基于底質細菌IBI的長江南京段生態健康評價

摘要：針對長江南京段生態健康問題，于2019年平水期和豐水期在長江南京段干流的10個斷面和21條入江支流進行采樣，利用高通量測序的方法研究底質細菌群落的結構組成，構建了底質細菌群落完整性指數（benthic bacteria-index of biological integrity，B-IBI）。結果表明：平水期長江南京段的生態健康要優于豐水期，長江干流斷面要優于支流斷面；TN、NH3-N、NO3^-、TOC與B-IBI呈顯著負相關，Shannon指數、Margalef指數、Evenness指數與B-IBI呈顯著正相關；研究建立的評價體系對于長江水質狀況和生境有較好的指示作用；硬質護坡或河底對于入江支流細菌群落的多樣性有負面影響，建議在確保防汛的基礎上加強河道的生態修復。

關 鍵 詞：河流健康評價； 底質細菌群落完整性指數； 底質細菌； 長江南京段

中圖法分類號： X52

文獻標志碼： A

DOI：10.16232/j.cnki.1001-4179.2024.11.014

0 引 言

長江下游地區為中國經濟最為發達的區域之一，長江下游的水質狀況對于沿江居民的生活質量以及區域的可持續發展具有舉足輕重的影響，直接關系到公共健康、安全飲水供應以及農業生產等多個方面^［1］。江蘇省是長江經濟帶的重要一員，地處下游和末梢，沿江開發程度高，沿江區域承載了全省六成人口、七成投資、八成總量、九成進出口^［2］，是保護長江和發展經濟壓力最大的省份之一。南京市是江蘇省唯一跨江布局的城市，長江南京段干流岸線約占全省23%，在長江大保護中肩負重要職責。長江是南京市主要的飲用水水源地，也是南京市主要的工業廢水受納水體^［1］。對長江下游水質和生態健康進行研究，將有助于制定有效的環境保護政策和管理措施，確保區域的可持續發展和生態安全。

生物完整性指數（index of biotic integrity，IBI）是水生態健康評價的重要指標，通過篩選群落結構、生物多樣性、功能性狀等多類型生物參數來評價水生態健康狀況。相比之前單因素生物評價指標，IBI綜合了多類型的評價指數信息，具有全面性、敏感性和準確性等優點^［3］。IBI方法體系最初由Karr在1981年提出，以魚類為研究對象，建立了以魚類為主的生物完整性指數^［4］，隨后逐漸應用于大型底棲無脊椎動物、浮游生物、高等維管束植物等生物研究中。

底質細菌作為生態系統的重要分解者，在物質循環和能量流動中扮演著關鍵角色，在分解有機物、參與氮循環等方面具有不可替代的作用，對維持水體的生態平衡具有重要意義。此外，底質細菌還具有較快反應生境變化的能力、廣泛的分布范圍、較高的物種多樣性等特征，能夠明顯區分污染點和參照點，適用于IBI評價^［5］，但由于分析手段困難，之前較少被用于相關的研究中。隨著高通量測序技術的進步，針對細菌的研究逐漸增多。例如：黃藝等建立了浮游細菌生物完整性指數評價法，證明了細菌作為水生態健康評價指標的可行性^［6］；Lear等對比了細菌和底棲無脊椎動物兩個指示生物因子在溪流生態健康評價上的作用^［7］；Lau等基于細菌群落指數評價溪流健康，結果表明其與水質、無脊椎動物、生態系統功能參數、土地利用方式均存在很好的相關性^［8］。高通量測序技術能夠提供豐富的底質細菌群落信息，相較于傳統的培養方法，具有更高的靈敏度和準確性^［9-10］，這為構建基于底質細菌的生物完整性指數提供了堅實的數據基礎。基于此，本研究利用高通量測序的方法，研究長江南京段干、支流的底質細菌群落的結構組成；參照標準化的生物完整性指數構建流程，通過選擇參照點、篩選核心參數、計算IBI得分，劃分評價標準等步驟，對長江南京段這一重要水體進行生態健康評價。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

長江南京段自安徽省東部入南京市境內，橫貫南京市的河段長約97 km，下接鎮揚河段，岸線全長近200 km，平均水深超過15 m。北岸長約 93 km，支流有駟馬山河、馬汊河、滁河等。南岸長約 98 km，支流有銅井河、牧龍河、江寧河、板橋河、秦淮新河、秦淮河、七鄉河等（圖1）。長江南京段水量豐富，年徑流量約10 009.7 億m³，最大流量93 600 m³/s，最小流量6 000 m³/s。根據江蘇省水利廳、環境保護廳2003年編制的《江蘇省地表水（環境） 功能區劃》，長江南京段劃分為18個水功能區，包括5個飲用水源區，4個保留區，2個緩沖區，7個漁業、農業、工業用水區。長江南京段左岸包括長江皖蘇緩沖區（左岸）、長江江浦保留區、長江南京浦口飲用水源區、漁業用水區（左岸）等 8個水功能區，右岸包括長江皖蘇緩沖區（右岸）、長江江寧銅井保留區、長江南京漁業、農業用水區（右岸）等 10個水功能區（圖1（a））。

根據長江干流徑流量變化，于2019年4月（平水期）及9月（豐水期）在長江南京段的干流及入江支流進行兩次采樣。依據不同的土地利用方式、支流與干流的交匯處、村落上下游、污水處理廠上下游等對水環境狀況有影響的因素，結合江蘇省地表水國控、省控監測斷面的分布，于長江干流設置10個采樣斷面，30個采樣點（每個斷面取北岸、中泓、南岸3個采樣點），于長江南京段21條入江支流設置21個采樣斷面，21個采樣點，共布設51個采樣點位（圖1（b））。

1.2 樣品采集與處理

利用采泥器采集每個點位的底泥，采集到的底泥樣品使用無菌的50 mL聚丙烯管收集，所有樣品被儲存在干冰盒里，并隨后轉移到-80 ℃冰箱里^［10］。使用FastDNA 試劑提取每個均質化過的沉淀物樣品的DNA后，進行PCR擴增和Illumina HiSeq測序，擴增子在Illumina HiSeq 4000平臺上進行配對測序，16S rDNA的擴增引物為341F和806R^［9］。在檢查質量后，為去除技術性噪音、提高比對精度以及降低錯誤率，從條形碼和引物中修剪掉超過75個堿基對長度（BP）的原始Illumina 配對末端讀數，并使用 Flash 軟件v1.2.7進行組合。使用QIIME v1.9.0對原始序列數據進行分析和質量過濾。使用UCLUST基于97％的相似性分配操作分類單位（OTU），使用PyNAST比對算法與Silva v128參考數據庫比較^［10-11］。

在采樣的同時仔細觀察周圍的環境狀況，現場對各采樣點的棲息地環境質量進行評價。現場觀測的主要生境參數包括：河岸穩定性及植被緩沖帶寬度。原位同步現場測定的指標還包括采樣點的經緯度、pH值、溫度（T）、溶解氧（DO）、濁度（Tur）、電導率（Cond）。

現場采集水樣時使用柱狀采水器在距水面0.5 m處采集1 L水，在接近水底處采集1 L水，帶回實驗室進行混合。距水面0.5 m采樣的依據是GB 3838—2002《地表水環境質量標準》，在接近水底位置采樣是為了采集底質細菌生活范圍內的水樣。現場采集的混合水樣帶回實驗室后，對總氮（TN）、總磷（TP）、氨氮（NH3-N）、硝氮（NO^-3）、亞硝氮（NO^-2）、總有機碳（TOC）等5項理化指標進行檢測。

1.3 B-IBI評價體系構建

1.3.1 候選參數的確定

參考其他河流評價體系對參數的選定^［12］，結合本次調查中長江的底質細菌群落特征，本研究從5個方面構建底質細菌候選因子指標庫：多樣性指標、菌落組成豐度、污染耐受性參數、關鍵種參數及功能性參數，共234項指標。

其中多樣性指標共6項，包括物種數、Simpson指數、Shannon指數、Evenness均勻度指數、Margalef指數、Chao1指數等（M1～M6）。菌落組成豐度指標共174項，基于底質細菌群落結構的分析結果，在門、綱、目、科、屬分類層級上篩選出有較高豐度的優勢物種（M7～M180）^［5］。污染耐受性參數指標共4項，分析細菌群落對環境因子的響應情況（冗余分析），并選取影響顯著（p＜0.05）的環境因子作為主要的環境影響因子（M181～M184）。關鍵種參數共37項，基于細菌共存網絡分析構建體系，篩選系統中與其他菌落間具有較高關聯度的類群（M185～M221）^［6］。功能性參數共13項，包括需氧量、能量來源以及其他指標（M222～M234）^［7］。

1.3.2 候選參數的篩選

候選指標確定后，參照相關文獻，篩選采取以下步驟^［13］：

（1） 分布范圍篩選。分布范圍主要是指候選參數指標庫中的各個參數在不同樣點的分布情況。本研究中，如果某個候選參數在超過95%的樣點中為0，那么就刪除該參數。

（2） 判別能力篩選。利用SPSS 20.0對參數進行Mann-Whitney U檢驗（p＜0.01），并結合箱體圖法來檢驗參數的敏感性，刪除箱體重疊較多的候選參數指標，保留箱體重疊較少的候選指標。對于保留的候選指標參數再進行冗余性分析。

（3） 冗余性分析篩選。利用SPSS 20.0對符合正態分布的各個候選指標參數進行Pearson相關性分析，不符合正態分布的各個候選指標參數進行Spearman相關性分析。若兩參數間r＞0.50，則篩除其中之一，另一參數予以保留。所有通過以上檢驗的參數最終會被保留，作為構建底質細菌完整性指數的核心參數。

1.3.3 參照點的選擇

理想狀態的參照點選取依據主要是通過對歷史監測數據進行分析，或在研究區域選擇沒有人為干擾的區域作為參照點^［14］。由于長江下游人類活動頻繁，通常選取受人為及外在條件影響相對最小的點位作為參照點位。結合現場實地考察及水質、水生態歷史數據，以水質較好的長江干流斷面中的采樣點作為參照點，其余的點位作為受損點（圖1（c））。

1.3.4 B-IBI計算及評價標準

采用比值法統一核心參數的量綱，對于隨干擾強度升高而降低的參數，使用其 95%分位數為最佳期望值，該類參數的分值為參數實際值除以最佳期望值，如公式（1）所示；對于隨干擾強度升高而升高的參數，使用其5%分位數為最佳期望值，該類參數的分值為最大值減去實際值除以最大值減去最佳期望值，如公式（2）所示^［15］。

Vi′=ViV95%×10

（1）

Vi′=Vmax-ViVmax-V5%×10

（2）

式中：Vi′為參數分值，Vi為參數實際值，V_95%為參數的95%分位數，V_5%為參數的5%分位數，V_max為參數最大值。

將各參數的計算分值求算術平均值得到B-IBI監測值（賦分為0～10），使用參照點得分的25%分位數作為最佳期望值。以參照點B-IBI得分的25%分位數定義為健康標準，對該點的值到零點進行等分，按照順序從高到低分別代表一般、較差和極差。

1.3.5 數據處理

使用SPSS 20.0完成 Wilcoxon 秩和檢驗及相關性分析，使用PAST3分析細菌群落結構特征，并使用 Origin 2018 軟件繪制圖表。

本研究樣品采集及B-IBI評價體系的構建詳見DOI：10.5281/zenodo.13778112。

2 結果分析

2.1 長江南京段底質細菌群落特征

不同水期采樣后進行16S rDNA檢測，共得到61 696條序列，歸屬于64個門。全部底質樣品中僅有0.2%尚未能確定分類地位的細菌類群，說明本研究高通量測序的結果分析相當充分^［16］。本研究綱分類水平的群落組成圖詳見DOI：10.5281/zenodo.13778112。

（1） 平水期。平水期長江干流的30個底質樣品中的序列主要分布有10個優勢門，包括變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、硝化螺菌門、放線菌門、擬桿菌門、晚食菌門、厚壁菌門、寶石單胞菌門和疣微菌門（圖2（a））。其中，變形菌門樣品平均豐度最高，占到47.84%，β-變形菌綱的平均豐度最高，達到16.37%。入江支流的21個底質樣品中的序列主要分布有10個優勢門，包括變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、硝化螺菌門、放線菌門、擬桿菌門、螺旋體菌門、厚壁菌門、氨基菌門和疣微菌門（圖2（b））。其中，變形菌門樣品平均豐度最高，占到51.56%，β-變形菌綱的平均豐度最高，達到19.08%。

（2） 豐水期。豐水期長江南京段干流的30個底質樣品中的序列主要分布有10個優勢門，包括變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、硝化螺菌門、放線菌門、擬桿菌門、晚食菌門、厚壁菌門、寶石單胞菌門和疣微菌門（圖3（a））。其中，變形菌門樣品平均豐度最高，占到44.96%，δ-變形菌綱的相對豐度最高，達到16.11%。入江支流的21個底質樣品中的序列主要分布有10個優勢門，包括變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、硝化螺菌門、放線菌門、擬桿菌門、螺旋體菌門、厚壁菌門、寶石單胞菌門、疣微菌門（圖3（b））。其中，變形菌門樣品平均豐度最高，占到51.98%，δ-變形菌綱的相對豐度最高，達到17.10%。

2.2 評價體系構建

（1） 分布范圍分析。在多樣性指標、菌落組成豐度、污染耐受性參數、功能性參數及關鍵種參數共234項指標組成的候選指標庫中，本研究篩除了在大部分采樣點位都不存在且沒有顯著的變化趨勢的候選指標，以確保在各點位的底質細菌豐度值都不為零。經過分析判斷，本研究的候選指標庫中有121個被去除。

（2） 判別能力分析。基于Mann-Whitney U檢驗（p＜0.01）對剩余的125個候選指標進行檢驗。64個指標在參照點和受損點間無明顯差別，61個指標在參照點和受損點間有明顯差別而被保留下來。

（3） 相關性分析。為了確保候選指標的相對獨立性，進行相關性分析，去除相關性系數r＞0.50的候選指標。最后，進行箱線圖分析，篩除參照點和受損點所對應的箱體的重疊率超過60%的候選指標，保留對應箱體無明顯重疊部分的候選指標。

最終，在候選指標庫中篩選出了5個核心指標，分別是M16（匿桿菌門豐度）、M57（地桿菌科豐度）、M184（耐NH3-N菌豐度）、M211（連接度為15的多營養級底質細菌豐度）和M229（嗜甲烷菌豐度），進行底質細菌完整性指數的構建。

2.3 B-IBI評價

2.3.1 評價結果

基于上述劃分的評價標準，運用B-IBI來評價長江南京段干流、支流的生態健康狀況。結果表明，B-IBI范圍在1.42～6.67之間，平均值為3.62，屬于較差狀態。其中，B-IBI分值平水期最高的點位是長江南京段干流上的秦淮新河斷面（6.07），豐水期最高的點位是長江干流上的板橋河斷面（6.67）；平水期分值最低的點位是入江支流上的北十里長溝東支（1.47），豐水期分值最低的點位是入江支流上的板橋河（1.42）。從空間分布來看，“健康”等級的點位大多位于長江干流（圖4）。由Mann-Whitney U檢驗可知，干流底質細菌完整性指數顯著高于入江河流（p＜0.01）。從時間分布上看，平水期“健康”等級的點位比豐水期多2個，“極差”等級的點位比豐水期少2個。豐水期的長江南京段入江河流底質細菌完整性要劣于平水期的底質細菌完整性。

2.3.2 B-IBI和環境因子的相關性分析

對各點位的B-IBI值與水質指標進行相關性分析表明，TN、NH3-N、NO^-3、TOC與B-IBI呈顯著負相關（表1），這表明本研究建立的評價體系對于水質狀況有較好的指示作用。基于16S rDNA對兩次采樣中各個點位的底質細菌進行了分析，并使用Shannon指數表征樣品中的生物多樣性^［17］，使用Margalef指數表征群落物種的豐富度^［18］，使用Evenness指數表征樣品中各個物種個體數目的均勻程度^［19］。對各點位的B-IBI值與細菌群落多樣性進行相關性分析表明，其與細菌的生物多樣性、物種豐富度和個體均勻程度呈顯著正相關（表1），這表明本研究建立的評價體系對于長江生境有較好的指示作用。

本研究對河流底質的細菌群落做了非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS分析，stress＜0.1）^［20］。結果表明，平水期各個樣點的分布較為分散；豐水期各個樣點分布相較平水期更加集中（圖5）。

3 討 論

3.1 B-IBI的時空變化

從不同時期長江南京段干流的B-IBI來看，平水期長江南京段干流的生態健康要優于豐水期。本研究在干流設置的10個采樣斷面，平水期平均分值為“健康”等級，而豐水期平均分值下降為“一般”等級。從各斷面3個采樣點（南岸、北岸、中泓）的B-IBI變化來看，平水期全部采樣點均為“一般”（占比45%）和“健康”（占比55%）等級，而豐水期有20%的采樣點變為“較差”等級，“一般”（35%）和“健康”（45%）等級的占比也相應下降（圖4）。

從不同位置的長江南京段B-IBI來看，干流斷面要優于支流斷面，并且支流的生態健康越差，對應的干流斷面生態健康也較差。平水期入江支流無“健康”等級，“一般”等級僅占10%，其余均為較差或極差。豐水期與平水期特征相似，“一般”等級僅占14%，其余均為“較差”或“極差”等級（圖4）。

3.2 基于細菌群落特征的B-IBI變化分析

本研究選擇的5個關鍵指標（M16，M57，M184，M211，M229）涵蓋了不同的功能性底質細菌群落，這些群落在生態系統中扮演著不同的角色。匿桿菌門豐度：這一群體在有機物降解和營養循環中起著重要作用，能反映底質有機物負荷的變化^［21］。地桿菌科豐度：這一群體與氮循環密切相關，能夠指示氮素污染的情況^［22］。耐NH3-N菌豐度：這一群體在高氨環境中具有生存優勢，可以反映氨氮污染^［23］。連接度為15的多營養級底質細菌豐度：這一群體在食物網中扮演著重要角色，能指示生態系統的復雜性和穩定性^［24］。嗜甲烷菌豐度：這一群體在甲烷代謝中起關鍵作用，能夠反映有機污染和溫室氣體的釋放情況^［25］。

對細菌群落特征進行進一步分析表明，相比于干流，支流的硝化螺菌門和放線菌門占比明顯減少（圖2）。硝化螺菌門是一類以硝化過程為主要功能的細菌，它們能夠將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，這一過程在氮循環中起著關鍵作用。硝化細菌的存在和活性依賴于多種環境因素，包括氧氣、pH、溫度和氨氮濃度等。硝化螺菌門需要富氧的環境，最適宜的pH范圍通常在6.5～8.5之間，最適宜的溫度范圍通常在25～30 ℃。硝化螺菌門的存在依賴于水體中的氨氮濃度。高濃度的氨氮可以促進硝化螺菌的生長和活性，但過高的氨氮濃度可能導致氨中毒，抑制細菌的正常功能^［26］。放線菌門是一類需氧的細菌，具有分解復雜有機物的能力。這類細菌在生態系統中的作用主要包括有機物的降解、抗生素的生產和土壤結構的改善^［27］。其對于氧氣、pH、溫度的需求與硝化螺菌門相近。根據干、支流細菌群落特征的變化，可以說明支流的水環境相比干流可能較為缺氧且污染更嚴重。這可能也與長三角城市污水排放以匯入入江支流的形式進入長江干流有關。

城市污水中含有大量的有機物、營養鹽（如氮、磷）和各種有毒有害物質，如重金屬和有機污染物。這些污染物進入水體后，會顯著改變水體的理化性質，影響水生生物的生長和分布^［28］。在受污染的支流中，高濃度的有機污染物會消耗大量的溶解氧，導致水體缺氧甚至形成無氧環境，從而抑制需氧細菌（如放線菌）的活動^［29］。此外，長三角地區農業活動頻繁，農業徑流中含有大量的肥料和農藥，這些化學物質通過地表徑流進入河流，進一步加劇了水體的污染^［30］。肥料中的氮和磷是引發水體富營養化的主要因素，而農藥則可能對水生生物造成直接的毒害作用^［30］。在農業徑流的影響下，支流中的氮磷濃度顯著升高，溶解氧下降，導致缺氧現象加劇^［31］。

從管理的角度，為了應對這些環境挑戰，有必要加強城市和工業廢水的處理，減少污染物的直接排放。其次，也需要改進農業管理，減少化肥和農藥的使用，控制農業徑流的污染。也可通過建設生態緩沖帶，如植被過濾帶和濕地，截留和降解進入河流的污染物，保護水體生態環境。

3.3 基于河道特征的B-IBI變化分析

長江下游城市化程度高，出于防汛考慮，大量入江支流為硬質護坡及硬質河底，難以與兩岸地下水聯通。南京市有76%的入江支流為硬質護坡或硬質河底，從平水期到豐水期的B-IBI變化來看，硬質護坡或河底的入江支流生態健康在惡化（圖4）。硬質護坡盡管可以防止河岸侵蝕、滑坡和河道變形，保護人類活動區域免受洪水和水土流失的威脅，但是由于改變了自然河岸和河床的形態，對河流生態系統有直接的影響^［32］。由于河岸植被帶的寬度和連續性的降低，以及河床硬化減少了水流的多樣性和復雜性，對水生植物和底棲動物的棲息地有不利的影響，這會降低河道生態系統的自凈能力^［33］。對歐洲的多瑙河^［34］和美國的密西西比河^［35］河道硬化工程的長期生態影響研究表明，這些工程會造成魚類和底棲動物的多樣性下降，并且增加河流水質問題產生的概率。

根據本研究對河流底質細菌群落的NMDS分析，河流底質細菌群落易受上游來水影響^［36］，造成不同水期的B-IBI差異。豐水期由于大量雨水匯入河流，使得河流底質細菌趨于相近，因此，不同水期入江河流B-IBI評價結果有較大差異。

綜上，根據本研究對長江南京段生態健康的分析，平水期長江干流的生態仍處于健康狀態，但豐水期會惡化，這主要是因為入江支流水質較差和河道硬化造成的生物多樣性下降。因此，對入江支流的污染治理和河道的生態修復依舊是長三角城市環境保護領域的重點。

4 結 論

（1） 平水期長江南京段干流的生態健康要優于豐水期。長江干流斷面要優于支流斷面，并且支流的生態健康越差，對應的干流斷面生態健康也較差。

（2） TN、NH3-N、NO^-3、TOC與B-IBI呈顯著負相關，Shannon指數、Margalef指數、Evenness指數與B-IBI呈顯著正相關，這表明本研究建立的評價體系對于長江水質狀況和生境有較好的指示作用。

（3） 硬質護坡或河底對于入江支流細菌群落的多樣性有負面的影響，建議在確保防汛的基礎上加強河道的生態修復。

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（編輯：黃文晉）

Ecological health assessment on Nanjing Section of Changjiang River based on benthic bacteria-index of biological integrity

CHEN Xinqi¹，XUE Zongpu^1，2，HOU Hao²，BAI Song¹，CHEN Ming¹，LIU Jun¹

（1.Jiangsu Nanjing Environmental Monitoring Center，Nanjing 210098，China； 2.Institute of Water Science and Technology，Hohai University，Nanjing 210098，China）

Abstract：

To address ecological health on Nanjing Section of the Changjiang River，we sampled at 10 mainstream sections and 21 tributaries in Nanjing Section in the dry and wet seasons of 2019.High-throughput sequencing was used to analyze the structural composition of benthic bacterial communities，by which the benthic bacteria-index of biological integrity （B-IBI） was established.The results showed that the ecological health on Nanjing Section of Changjiang River was better in the normal water season than that in the wet season，and it was superior in the mainstream than in the tributaries.Total nitrogen，ammonium，nitrate，and total organic carbon were negatively correlated with the B-IBI，while the Shannon，Margalef，and Evenness indices were positively correlated.The established evaluation system effectively indicated the water quality and habitat conditions of the Changjiang River.Hard revetments or riverbeds negatively affected bacterial community diversity in tributaries.It is suggested to strengthen the ecological restoration of rivers on the basis of ensuring flood prevention.

Key words：

river health assessment； benthic bacteria-index of biological integrity； benthic bacteria； Nanjing Section of the Changjiang River