荔枝LcWRKY47基因的克隆、亞細胞定位、表達及延緩果實褐變的功能初探

關鍵詞：荔枝；WRKY 轉錄因子；基因克隆；亞細胞定位；表達分析

中圖分類號：S667.1 文獻標志碼：A

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是無患子科荔枝屬的亞熱帶常綠果樹，是非呼吸躍變型水果，原產于中國南方[1]，主要產區為廣東、廣西、福建、海南等地區，果肉多汁，口感極佳，營養豐富，深受大眾喜愛，經濟價值高，有“嶺南佳果”的美稱[2]，是我國亞熱帶地區重要的果樹品種之一，也是我國特色經濟果樹[3]。但由于荔枝在夏季高溫高濕的特殊時期成熟，果實含水量高，新陳代謝旺盛，采收后營養物質會被迅速消耗[4]，生理變化劇烈，同時果皮上的病原菌迅速生長，容易引起荔枝褐變和變質，導致荔枝商品經濟價值下降[5]，荔枝自身的衰老褐變嚴重影響到荔枝的采后貯藏品質。草酸（oxalic acid， OA）是一種普遍存在的有機酸，在各種代謝過程中起著重要作用[6]。據報道，OA 可以通過提高果實抗病能力和抗氧化活性，延緩呼吸速率和果實成熟衰老，有效地保持園藝產品的品質[7]。

WRKY 轉錄因子家族是植物中最大的轉錄因子家族之一[8]。第1 個WRKY 基因SPE1 于1994年從甘薯中分離得到[9]，隨著其他植物的基因組測序，越來越多的WRKY 基因在不同植物物種中得到鑒定和克隆，已在擬南芥、番茄、小麥、大豆、水稻和玉米等許多物種中得到鑒定[10]。轉錄因子通常包含4 個功能區，即轉錄調控域（激活區和抑制區）、DNA 結合域、寡聚化位點和核定位信號，使轉錄因子在不同情況發揮不同功能[11]。之所以將其命名為WRKY 轉錄因子，是因為WRKY蛋白質序列包含60 個氨基酸殘基組成的DNA 結合域，并且該結構域的N 端具有WRKYGOK 序列組成的WRKY 高度保守結構域[12]。然而，在少數WRKY 蛋白中，WRKYGQK 的氨基酸序列存在不同的突變類型，有WRKYGEK、WRKYGMK、WRKYGKK、WSKYEQK 或WIKYGEN 等。一般而言N 端至少存在1 個WRKY 保守結構域，C 端則包含1 個鋅指結構基序C₂H₂（C-X_4-5-C-X_22-23-H-X-H） 或C₂HC（C-X₇-C-X₂₃-H-X-C）[13] 。根據WRKY 結構域的數量和鋅指基序的類型，WRKY轉錄因子可分為3個主要亞家族，Ⅰ類亞家族有2個含有C2H2 型鋅指基序的WRKY 結構域，Ⅱ類亞家族有1 個含有C₂H₂ 型鋅指基序的WRKY結構域，Ⅲ類亞家族具有1 個含有C₂H₂ 型鋅指基序的WRKY 結構域[14]。

大量研究證明，WRKY 轉錄因子在植物的生長發育中起著重要作用，參與調節植物多種生理過程，擬南芥AtWRKY23 調控根毛發育[15]，小麥TaWRKY71 調控種子萌發等過程[16] ， 玉米ZmWRKY11 調控種皮發育[17]，棉花GhWRKY15調控莖生長[18]、參與碳水化合物合成、次生代謝產物合成，擬南芥AtWRKY75 通過影響水楊酸（salicylic acid， SA）積累和H₂O₂ 清除參與調控葉片衰老過程[19]，蕓苔型油菜BnWRKY47 能夠促進氮從老葉到幼葉或種子的再動員，使幼葉優先生長，抑制整株植株的衰老死亡[20]。

迄今為止，越來越多WRKY 轉錄因子在植物生長發育以及生物與非生物脅迫中的功能得到研究。但目前關于荔枝的WRKY 轉錄因子的研究較少，對荔枝LcWRKY47 基因的研究未見報道。因此，本研究以采后妃子笑荔枝為試驗材料，克隆LcWRKY47 基因，進行生物信息學分析和亞細胞定位分析， 同時通過RT-qPCR （quantitativereal-time， PCR）分析LcWRKY47 基因在果皮和果肉中的表達水平，進一步利用過表達體系分析LcWRKY47 轉錄因子調控采后荔枝成熟衰老的功能，為深入分析WRKY 轉錄因子在采后荔枝果實中的生物學功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選用妃子笑荔枝鮮果為試驗材料，挑選無病蟲害、無機械損傷、形狀、大小、外觀顏色一致的荔枝果實。以2 mmol/L OA 溶液浸泡10 min 的荔枝果實為處理組，以清水浸泡10 min 為對照組，處理后隨機選取30 個荔枝為1 組，每組3 個重復，分別裝入保鮮袋中，貯藏在8 ℃、相對濕度為85%～90%的培養箱中，每2 d 取1 次樣，用液氮將所取樣品速凍后保存在?80 ℃超低溫冰箱中，用于后續試驗。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取與LcWRKY47 基因全長克隆以荔枝果皮為材料，使用改良的CTAB 法從果皮、果肉中提取RNA[21]，隨后分別逆轉錄成cDNA。使用NOVA 逆轉錄試劑盒（All-in-One First-StrandSynthesis MasterMix with dsDNase）進行cDNA 的合成。利用Primer 6 軟件設計LcWRKY47 的全長擴增特異性引物，序列分別為LcWRKY47-F：5’-ATGTCAAGTTCTAAAATGTC-3’，LcWRKY47-R：5’-CTAGTTGGTAGAGAAAGTGG-3’。用2×Phanta?Max Master Mix （Dye plus）高保真酶進行PCR 擴增，PCR 反應程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；最后72 ℃反應5 min，得到LcWRKY47 的開放閱讀框（open reading frame， ORF）序列，PCR 產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后用Omega 膠回收試劑盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）回收目的基因條帶。純化產物連接pCE2 TA/Blunt-Zero 載體（Vazyme TA/Blunt-Zero Cloning" Kit），然后將連接產物轉化至大腸桿菌感受態（維地生物，E. coliDH5α），挑取陽性菌落于LB 培養基中培養，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 LcWRKY47 蛋白的生物信息學分析 利用ExPASy-ProtParam （ https：//web.expasy. org/protparam）分析蛋白的分子量、等電點、不穩定系數等理化性質，利用ExPASy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale）分析蛋白的親疏水性，利用TMHMM（ https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）和SignalP（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0）分析蛋白質的跨膜結構及信號肽預測。利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）分析LcWRKY47 蛋白的二級結構，并使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）分析預測LcWRKY47 蛋白的三維結構；利用在線網站Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo）進行多序列比對；利用在線網站MEME 5.5.0（https：//memesuite.org/meme）分析motif 結構，將motif 數設置為8；使用MEGA 5 軟件構建系統進化樹，并使用鄰接法構建。

1.2.3 亞細胞定位 利用Novopro Bioscience（https：//www.novoprolabs.com/tools/nls-signal-prediction）預測蛋白的核定位序列（nuclear localizationsequence， NLS）。使用洋蔥內表皮作為侵染材料，通過洋蔥內表皮轉化法進行亞細胞定位分析[22]。設計雙酶切正向引物F：TCTAGAATGTCAAGTTCTAAAATGTCAGCCC，反向引物R：GGTACCGTTGGTAGAGAAAGTGGTGCAAGA。通過雙酶切法將LcWRKY47 基因構建到pCAMBIA1300-GFP 載體上，生成35S：：LcWRKY47-GFP 融合表達載體，將重組質粒轉化至GV3101 農桿菌，制備OD600 為0.8～1.0 的懸浮液， 再將洋蔥內表皮（1.5 cm×1.5 cm）浸泡在懸浮液中減壓10 min，用濾紙吸去洋蔥內表皮上多余的菌液，再將其轉移到鋪有濾紙的MS 固體培養基上，放置在25 ℃培養箱中避光培養2 d 后，制成玻片，在熒光生物攝像顯微鏡下觀察熒光信號。

1.2.4 LcWRKY47 基因的表達量分析 利用Primer5 軟件設計LcWRKY47 基因定量引物，分別為正向引物F：5-CACGGCAATGGCTAACACAACC-3‘，反向引物R：5‘-AATGGTGCAGAAGCGGAGAGG-3‘； 內參基因引物Actin-F ： 5‘-ACCGTATGAGCAAGGAAATCACTG-3‘，Actin-R： 5‘-TCGTCGTACTCACCCTTTGAAATC-3‘ 。使用試劑盒（TOLOBIO 2×Q3 SYBR qPCR Master Mix）進行RT-qPCR 擴增，采用2^?ΔΔCt 法計算基因的相對表達量，每次測定均有3個重復。

1.2.5 瞬時過表達體系驗證LcWRKY47 的功能設計雙酶切正向引物F ： 5’-GGATCCATGTCAAGTTCTAAAATGTC-3‘， 反向引物R： 5‘-GAATTCCTAGTTGGTAGAGAAAGTGG-3‘"。酶切位點為：上游BamH Ⅰ（GGATCC），下游EcoRⅠ（GAATTC）。通過雙酶切法將擴增的LcWRKY47編碼序列構建到pGreenII 62-SK 載體上，并將SKLcWRKY47和空SK 載體轉化至農桿菌GV3101，其中空載體組作為對照。參考GONG 等[23]的方法，并進行一些修改，在果實莖部附近注射1 mL 侵染液，然后將注射過的荔枝果實在侵染液中減壓浸泡20 min，對荔枝果實進行侵染，隨后將侵染過的荔枝果實置于（25±1）℃、相對濕度為85%～90%條件下進行培養。在注射后的第1 天和第3天進行取樣，通過RT-qPCR 測定對應基因的表達量，每次測定均有3 個重復。

1.3 數據處理

使用Office 2021軟件進行數據統計與計算，使用SPSS 22.0 軟件分析數據差異顯著性（IBMCorp，美國），采用Duncan 法分析比較差異數據顯著性（Plt;0.05），使用GraphPad Prism 8 軟件對LcWRKY47基因相對表達量進行作圖。

2 結果與分析

2.1 LcWRKY47 基因的克隆及其蛋白的理化性質分析

使用LcWRKY47 的全長引物克隆出ORF 長度為1077 bp的擴增片段（圖1A）。LcWRKY47基因編碼358 個氨基酸，對LcWRKY47 蛋白理化性質進行預測，結果顯示LcWRKY47 蛋白分子式為C₁₆₅₁H₂₆₂₂N₄₉₀O₅₂₅S₂₁， 相對分子質量為38 409.21 kDa，總原子數為5309，理論等電點為8.84；氨基酸組成中帶負電殘基數量（Asp+Glu）為26 個，帶正電殘基數量（Arg+Lys）為31 個，蛋白質中脂肪族側鏈氨基酸指數為58.94，總平均親水性值是?0.535，表現為親水性（圖1B），不穩定性指數是54.03，為不穩定蛋白。綜上，該蛋白為堿性不穩定親水蛋白。

2.2 LcWRKY47蛋白結構分析

預測結果顯示LcWRKY47 蛋白中不存在信號肽（圖2A），也并未發現跨膜區域（圖2B），不是跨膜蛋白。LcWRKY47 蛋白的磷酸化可能發生在絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）位點上，主要為絲氨酸位點，說明此蛋白發揮調控功能可能是以絲氨酸位點的磷酸化修飾為主（圖2C）。LcWRKY47 蛋白的二級結構以無規則卷曲為主，占比為65.64%，其余為α-螺旋，占21.79%、延伸鏈占9.50%、β-折疊占3.07%（圖3A）。運用SWISS-MODEL 在線程序對荔枝LcWRKY47 蛋白的三維結構進行建模分析，發現LcWRKY47蛋白質的主要結構為無規則卷曲和α-螺旋（圖3B），其結果與二級結構的預測結果相一致。

2.3 LcWRKY47 蛋白motif 分析及同源序列比對

選取9 個與LcWRKY47 同源性較高的WRKY 轉錄因子進行motif 分析，結果顯示motif結構相似，在所有蛋白中均含有相同的6種motif；與荔枝LcWRKY47 所含motif 數目和種類一致的有2 個物種，分別為甜橙和陸地棉（圖4A）；氨基酸同源序列比對結果顯示其氨基酸序列均包含1 個WRKY 結構域和1 個C2H2 型鋅指基序。上述結果表明LcWRKY47 蛋白屬于第Ⅱ類WRKY轉錄因子（圖4B）。

2.4 LcWRKY47 蛋白的系統進化分析

選取無患子科植物、漆樹科植物、蕓香科植物以及大戟科植物等不同物種WRKY 基因構建進化樹，結果顯示，荔枝LcWRKY47 與同為無患子科的龍眼DlWRKY47 聚在一起，親緣關系最近，其次是杧果、阿月渾子和甜橙，而橡膠樹、木薯、葡萄以及河岸葡萄則與荔枝LcWRKY47 親緣關系較遠（圖5）。

2.5 亞細胞定位結果分析

Novopro Bioscience 工具預測分析LcWRKY47蛋白的核定位序列為PFRKARVSVRA，位于蛋白序列中98～108 位置。在熒光生物攝像顯微鏡下觀察到，35S：：GFP 對照洋蔥內表皮細胞中的細胞核和細胞壁均檢測到綠色熒光信號， 而35S：：LcWRKY47-GFP 融合蛋白的綠色熒光信號僅出現在細胞核中，這表明荔枝LcWRKY47 蛋白在洋蔥內表皮細胞中定位于細胞核，符合轉錄因子所具有的核定位特征（圖6）。

2.6 LcWRKY47基因的表達量分析

外源OA 處理后，LcWRKY47 基因在荔枝果皮和果肉中的表達水平如圖7 所示。在荔枝果皮中LcWRKY47 基因的表達量呈現先上調后下調的趨勢（圖7A），CK 在8 d 達到最大值，然后逐漸下降，而OA 處理組在10 d 達到最大值，之后呈現下降的趨勢，且OA 處理組只有在2 d 時低于CK，8 d 后顯著高于CK；在荔枝果肉中LcWRKY47 基因的表達量呈現先上調后下調的趨勢（圖7B），CK 在6 d 達到最大值，OA 處理組在8 d 達到最大值，之后均呈現下降的趨勢，相較于CK，8 d 后處理組LcWRKY47 基因的表達水平整體高于CK。LcWRKY47 在荔枝果皮與果肉中的表達模式相同，在貯藏后期表達量均上調，且顯著高于CK，表明LcWRKY47 轉錄因子可能在OA 調控果實成熟衰老過程中起正調控作用。

2.7 瞬時過表達驗證LcWRKY47的基因表達量

為了驗證LcWRKY47 能否調控荔枝衰老褐變，將LcWRKY47 基因轉入完整的荔枝果實。從圖8A 中可以看出，在3 d 時，CK 的整果外觀失色與褐變情況比轉基因荔枝嚴重，而此時轉基因荔枝并未出現褐變等明顯衰老現象。從圖8B 中可以看出，在轉基因果實中LcWRKY47 的表達量高于CK。綜上，LcWRKY47 轉錄因子可能通過延緩荔枝的衰老與褐變來維持果實采后品質。

3討論

在植物生長發育的過程中，WRKY 轉錄因子起著不可忽視的作用[24]。WRKY 蛋白能夠作為激活因子或阻遏因子參與細胞質和細胞核過程，包括從細胞器或細胞質到細胞核的信號傳遞事件，調控植物對生物和非生物刺激的反應過程，參與協調發育過程中的內部信號。WRKY 可與靶基因啟動子中的W-box[TGACC（A/T）]結合，激活或抑制下游基因的表達，調控其應激反應[25]。最新的研究發現WRKY 在蔬菜葉片成熟、衰老等代謝過程中的重要作用，FAN 等[26]從中國白菜葉片中克隆出BrWRKY65，發現BrWRKY65 的表達隨著采后葉片葉綠素降解和變黃而上調，并且可以調控與葉綠素降解相關的BrNYC1 、BrSGR1 和BrDIN1 等3 個衰老相關基因，從而影響采后葉片的衰老。有研究報道WRKY 在果實成熟、衰老等多種生理過程中的重要作用，JI 等[27]發現桃果實中PpSDH 和PpCOX15 等能量代謝基因能與PpWRKY46 互作并被PpWRKY46 上調表達，調節桃子的能量代謝，維持桃果實的品質與抗病性，延緩桃果實的成熟衰老。綜上，推測WRKY 在荔枝果實中可能存在類似的生物學功能，但目前在荔枝中的WRKY 轉錄因子研究卻鮮有報道。本研究中的荔枝LcWRKY47 基因屬于WRKYⅡ類亞家族，蛋白具有親水性，蛋白不穩定，不包含信號肽，無跨膜結構；二級結構和三級結構預測中包括α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規則卷曲，以無規則卷曲為主，同時具有WRKY 保守結構域和1 個C2H2 型鋅指基序，系統進化樹分析表明LcWRKY47 與同為無患子科的DlWRKY47 親緣關系最近。

妃子笑荔枝主要產于海南、廣東，皮薄肉厚核小，香味濃郁，多汁爽口，是中早熟優質品種之一，具有很高的經濟價值和研究價值[28]。然而荔枝采后難貯存、易變質、果皮易褐變等情況一直是荔枝保鮮目前存在的現實問題[29]。OA 與植物的抗微生物、生物和非生物抗性有關[30]，是極好的抗氧化劑，可以增強超氧陰離子的清除能力，阻止活性氧的形成[31]，活性氧的產物之一是丙二醛，是植物細胞膜脂質過氧化的產物，造成細胞衰老和死亡[32]。OA 處理可通過延緩呼吸速率和成熟，降低丙二醛濃度，延遲衰老，增強抗病能力，有效保持園藝產品的新鮮度和品質[33]。近年來，OA 處理采后果實的保鮮效果受到廣泛關注，已有研究報道OA 能夠延遲香蕉的成熟，抑制杧果的腐爛，并防止荔枝果實產生褐變[34–35]。OA 作為一種果實保鮮劑，可能通過影響植物轉錄因子的表達來延緩果實的衰老與褐變，從而起到保鮮的效果。因此本研究將采后妃子笑荔枝作為試驗材料，使用OA 進行處理，研究LcWRKY47基因的表達模式。本研究鑒定的LcWRKY47 基因定量結果表明，LcWRKY47 在荔枝果皮和果肉中的表達趨勢一致，在儲藏后期LcWRKY47 基因表達量與CK 相比差異顯著，均顯著高于CK，處于較高表達水平。將LcWRKY47 連接到過表達SK 載體，對荔枝果實進行侵染實驗，使LcWRKY47 基因得到過表達，結果表明從外觀上看，過表達后的荔枝果實比CK 衰老及褐變程度更低，同時LcWRKY47基因的表達量顯著高于CK。綜合以上結果推測，LcWRKY47 轉錄因子可能在荔枝衰老與褐變過程中起著一定的調節作用，延緩了果實的衰老與褐變， 保持采后妃子笑荔枝的貯藏品質。關于LcWRKY47 基因后續的功能驗證還有待更深入的研究。