適宜貴州省安龍縣夏季栽培香菇菌株的篩選

摘" " 要：為了篩選出安龍縣夏季適合栽培的香菇菌株，以安龍縣各香菇種植企業收集的6株香菇菌株為試驗材料，比較6株香菇的菌絲生長速度、拮抗反應、基因序列、子實體單棒產量，并構建系統發育樹。結果表明，AL3菌株的菌絲生長速度較快，平均生長速度為4.51 mm·d-1，顯著高于其他菌株，其次是AL6菌株，平均生長速度為4.37 mm·d-1，AL1和AL6菌株與其他菌株之間拮抗現象明顯，其余菌株拮抗不顯著或無拮抗；ITS序列比對及系統發育分析將6株香菇菌株聚為香菇屬進化的3個大類，2個不同菌株及4個不同亞種；AL4菌株單棒產量最高，為0.58 kg，其次是AL6菌株，單棒產量為0.47 kg。綜合各試驗結果分析得出，6株菌株中，AL4、AL6和AL3菌株較適合在安龍縣夏季栽培，研究結果可為安龍縣夏季適栽香菇種質資源的篩選提供理論依據。

關鍵詞：香菇；夏季栽培；種質資源篩選

中圖分類號：S646.1+2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）12-096-07

收稿日期：2024-04-01；修回日期：2024-10-20

基金項目：貴州省食用菌產業技術體系建設項目（GZMARS-SYJ-2024-2026）；黔西南州科技計劃項目（州科合支撐2024-10）

作者簡介：周" " 靜，女，農藝師，主要從事食用菌菌種選育與栽培技術推廣應用工作。E-mail：1846794394@qq.com

Selection of suitable Lentinula edodel strains for summer cultivation in Anlong， Guizhou province

ZHOU Jing1， ZHUO Qin1， REN Fei2， YANG Hong2， LUO Zhenqing2

（1. Anlong County Agricultural Modernization Development Promotion Center， Anlong 562400， Guizhou， China; 2. Guizhou Qianshan Mushroom Industry Development Responsibility Company， Anlong 562400， Guizhou， China）

Abstract： In order to select suitable Lentinula edodels strains for summer cultivation in Anlong county， six L. edodels strains collected from various L. edodels strains growing enterprises in Anlong county were used as test materials， and the mycelial growth rate， antagonistic response， gene sequence， and single rod yield of the substrate of the six L. edodels strains were compared， and phylogenetic tree was constructed. The results showed that among the six L. edodels strains， the growth rate of the AL3 strain was faster， with an average growth rate of 4.51 mm·d-1， which was significantly higher than that of the other strains， followed by that of the AL6 strain， with an average growth rate of 4.37 mm·d-1; antagonism between the AL1 and AL6 strains and the other strains was obvious， and the rest of the strains had no antagonism that was not significant or antagonistic; ITS sequence alignment and phylogenetic analyses placed the six L. edodels strains into three major evolutionary categories of the Lentinula， the six strains were categorized into two homozygous strains and four different subspecies. AL4 strain had the highest single rod yield of 0.58 kg， followed by AL6 strain with single rod yield of 0.47 kg. The results of the experiments showed that among the six L. edodels strains， AL4， AL6 and AL3 strains were more suitable for summer cultivation in Anlong country， which provided theoretical support for the selection of suitable L. edodels strains germplasm resources for summer cultivation in Anlong county.

Key words： Lentinula edodel; Summer cultivation; Germplasm resource screening

香菇（Lentinula edodel）又名花菇、香蕈，是一種木腐性真菌，在分類上隸屬于真菌界擔子菌門傘菌綱傘菌目香菇屬[1]。我國栽培的食用菌品種繁多，栽培歷史悠久，在眾多人工栽培品種中，香菇產量最高，也是最早走進我國飲食生活的食用菌種類之一[2]，香菇肉質肥厚鮮美，營養豐富，是一種藥食同源的食物，含有多糖、蛋白質、嘌呤、人體必需氨基酸等多種可改善人體營養性貧血、調節免疫系統、降低膽固醇等的營養成分[3]。隨著國家相關精準扶貧政策的實施，香菇生長周期短、平、快的生長特性及較高的經濟效益驅動[4]，我國的香菇產業進入了新層次的發展階段，栽培面積逐步擴增，主要栽培區域有河南、浙江、湖北、河北、福建、吉林、遼寧、陜西等省份。安龍縣位于貴州省西南部，屬亞熱帶季風濕潤氣候區，年平均氣溫15.3 ℃，最冷月平均氣溫6.4 ℃，最熱月平均氣溫21.9 ℃；年平均降水量1 195.4 mm；年平均無霜期308 d；年日照時數1545 h，氣候特征非常適宜食用菌生長[5]。自“十三五”以來，安龍縣憑借優越的自然生態氣候、豐富的水土資源和市場區位優勢，緊跟貴州省將食用菌作為全省重點農業特色優勢產業的政策，將香菇產業作為推動鄉村振興的主導產業[6-7]。然而，走訪安龍縣本地香菇種植企業發現，近年來安龍縣香菇菌種引種混亂，導致同種異名、同名異種現象頻發，種植戶因不清楚菌株的生理特性，無法充分發揮菌種優勢，影響了適合當地栽培的香菇種質資源的篩選。因此，分類整理各菌株的差異性，避免種源混亂，對推動安龍縣香菇產業的健康可持續發展具有重要意義。

以往的香菇菌種鑒定工作主要依賴傳統的形態學鑒定方法，雖然經典的分類方法在一定程度上能對類群進行很好的劃分，但是由于大部分食用菌形態特征復雜，近緣種子實體特征相似，以及子實體的形態容易受到外界環境的影響而出現不穩定，導致同一菌種生長環境不同而在形態上表現出較大的差異[8]。此外，對于進行人工栽培的食用菌品種來說，通過栽培試驗獲得子實體，然后再根據子實體的特征進行鑒定，這種鑒定方法雖然操作簡單、鑒定結果直觀，但是所花費的時間較長，一般都需要數月，甚至一年的時間。因此，單純依靠經典形態學鑒定方法來對食用菌進行分類和鑒定存在較多困難。隨著生物科學技術的快速發展，傳統鑒定和分子生物學鑒定的結合能夠較好地鑒定食用菌種內種質資源的特異性[9]。筆者以安龍縣各香菇栽培企業出菇基地收集的6株香菇菌株為試驗材料，通過“菌絲生長特征測定+拮抗鑒定+ITS序列分析+出菇品比試驗”多種鑒定方法相結合，初步篩選適合安龍縣夏季栽培的優良種質資源，以期為安龍縣香菇產業發展提供理論參考，進一步加快食用菌產業提質增效，提高企業和菇農的種植效益。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種為安龍縣各香菇栽培企業出菇基地通過組織分離收集的6株香菇菌株，具體信息見表1。

母種培養基為PDA固體培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL，pH自然；菌棒培養基配方為：硬雜木屑79%，麥麩20%，石膏1%，含水量55%～60%，pH 6～7。

rDNA ITS分析所用的ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長速度測定 取直徑為5 mm菌種塊接種到90 mm PDA固體培養基平板中央，置于24 ℃恒溫暗培養，觀察菌落生長情況，并采用十字交叉法測量菌落直徑，每個菌株設置3次重復。計算6菌株菌絲生長速度，觀察記錄比較不同菌株長勢。

1.2.2 拮抗鑒定 在PDA平板固體培養基上，將各參試菌株3組1個組合放置于90 mm培養皿內對峙培養，接種量為5 mm的打孔器打取各菌株種塊，每個組合3次重復，置于24 ℃培養箱內倒置培養，培養10 d后，觀察記錄6株菌株之間菌絲接觸區有無拮抗反應。

1.2.3 DNA提取和ITS分子鑒定 采用改良的CTAB法提取DNA[11-12]。將供試6株菌株在PDA液體培養基中24 ℃生長7 d后，提取DNA，隨后用兩對引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，反應總體系為50 μL，包括5 μL 10×PCR Buffer、4 μL dNTP、1 μL10 μmol·L-1上游引物、1 μL10 μmol·L-1下游引物、1 μL Taq DNA聚合酶、2 μL DNA模板，用水補至50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性40 s，52 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃保溫5 min，4 ℃保存，擴增完成以后，將PCR產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并送上海生工生物工程有限公司進行測序。測序獲得的rDNA ITS序列經DNAMAN軟件多序列比對重排后，提交到NCBI數據庫獲得Genebank登錄號，并進行BLAST比對，得到與其最相似的物種名、登記號及序列相似性，同時應用MEGA 7.0軟件以平菇（Pleurotus ostreatus）為外群，對6個樣品的ITS序列進行系統發育構建分析，采用最大似然法（maximum likelihood method）構建系統發育樹[13]，以Bootstrap法經1000次循環檢驗系統樹的可靠性，使用最大復合似然法計算進化距離[14]。

1.2.4 大棚出菇品比試驗 品比出菇試驗于2023年1—7月在貴州省黔西南州安龍縣春潭街道安龍縣研發中心出菇試驗基地進行。2023年1月接種，2023年4月上棒，2023年7月采完第三茬菇后結束試驗。選用15 cm×55 cm×0.004 cm的聚乙烯袋，按照常規菌棒制作和出菇管理等方法[15]，開展菌袋制作、接種、菌棒培養、轉色管理、出菇期管理及香菇采收等各環節的管理工作。出菇品比試驗共有6株供試菌株，分別設置為兩個短菌齡試驗組和長菌齡試驗組，其中短菌齡試驗組包括AL1、AL4和AL6，長菌齡試驗組包括AL2、AL3和AL5，互為對照組。采用隨機區組的試驗設計方法，每個菌株接種3000袋，將培養好的每個菌株擺放于3個空置的出菇大棚進行出菇觀察記錄，每個大棚1000棒，共用18個出菇大棚，總試驗數量為18 000袋，待6個菌株第三茬菇采收結束以后結束試驗，利用電子臺秤稱質量，記錄收集的每一茬香菇鮮質量總數，根據每一個品種的試驗總數量進行單棒產量的統計分析。

1.3 數據處理

采用SPSS 16.0軟件進行試驗數據分析，應用鄧肯氏新復極差法（Duncan）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌絲體生長測定結果分析

菌絲生長快慢是菌株細胞分裂快慢的表現，從側面反映了菌株間遺傳的差異性。由表2和圖1可知，6株菌株的菌絲在平皿中的生長速度和滿皿時間都不一樣，其中AL3菌株生長速度較快，平均生長速度為4.51 mm·d-1，其次是AL6菌株，平均生長速度為4.37 mm·d-1，二者無顯著差異，但AL3菌株顯著大于其他菌株，生長速度最慢的是AL5菌株，平均生長速度為3.61 mm·d-1，而AL4、AL2、AL1、AL5的生長速度無顯著差異。從長滿平皿的時間來看，也是AL3、AL6菌株最先長至培養皿邊緣。菌絲長滿平皿后，依據菌絲生長的濃密程度，將對照菌株的菌絲密度用“+++”表示，“+”號越多，表明菌絲生長越濃密。對6株香菇比較發現，AL3菌株的菌絲生長速度最快，菌絲潔白粗壯、稀疏，菌落均勻；AL5菌株的菌絲生長速度最慢，菌絲潔白致密，菌落不均勻。

2.2 拮抗鑒定結果分析

由圖2和表3可知，6個香菇菌株共設計拮抗組合15組，拮抗現象明顯的有9組，占60.00%；拮抗現象不明顯的有2組，占13.33%；無拮抗的有4組，占26.67%。其中AL2、AL3、AL4之間無拮抗，與其他各菌株之間拮抗明顯，表明3株菌株親緣關系較近，初步鑒定為同一菌株；AL1、AL6與其余各菌株之間拮抗明顯，表明AL1和AL6與其余各菌株親緣關系較遠，可獨立為兩株菌株；AL5菌株與AL2和AL3無拮抗或拮抗不明顯，但同AL4產生明顯拮抗反應，表明僅靠拮抗試驗結果無法直接將AL5菌株進行分類，最后分類結果還應結合分子鑒定結果進行綜合分析。根據拮抗試驗結果可將6個香菇菌株初步分為2個不同菌株及3個不同亞種。

2.3 分子序列測定結果分析

2.3.1 rDNA ITS序列比對分析 將經測序的6株香菇菌株的ITS序列在DNAMAN軟件中進一步進行比對分析，結果表明，AL1、AL2、AL3、AL4、AL5、AL6各菌株之間的序列相似性在98.24%～99.71%之間，可將6個菌株鑒別為香菇屬。

2.3.2 rDNA ITS在NCBI比對結果分析 6株香菇菌株的rDNA ITS區段PCR擴增產物經電泳檢測，均擴增到了目的條帶且擴增條帶在700～800 bp之間，符合測序要求。將測序正確的核酸序列提交到NCBI數據庫進行BLAST比對，得到與其最相似的物種名、登記號及序列相似性。結果表明，6株菌株核酸序列在NCBI上的序列相似性在99.57%～100.00%（表4），均為香菇（L. edodes），AL1和AL6為不同菌株，AL2、AL3、AL4、AL5可鑒定為同一菌株。

2.3.3 基于rDNA ITS序列系統發育樹分析 經測序獲得的6株供試香菇菌株的ITS序列長度為701～707 bp。使用最大復合似然法計算進化距離，6株香菇的遺傳距離在0.000 0～0.201 9之間。其中AL1遺傳距離最遠為0.201 9，AL6與其他株遺傳距離為0.000 6～0.004 8，其他各菌株的遺傳距離在0.000 0～0.005 2之間，在Genebank中下載平菇P. ostreatus isolate P93（KY962509）ITS序列，長度為687 bp，作為外類群，與6株香菇種質資源的ITS序列構建NJ系統進化樹（圖3），可以發現，6株香菇菌株可以聚為3個大類。其中AL1、AL6各自獨立為一支；AL2、AL3、AL4和AL5聚為一支且組成姐妹群，其中AL2和AL4的自展支持強度為90，親緣關系較近。

2.4 大棚出菇品比試驗結果分析

出菇試驗共持續約7個月，采收完第三茬菇后結束，6株菌株全部出菇，6株香菇菌種出菇情況以單棒產量（kg）進行統計分析。由圖4可知，6株香菇菌株單棒產量之間差異顯著，單棒產量從高到低排序為AL4gt;AL6gt;AL1gt;AL3gt;AL2gt;AL5，其中AL4單棒產量最高，為0.58 kg，超過0.30 kg以上的菌株為AL4、AL6、AL1，單棒產量較低的兩個菌株為AL2和AL5。從菌齡分組上來看，在安龍夏季栽培香菇菌種出菇情況較好的菌株均為短菌齡菌株：AL4、AL6、AL1，單棒產量分別為0.58、0.47、0.33 kg，3株菌株平均單棒產量為0.46 kg，而長菌齡3株菌株AL2、AL3、AL5單棒產量分別為0.14、0.27、0.10 kg，3株菌株平均單棒產量僅為0.17 kg，僅為長菌齡菌株產量的36.96%。

3 討論與結論

在香菇生產中，菌種質量直接影響栽培的成敗和產量的高低，同時關系到產業的可持續健康發展。然而，近年來由菌種質量問題引發的生產事故時有發生，給農民和當地經濟造成重大損失。食用菌菌絲雖具有無限生長的特性，但細胞分裂次數越多，老化程度越高，變異也越嚴重[16]，這是導致香菇產量下降的重要原因之一，因此對香菇建立快速準確的鑒定方法是十分必要的。對食用菌進行分類和鑒定的傳統方法主要是通過觀察菌絲、孢子和子實體的形態學特征，并結合生理生長性狀描述進行分類，傳統分類法的優勢在于形態特征易于觀察和比較，并具有相對的穩定性[17]，在香菇育種選種時，可以將菌絲生長速度作為選擇親本的指標[18]，對安龍縣香菇主產區栽培的6株菌株進行菌絲體生長速度測定試驗以及大棚出菇試驗，結果表明，AL4和AL6的菌絲生長速度快，菌絲潔白粗壯，而菌株AL5的菌絲生長速度最慢，結合菌株夏季出菇試驗結果來看，菌株AL4和AL6出菇產量較高，且相對較耐高溫，菌株AL5出菇產量較低，研究結果與龐媚等[19]對平菇菌株的結果相似。在出菇試驗中，6株供試香菇菌種中出菇情況較好的菌株為菌絲生長速度快、菌絲潔白粗壯的短菌齡菌株，平均單棒產量是長菌齡菌株的2.7倍，表明短菌齡菌株比長菌齡菌株更適合在安龍縣夏季栽培，短菌齡菌株的越夏能力強于長菌齡。

拮抗反應試驗也可用于預測菌株間的親緣關系，在真菌分類學上廣泛應用，可對菌株進行初步的分類[20]。對安龍縣香菇主產區栽培的6株菌株進行拮抗試驗，結果表明，AL1和AL6與其他菌株之間拮抗明顯，可初步認定為獨立菌株；AL2、AL3、AL4之間無拮抗，與其他菌株之間拮抗明顯，可初步認定為同一菌株，雖然菌株間命名不同，但可能為同一菌株。AL5與AL2和AL3無拮抗或拮抗不明顯，但與AL4產生明顯拮抗反應，表明僅靠拮抗試驗結果無法直接分類AL5，還需結合分子鑒定的結果，與謝雪迎等[21]得出的拮抗試驗只能用于菌株的初步分類的結論相似。與分子生物學鑒定結果相比，拮抗試驗只能將有拮抗反應的菌株分為不同菌株，卻不能將沒有拮抗反應的菌株視為相同菌株，甚至很難說沒有拮抗反應的菌株親緣關系近，有的不同種或不同屬之間的菌株也可能沒有拮抗反應，因此，拮抗測定僅僅是菌種鑒定的一種輔助手段[22]。

ITS序列被稱為基因轉錄間隔區，又叫內轉錄間隔區[23]，存在種間變異大、種內保守性高、片段較短的特點，同時容易與單對引物結合，便于測序與擴增，在系統發育分析以及物種鑒定方面，ITS序列一直作為一個有效鑒定真菌種類的分子標記。在香菇的遺傳多樣性研究中，崔筱等[24]利用ITS序列將41個香菇品種聚為獨立進化的4個大類，即3個不同的菌株和8個不同的亞種。宋小亞[25]等利用ITS序列將麗水市某香菇產區3株混亂的菌株鑒別出來，避免了一場由于菌種混亂導致的生產事故。在菌種種質資源鑒定研究中，通過表型與 ITS 測序相結合的方法，將菌株間序列相似性≥99.9%的定義為同一菌株，序列相似性99.0%～99.9%之間的定義為同一亞種，序列相似性為 99.4%～99.9%之間，可認為是同一菌株的不同亞種[26]，供試的rDNA ITS序列通過與NCBI的GenBank數據庫進行BLAST檢索比對，序列相似性為95%～99%，鑒別為相同屬，序列相似性≤95%，鑒別為相同科[27]，結合上述研究成果對本試驗中6供試菌株進行ITS測序分析，結合拮抗試驗結果，表明6個菌株均屬于香菇屬，又將6株香菇屬菌株AL1和AL6分為獨立菌株，AL2、AL3、AL4和AL5為不同亞種，引用平菇（Pleurotus ostreatus）作為外類群，與6株香菇種質資源的ITS序列使用MEGA7.0軟件構建NJ系統進化樹，可以發現，6株香菇菌株可以聚為3個大類，且不同菌種間親緣關系較近。

綜上所述，筆者通過“菌絲生長速度測定+拮抗鑒定+ITS序列分析+出菇品比試驗”多種鑒定方法相結合，確定了安龍縣主栽的6株香菇菌株為3個不同類群；2個不同的菌株及4個不同亞種，該方法可以有效鑒定香菇菌株種類，基本能解決香菇菌種命名混亂的問題。在適栽菌種選擇方面，6株菌株中短菌齡菌株AL4和AL6較長菌齡菌株來說產量更高，耐高溫性更強，更適合夏季栽培。研究結果為進一步探索高效出菇管理技術提供了理論和數據支持，為食用菌產業健康發展提供了保障。

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