌缺血再灌注損傷［7］、急性心肌梗死［8］有關(guān)。另外，有文獻(xiàn)顯示，miR－483－3p可調(diào)控腎素－血管緊張素的多個組分，對心血管疾病影響較大［9］。因此，推測miR－483－3p可能影響甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷。本研究通過制備甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠模型，并探討miR－483－3p對甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷的影響，為甲狀腺功能亢進(jìn)癥的臨床治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級SD大鼠50只，體質(zhì)量160～200 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK（冀）2021－006。大鼠飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，本研究涉及的動物實驗均通過本院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑、儀器

左旋甲狀腺素鈉購自湖北阡陌生物科技有限公司；三碘甲狀腺原氨酸（triodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triodothyronine，F(xiàn)T3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）檢測試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；miR－483－3p mimics mock、miR－483－3p mimics購自上海生工生物公司；血管緊張素2型受體（AT2R）拮抗劑PD123319購自上海芮暉化工科技有限公司；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）－2、IL－10、IL－6、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor α，TNF－α）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司；實時熒光定量PCR（qRT－PCR）試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；蘇木精－伊紅（HE）試劑購自北京索萊寶生物公司；TdT介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TdT－mediated dUTP Nick－End Labeling，TUNEL）試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物公司；AT2R、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p－AKT）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、磷酸化eNOS（p－eNOS）一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司。

血糖儀購自上海寰熙醫(yī)療器械有限公司；Cobas e601全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀購自北京邁潤醫(yī)療器械有限公司；酶標(biāo)儀購自山東博科科學(xué)儀器有限公司；qRT－PCR儀購自北京諾亞威儀器儀表有限公司；光學(xué)顯微鏡購自上海炳宇光學(xué)儀器有限公司。

1.3 動物分組與模型制備

將大鼠分為5組：對照組、模型組、miR－483－3p mimics mock組、miR－483－3p mimics組和miR－483－3p mimics＋PD123319組，每組10只。參照王萬民等［10］研究方法制備甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠模型，除對照組外，其他各組大鼠每日皮下注射280 μg/kg左旋甲狀腺素鈉，連續(xù)7 d。造模結(jié)束后大鼠禁食12 h，從尾靜脈取血，測得血清中T3、T4、FT3、FT4水平升高，TSH水平降低，說明模型制備成功。而對照組大鼠則注射等量的生理鹽水。

甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠模型制備完成后，miR－483－3p mimics mock組和miR－483－3p mimics組尾靜脈注射miR－483－3p mimics mock和miR－483－3p mimics，miR－483－3pmimicsmock是miR－483－3p mimics打亂之后的序列，與任何基因均不同源；miR－483－3p mimics＋PD123319組大鼠于尾靜脈注射miR－483－3p mimics的同時注射3 mg/kg AT2R拮抗劑PD123319［11］；對照組大鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.4 甲狀腺功能指標(biāo)檢測

各組SD大鼠處死后，于腹主動脈取血10 mL，其中4 mL離心后取上清液（血清），利用ELISA試劑盒檢測T3、T4、FT3、FT4、TSH水平。

1.5 大鼠空腹血糖（FBG）水平、胰島素抵抗指數(shù)（IRI）測定

取各組大鼠腹主動脈血（全血）3 mL，使用血糖儀檢測FBG含量，并使用全自動電化學(xué)分析儀檢測其胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）含量，并計算IRI（FBG×FINS/22.5）。

1.6 炎性因子及NO水平測定

取各組大鼠腹主動脈血3 mL進(jìn)行離心，并取上清液，然后按照ELISA試劑盒說明書的操作方法檢測炎性因子IL－2、IL－10、TNF－α、IL－6水平，并使用硝酸還原酶法檢測NO水平。

1.7 miR－483－3p水平檢測

將各組大鼠麻醉后處死進(jìn)行解剖，將心臟組織分離后剪碎，一部分制備成組織勻漿，將勻漿的一半采用Trizol法提取總RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT－PCR試劑盒和PCR儀器對miR－483－3p進(jìn)行定量，并使用2－ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析，U6作為參照基因。miR－483－3p的引物序列：正向引物為5′－GCTGACTCACTCCTCCCCTC－3′，反向引物為5′－TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC－3′；U6引物序列：正向引物為5′－GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT－3′，反向引物為5′－GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT－3′。剩余組織則制備成石蠟切片備用。

1.8 心血管組織病理變化的觀察

將心臟血管使用甲醛緩沖液進(jìn)行固定，并進(jìn)行石蠟包埋，然后使用HE染色，并在光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察其病理變化。

1.9 心肌細(xì)胞凋亡檢測

將1.7中制備的石蠟切片脫蠟后，用乙醇清洗，并使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫（H2O2）溶液在室溫下孵育20 min，按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色，10 min后使用乙醇脫水，二甲苯使其透明，然后封片。在光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野進(jìn)行拍照并觀察細(xì)胞凋亡情況，凋亡細(xì)胞核表現(xiàn)為棕黃色，正常細(xì)胞核表現(xiàn)為藍(lán)色，以凋亡細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比為細(xì)胞凋亡率。

1.10 AT2R、Akt、eNOS蛋白水平檢測

將1.7中剩余的心臟組織勻漿離心，取其上清液，并按照二喹啉甲酸（BCA）試劑盒說明書檢測總蛋白濃度，然后將等量的蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，2 h后加入稀釋過的AT2R、AKT、p－AKT、eNOS、p－eNOS一抗，過夜孵育，再加入二抗稀釋液，繼續(xù)孵育2 h，最后加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑進(jìn)行顯影，并使用Gel－ProAnalyzer 4軟件分析不同條帶的灰度值，進(jìn)而得到蛋白的相對表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心臟組織中miR－483－3p表達(dá)水平比較

與對照組比較，模型組大鼠心臟組織中miR－483－3p表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；與模型組和miR－483－3p mimicsmock組比較，miR－483－3pmimics組大鼠心臟組織中miR－483－3p表達(dá)明顯提高（P＜0.05）；與miR－483－3p mimics組比較，miR－483－3p mimics＋PD123319組大鼠心臟組織中miR－483－3p表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 miR－483－3p mimics對大鼠心血管組織病理變化的影響

對照組大鼠心肌結(jié)構(gòu)和心肌細(xì)胞形態(tài)均正常；與對照組比較，模型組和miR－483－3p mimics mock組大鼠心肌肌束紊亂，炎性細(xì)胞浸潤增多，心肌組織纖維化加重；與模型組比較，miR－483－3p mimics組大鼠炎癥損傷和心肌組織纖維化均得到緩解；與miR－483－3p mimics組相比，miR－483－3p mimics＋PD123319組大鼠心肌組織纖維化程度和炎癥細(xì)胞浸潤加重。詳見圖1。

2.3 miR－483－3p mimics對大鼠甲狀腺功能以及FBG含量、IRI值的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清T3、T4、FT3、FT4、FBG水平及IRI值均明顯上升，TSH水平明顯下降（P＜0.05）；與模型組相比，miR－483－3p mimics組大鼠血清T3、T4、FT3、FT4、FBG水平及IRI值明顯降低，TSH水平明顯升高（P＜0.05），而miR－483－3p mimics mock組上述指標(biāo)無明顯變化（P＞0.05）；與miR－483－3p mimics組比較，miR－483－3p mimics＋PD123319組大鼠血清T3、T4、FT3、FT4、FBG水平及IRI值明顯升高，TSH水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.4 miR－483－3p mimics對大鼠血清炎性因子的影響

模型組大鼠血清中IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6比值明顯高于對照組（P＜0.05）；miR－483－3p mimics組大鼠血清中IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6比值明顯低于模型組和miR－483－3p mimics mock組（P＜0.05）；miR－483－3p mimics＋PD123319組大鼠血清中IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6比值明顯高于miR－483－3p mimics組（P＜0.05）。詳見表3。

2.5 miR－483－3p mimics對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加，miR－483－3p mimics組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較模型組和miR－483－3p mimics mock組降低，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR－483－3p mimics＋PD123319組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較miR－483－3p mimics組明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6 miR－483－3p mimics對各組大鼠心臟組織AT2R/AKT/NO通路的影響

與對照組相比，模型組AT2R蛋白水平及p－AKT/AKT、p－eNOS/eNOS明顯下降，NO含量明顯減少（P＜0.05）；與模型組和miR－483－3p mimics mock組相比，miR－483－3p mimics組AT2R蛋白水平及p－AKT/AKT、p－eNOS/eNOS明顯提升，NO含量明顯升高（P＜0.05）；與miR－483－3p mimics組比較，miR－483－3p mimics＋PD123319組AT2R蛋白水平及p－AKT/AKT、p－eNOS/eNOS降低，NO含量明顯減少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3 討 論

甲狀腺功能亢進(jìn)癥作為內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見疾病之一，其發(fā)病率逐漸增加。甲狀腺功能亢進(jìn)癥的并發(fā)癥包括甲狀腺功能亢進(jìn)癥性心臟病，T4的長期升高會引發(fā)嚴(yán)重的病理損傷，進(jìn)而導(dǎo)致心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生［12］。炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗是甲狀腺功能亢進(jìn)癥病人的主要病癥，而抑制機體的炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗現(xiàn)象是治療甲狀腺功能亢進(jìn)癥的必需途徑［13］。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，T3、T4、FT3、FT4、TSH是評價甲狀腺功能的重要指標(biāo)，血清中T3、T4的含量占總甲狀腺素的絕大部分，只有極少量的FT3、FT4［14］。T3、T4、FT3、FT4含量在甲狀腺功能亢進(jìn)癥病人血清中明顯上升，由于機體甲狀腺激素的增加能夠反過來抑制TSH的分泌，因而TSH含量明顯下降。左甲狀腺素鈉的大量灌服可使機體的甲狀腺功能增加，將其在大鼠上進(jìn)行皮下注射可模擬甲狀腺功能亢進(jìn)癥病人癥狀。本研究通過皮下注射左甲狀腺素鈉制備甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、FBG水平和IRI值明顯升高，TSH水平明顯降低（P＜0.05），說明甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠模型制備成功。

miR－483－3p是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，而miR－483－3p過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂蛋白激酶6（CDK6）表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和遷移［6］。也有研究表明，miR－483－3p可靶向調(diào)控鼠雙微體4（MDM4）表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制心肌缺血再灌注損傷［7］。本研究通過qRT－PCR實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心臟組織中miR－483－3p水平明顯低于對照組（P＜0.05），提示miR－483－3p可能在甲狀腺功能亢進(jìn)癥中起作用。使用miR－483－3p mimics上調(diào)miR－483－3p表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、FBG水平和IRI值明顯下降，TSH水平明顯上升（P＜0.05），提示miR－483－3p可改善甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠的甲狀腺功能。同時HE染色結(jié)果顯示，miR－483－3p mimics可明顯改善模型組大鼠的炎癥損傷和心肌組織纖維化，揭示miR－483－3p對甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠的心血管損傷有一定的保護(hù)作用。據(jù)報道，Th細(xì)胞有Th1、Th2兩種亞型，Th1分泌IL－2、TNF－α，Th2則分泌IL－10、IL－6，二者的拮抗作用可使機體保持正常的免疫反應(yīng)，并且IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6可用來評價免疫反應(yīng)的強弱［15］。已有研究表明，IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6在甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠血清中升高［16］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6比值明顯高于對照組（P＜0.05），而miR－483－3p mimics干預(yù)后IL－2/IL－10、TNF－α/IL－6比值明顯下降，提示miR－483－3p可減輕甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠的炎癥反應(yīng)。此外，TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)miR－483－3p mimics可明顯降低甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率（P＜0.05），表明miR－483－3p可抑制甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解其心血管損傷。然而miR－483－3p減輕甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷的機制還不清楚。

在血管平滑肌細(xì)胞中，AT2R表達(dá)的降低能夠阻止AKT磷酸化水平的升高，進(jìn)而使NO水平下降［17］。eNOS是AKT的靶基因，NO的產(chǎn)生需要eNOS，在缺血/再灌注內(nèi)皮細(xì)胞中，胰島素可增加AKT和eNOS的磷酸化，從而刺激NO產(chǎn)生［18］。因此，推測miR－483－3p可能通過AT2R/AKT/NO通路調(diào)控甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠的心血管損傷。本研究結(jié)果顯示，miR－483－3p mimics能明顯提升大鼠甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心臟組織中AT2R蛋白表達(dá)、p－AKT/AKT、p－eNOS/eNOS值及血清NO含量（P＜0.05）；而AT2R拮抗劑PD123319的干預(yù)使上述指標(biāo)水平均得到抑制，提示在甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠體內(nèi)AT2R/AKT/NO通路處于阻滯狀態(tài)，而miR－483－3p可激活此通路。此外，PD123319的干預(yù)能夠使過表達(dá)miR－483－3p的甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷程度加重，并促進(jìn)其炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，揭示miR－483－3p可通過激活A(yù)T2R/AKT/NO通路抑制心血管損傷，進(jìn)而緩解甲狀腺功能亢進(jìn)癥。

綜上所述，miR－483－3p可減輕甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷，其機制與AT2R/AKT/NO通路的激活有關(guān)，為甲狀腺功能亢進(jìn)癥的臨床治療提供新的思路。但是miR－483－3p對甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷的影響機制較為復(fù)雜，可能還涉及其他信號通路和相關(guān)因子，尚需深入研究。

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（收稿日期：2022－10－09）

（本文編輯王麗）

基金項目 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目（No.2018D01C147）

引用信息 高華，張春.miR－483－3p靶向調(diào)節(jié)AT2R/AKT/NO通路對甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠心血管損傷的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（12）：2158－2163.