超高效液相色譜法測定北沙參中花椒毒素含量

摘" 要：為建立北沙參中花椒毒素含量的測定方法，采用超高效液相色譜，色譜柱為ACQUITY UPLC■ HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm×1.8 μm），流動相為50%甲醇乙腈-0.1%磷酸溶液，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長323 nm，進樣量為1 μL。在該色譜條件下，在2.005～80.217 μg/mL范圍內，北沙參中花椒毒素濃度與峰面積線性關系良好（R=0.999 8）。方法精密度RSD為0.23%、重復性RSD為0.87%、穩定性RSD為0.91%、加樣回收率在97.0%～105.5%（RSD=2.6%）。該方法快速、準確、便捷，可應用于北沙參中花椒毒素含量的測定。

關鍵詞：超高效液相色譜；北沙參；花椒毒素；含量測定；現狀研究

中圖分類號：R282" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2024）24-0074-05

Abstract： To establish a method for the determination of Zanthoxytoxin in Glehniae Radix. Ultra-performance liquid chromatography was used. The column was ACQUITY UPLC■ HSS T3 1.8μm （2.1×100 mm×1.8 μm）， the mobile phase was 50% methanol acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution， the flow rate was 0.3 mL/min， the column temperature was 30 ℃， the detection wavelength was 323 nm， and the injection volume was 1μL. Under the chromatographic conditions， there was a good linear relationship between the concentration of Zanthoxytoxin and peak area in the range of 2.005～80.217 μg/mL（R=0.999 8）. The method precision RSD was 0.23%， the repeatability RSD was 0.87%， the stability RSD was 0.91%， and the sample addition recovery was between 97.0%～105.5%（RSD=2.6%）. The method is rapid， accurate and convenient， and thereby can be applied to determine the content of Zanthoxytoxin in Glehniae Radix.

Keywords： ultra-performance liquid chromatography; Glehniae Radix; Zanthoxytoxin; content determination; current research

北沙參（Glehniae Radix）為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。夏、秋二季采挖，除去須根，洗凈，稍晾，置沸水中燙后，除去外皮，干燥，或洗凈直接干燥[1]。2002年，衛生部發布《可用于保健食品的物品名單》，正式將北沙參歸類為藥食同源物品。作為一種滋補養陰的名貴藥材資源，北沙參在我國藥用、食用歷史悠久，早在漢代《神農本草經》[2]已有對于沙參功效的記載。北沙參中醫療效良多，有止痛、祛風、養肝[3]、養陰清肺和益胃生津的功效[4]，對肺熱燥咳、虛癆久咳、咽干口渴[5]等癥狀有一定療效。在膳食應用方面，民間通常將北沙參用于煲湯、燉煮菜肴、甜湯和涼茶等，是餐桌上深受歡迎的滋補食材。北沙參主要活性成分有香豆素類、有機酸類、木脂素類[6]等。

花椒毒素屬于呋喃香豆素類化合物，常見于蛇床子、北沙參等藥材中，是一種植物毒素?，F代藥理學表明，北沙參中花椒毒素等成分具有抗菌[7-8]、抗炎[9]的作用。與此同時，由于呋喃結構的致癌性[10]，2017年，世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單中，花椒毒素（8-甲氧基補骨脂素）伴紫外線A輻射在一類致癌物清單中[11]。

由此可知，北沙參中花椒毒素含量應在一定限度內才對人體安全，然而，《中華人民共和國藥典》目前對北沙參中花椒毒素的含量檢定并無要求，并未規范北沙參中花椒毒素的含量限度。為保障臨床藥用、日常膳食可安全應用北沙參藥材，建立可準確、高效、便捷地測定北沙參中花椒毒素含量的測試方法迫在眉睫?，F有研究多使用普通高效液相色譜儀，洗脫梯度普遍時間較長，本文采用超高效液相色譜儀，縮短洗脫梯度時長，達到快速高效的檢測效果。應用該檢測方法，本文初步研究了目前市面流通的北沙參中花椒毒素質量的市場現狀。

1" 材料與方法

1.1" 儀器與試劑

Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色譜（沃特世），電子天平（XBR36/XSR204，瑞士梅特勒），超純水機Comfort I（賽多利斯），數控超聲波清洗器（安譜），花椒毒素對照品（批號：112077-202101，中國食品藥品檢定研究院），甲醇（AR，天津大茂），實驗用水為一級水。

樣品：北沙參藥材及飲片購自市場，其中藥材20份，飲片20份，共40份。經鑒定均為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。

1.2" 方法學驗證

1.2.1" 測定法

1）對照品溶液?；ń范舅貙φ掌穬淙芤海喝』ń范舅貙φ掌芳s10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為花椒毒素對照品儲備溶液（1.002 71 mg/mL）。

花椒毒素對照品溶液：精密量取花椒毒素對照品儲備溶液0.20 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為花椒毒素對照品溶液（20.054 μg/mL）。

2）供試品溶液。取本品粗粉（過四號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3）色譜條件。液相色譜柱為ACQUITY UPLC■HSS T3 1.8 μm（2.1×100 mm×1.8 μm）。柱溫為30℃。進樣體積為1μL。流速為0.3 mL/min。檢測波長為323 nm。流動相A為甲醇-乙腈（1∶1）；B為0.1%磷酸溶液。按表1規定進行梯度洗脫。

4）測定法。精密量取供試品溶液與花椒毒素對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算濃度。

1.2.2" 專屬性

分別取空白溶液（75%甲醇）、對照品溶液、供試品溶液，按色譜條件進樣，比較儀器圖譜的出峰情況。結果表明，空白溶液圖譜中沒有出現目標峰；對照品溶液圖譜中有明顯的目標峰，且沒有其他干擾峰；供試品溶液圖譜有明顯目標峰，分離度良好，如圖1所示。

1.2.3" 線性和范圍

精密量取花椒毒素對照品儲備溶液0.02、0.10、0.20、0.30、0.40和0.80 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

精密吸取上述溶液注入超高效液相色譜儀中，測定峰面積。以對照品溶液的濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算線性回歸方程為y=11 606x+4 772.9，R=0.999 8，線性范圍為2.005～80.217 μg/mL。

1.2.4" 檢測限和定量限

取對照品溶液不斷稀釋，直到S/N=3，信噪比S/N=3時的相應質量濃度為檢測限，得到檢測限為0.26 μg/mL。取對照品溶液不斷稀釋，直到S/N=10，信噪比S/N=10時的相應質量濃度為定量限，得到定量限為0.85 μg/mL。

1.2.5" 精密度

取對照品溶液，按色譜條件重復進樣6次，分別計算保留時間和峰面積6次結果的相對標準偏差（RSD），保留時間RSD為0.06%，峰面積RSD為0.23%，精密度良好。

1.2.6" 重復性

取同一批北沙參樣品，制備6份供試品溶液，按色譜條件依次進樣，得出上述6份供試品溶液的實測值，計算其結果的相對標準偏差（RSD），RSD為0.87%，重復性良好。

1.2.7" 加樣回收率

取同一批北沙參樣品粗粉（過四號篩）約2 g，精密稱定9份，置具塞錐形瓶中，每3份為1組，各精密加入花椒毒素對照品儲備溶液0.20、0.40、0.60 mL，按1.2.1的2）的供試品溶液步驟制備供試品溶液共9份。按色譜條件依次進樣，得出上述9份供試品溶液的實測值，計算其加樣回收率及回收率相對標準偏差（RSD）。得到加樣回收率在97.0%～105.5%，平均回收率為101.1%，RSD為2.6%（n=9），加樣回收率良好，準確度較高。

1.2.8" 穩定性

分別制備對照品溶液、供試品溶液于進樣小瓶中，在0、6、12、24、36和48 h分別取樣，按色譜條件進行分析，分別計算對照品溶液、供試品溶液6次峰面積測量值相對標準偏差（RSD），得到RSD為0.91%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

上述方法學驗證結果表明，本文的測定方法準確、簡單、快捷，可以應用于北沙參中花椒毒素的含量測定。

2" 結果與分析

2.1" 樣品測定

隨機從市面上現有售賣的北沙參藥材、飲片中各取樣購得20份作為待測樣品，共40份。經鑒定全部確認為是傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根。經檢測，所有樣品水分均低于13%，符合《中華人民共和國藥典》2020年版對于藥材及飲片檢定通則要求。

按1.2.1對待測樣品中花椒毒素含量進行檢測，結果見表2。

2.2" 結果分析

從表2結果可以得出，從市面購得的40批北沙參中花椒毒素含量在0.000 017 45%～0.012 19%，平均含量為0.005 260%，不同批次間北沙參中花椒毒素含量差異較大。其中20批北沙參藥材中花椒毒素含量在0.001 705%～0.012 19%，平均含量為0.006 511 %；20批北沙參飲片中花椒毒素含量在0.000 017 45%～0.009 807%，平均含量為0.004 010%。北沙參藥材中花椒毒素含量總體比飲片高。

采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進一步比較北沙參藥材與飲片中的花椒毒素含量。結果見表3、表4。

從表3可以看出，方差齊性檢驗的顯著性P=0.561，大于顯著水平0.05，可以認為樣本數據間的方差是齊的，單因素方差分析適用于該批樣本數據。

從表4可以看出，組間顯著性P=0.013lt;0.05，說明藥材與飲片中的花椒毒素含量存在顯著差異性。

3" 討論與結論

從上述結果可分析得出：市面在售整體北沙參中花椒毒素含量差異較大；藥材與飲片比較，藥材中的花椒毒素含量與飲片存在顯著差異性，這顯示炮制工藝可能會對北沙參中花椒毒素含量有較大影響，推測是由于不同廠家炮制工藝間的差異，導致炮制后的北沙參飲片，與原藥材中的花椒毒素含量存在比較明顯的差異；藥材中花椒毒素平均含量高于飲片，推測是炮制工藝會減少北沙參中花椒毒素的含量。已有資料表明，經硫磺熏蒸后北沙參中花椒毒素含量低于未經硫磺熏蒸的[12]，不同干燥法對北沙參中花椒毒素含量有不同程度的影響[13]，據此可以推測北沙參藥材經過炮制，其花椒毒素的含量有所減少，且不同炮制工藝對其影響程度不同，造成飲片與藥材的花椒毒素含量差異較大，且飲片總體含量比藥材低。

追溯源頭可知，正是由于北沙參原藥材種植及飲片炮制加工環節缺乏相關法律法規監管，其質量控制手段長期缺失，導致市面上流通售賣的北沙參藥材及飲片魚龍混雜，質量良莠不齊。

2020年，國家衛生健康委等4部門印發《關于印發新冠肺炎出院患者主要功能障礙康復治療方案的通知》（國衛醫函〔2020〕207號），內附推薦處方中北沙參就是其中一味中藥。這表明，作為傳統的滋補藥材，北沙參潤肺止咳等功效得到了傳統中醫及現代藥理學的認可，應用廣泛，在多種情景下均為人們習慣所用。另一方面，由于花椒毒素天然含有呋喃結構，具有致癌的潛在風險。國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）將呋喃歸為“可能對人類致癌的物質”（2B組）[14]。因此，北沙參的使用安全性必須得到重視，建立快捷高效的測試方法測定北沙參中花椒毒素含量作為其質量控制手段之一，是急需且有意義的。

本文研究結果表明，應用本文的超高效液相色譜法測定北沙參藥材及飲片中花椒毒素含量的測試方法，加樣回收率、精密度、重復性和穩定性均良好，整體方法準確、快速、簡單。采用超高效液相色譜儀搭配超高效液相色譜柱，利用其出峰快速的特性，縮短色譜洗脫梯度，從而減少檢測所需時長，經濟高效，適用于檢驗檢測行業或機構日常檢驗檢測，為北沙參的廣泛應用提供高效便捷而準確的安全保障。同時，本文的樣本結果也對北沙參中花椒毒素含量的限度標準制定提供一定的參考作用，幫助建立北沙參質量控制手段及評價標準，規范中藥產業北沙參藥材從種植到炮制的一系列環節，幫助整頓市面流通的北沙參質量參差不一的市場現狀，促進北沙參藥材在醫藥臨床及日常膳食應用的發展。

本文僅初步研究了北沙參花椒毒素含量的市場現狀，下一步可對藥材與飲片炮制工藝具體步驟開展影響花椒毒素含量的研究。

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基金項目：國家重點研發計劃（2023YFC3504200）；廣州市科技局-廣州市科技計劃項目（SL2022B03J01258）

第一作者簡介：盧敏茹（1994-），女，助理工程師。研究方向為中藥材、食品質量安全分析。

*通信作者：周勁松（1975-），男，博士，高級工程師。研究方向為中藥及制劑分析、中藥炮制。