產β-D-葡萄糖苷酶菌株篩選及其在香草蘭豆莢發酵生香中的應用

關鍵詞：香草蘭；β-D-葡萄糖苷酶；香蘭素；發酵優化

中圖分類號：Q815 文獻標志碼：A

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）又名香莢蘭、香子蘭，屬多年生大型肉質藤本香料植物，是蘭科植物中最有實用價值的優質食用香料，享有天然食品香料之王的美譽，單價僅次于藏紅花[1-3]。新鮮成熟的香草蘭豆莢無特殊香氣，其豆莢經殺青、發汗、干燥、陳化等工藝后可產生香蘭素、香草酸、香草醇等，據報道其芳香成分可達250多種，是各種高端食品飲料及化妝品等優質原料，廣泛應用于調配各級高檔食品、化妝品等，在國際市場上供不應求[4-10]。

香草蘭發酵后的眾多芳香成分中，最受矚目及最能反映豆莢品質的香味物質是香蘭素[11]，其由香草蘭豆莢中的β-D-葡萄糖苷酶轉化香蘭素葡萄糖苷生成[12-14]，因此在發酵過程中香蘭素葡萄糖苷含量逐漸降低，香蘭素含量逐漸提升。香草蘭鮮豆莢中香蘭素葡萄糖苷含量達10%以上，但加工后豆莢中香蘭素含量僅占1%～3%，香蘭素葡萄糖苷并不能完全轉化為香蘭素。浦帆等[15]研究發現添加β-D-葡萄糖苷酶，酶促生香效果明顯，可提高豆莢中香蘭素含量。莫麗梅[16]在香草蘭青豆莢中添加β-D-葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶，處理后香蘭素含量有明顯提升。張彥軍等[17]使用冷凍-聯合纖維素酶、果膠酶、β-D-葡萄糖苷酶方法處理香草蘭鮮豆莢，顯著提高香蘭素轉化率。WALISZEWSKI 等[18] 使用結晶酶PML-MX、Zymafilt L-300 和Novozym 3 種纖維素分解酶產物對香草蘭豆莢進行預脫水和酶促預處理，結果表明酶促預處理使香蘭素含量增加1 倍。以上研究均可證明額外添加酶，尤其是β-D-葡萄糖苷酶對提高香蘭素含量起著重要作用，但酶價格昂貴，而微生物已被證明參與香草蘭發酵過程[19]，且微生物來源獲得高純度β-D-葡萄糖苷酶制劑的制備工藝較為簡單、酶促效果更佳[20]，從香草蘭豆莢中篩選的微生物應用到香草蘭發酵中也更安全可靠。陳永敢[21]使用產β-D-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌輔助豆莢發酵生香，明顯提高了香草蘭豆莢中香蘭素含量。

本研究以產自馬達加斯加香草蘭發酵豆莢（M）和中國熱帶農業科學院香料飲料研究所香草蘭發酵豆莢（S）為原料，使用七葉苷選擇性培養基，篩選產β-D-葡萄糖苷酶的微生物菌株，選擇酶活較高的2 株菌按照不同比例混合，噴灑到香草蘭豆莢表面，使用HPLC 技術和GC-MS 技術測定發酵豆莢的香蘭素、香蘭素葡萄糖苷含量和揮發性物質，旨在利用微生物輔助香草蘭豆莢發酵生香，為提升豆莢品質提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試香草蘭豆莢：產自馬達加斯加的香草蘭商品豆莢（M）和產自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所的香草蘭商品豆莢（S）。

七葉苷麥克林試劑，香蘭素標準品，上海源葉生物科技有限公司；香蘭素葡萄糖苷標準品，阿拉丁試劑公司；C7～C30 烷烴標準樣品，美國Sigma 公司。

初篩培養基：參考高娉娉等[22]的方法，稱取氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂15 g，七葉苷1 g，檸檬酸高鐵氨2.5 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。LB 培養基：氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用（發酵條件優化用液體培養基不加瓊脂）。發酵培養基：參考崔萍等[23]的方法，酵母浸膏1.0%（氮源），葡萄糖2.0%（碳源），蛋白胨2.0%（氮源和碳源），NH₄NO₃ 0.3%（氮源）、KH₂PO₄ 0.4%，自然pH，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

1.2 方法

1.2.1 產β-D-葡萄糖苷酶菌株篩選 分別將M和S 2 種香草蘭豆莢用無菌剪刀剪短至約0.2 cm長的小段，取剪短后的豆莢5 g 置于45 mL 無菌水中，180 r/min 震蕩1 h，靜置30 min 后，將上清液進行梯度稀釋，選取10^–5、10^–6、10^–7 稀釋液，分別吸取0.2 mL 稀釋液，均勻涂布至初篩培養皿上，每梯度設置3 次重復，在28 ℃的培養箱中倒置培養48 h。待長出菌落后，根據菌落形態、顏色，挑選可產生明顯黑色水解圈的單菌落，將單菌落在LB 培養皿上劃線。連續純化5 次后挑取單菌落接種至LB 培養基斜面，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 產β-D-葡萄糖苷酶菌株的分子鑒定 菌株16S rDNA 分子鑒定參考尚方劍等[24]的方法。采用DNA 離心柱型試劑盒提取菌株的DNA，將總DNA 作為模板， 將細菌特異性引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）對DNA的內轉錄間隔區進行PCR 擴增。將純化后的產物送至上海派森諾生物技術有限公司進行測序。

1.2.3 菌株產β-D-葡萄糖苷酶活力測定 酶活測定參考王彩肖等[25]的方法。

1.2.4 樣品的制備 將香草蘭豆莢置于75 ℃水中殺青5 min，用無菌紗布將豆莢表面水分擦凈。將M3、S7 菌株接種至LB 液體培養基中，將含菌液的培養基在28 ℃和180 r/min 的恒溫搖床中震蕩培養48 h。在無菌環境下將菌液以8000 r/min離心10 min，棄上清液，再加入50 mL 無菌水，充分搖勻后再次離心，重復2 次以上操作，調整菌液吸光度約為0.5 后，作噴菌處理，噴菌比例如表1 所示。將菌液均勻噴灑在殺青后的豆莢表面，每組豆莢10 根噴菌液10 mL，將豆莢置于干燥陰涼處分別發酵20d和60d后取樣。測量分析前，將樣品低溫凍干粉碎并過60 目篩。

1.2.5 香蘭素與香蘭素葡萄糖苷含量分析 參考楊峰等[13]的方法，稱取0.05 g 凍干香草蘭豆莢粉末，加入50 mL 無水乙醇，充分攪拌后進行超聲萃取，設置超聲功率100 W，50 ℃條件下萃取10 min；萃取后過濾，重復進行3 次萃取，合并濾液，定容至50 mL 容量瓶，測豆莢中的香蘭素和香蘭素葡萄糖苷含量，取萃取液用0.22 μm 有機濾膜過濾后進行HPLC 分析。分析條件：反相C18 柱（Zorbax，4.6 mm×100 mm，3.5 μm，Agilent）；流速為0.8 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為25 ℃；檢測波長為280 nm；流動相為0.5%醋酸溶液∶乙腈=85∶15 等梯度洗脫。采用香蘭素標準品、香蘭素葡萄糖苷標準品和出峰保留時間定性，外標法確定物質含量。

1.2.6 香草蘭揮發性成分分析 稱取1 g 凍干香草蘭豆莢粉末于20 mL 頂空進樣瓶中，80 ℃振搖SPME 萃取40 min，250 ℃解吸5 min。GC-MS采用DB–WAX（Jamp;W Scientific， Folsom， CA，USA）石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序為：柱溫40 ℃保持3 min，以3 ℃/min速率升溫到90 ℃，以2 ℃/min 速率升溫到120 ℃，以3 ℃/min 速率升溫到240 ℃，保持20 min。樣品進樣不分流，電子沖擊能量為70 eV，離子源和四極桿的溫度分別設定在230 ℃和150 ℃。掃描范圍為40～450 amu。

1.3 數據處理

采用SPSS 26.0 軟件對數據進行方差分析；采用Origin 2019 軟件、MEGA 11.0 軟件和GenBank 中的BLAST 軟件進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 產β-D-葡萄糖苷酶菌株的篩選

從發酵后的香草蘭豆莢中篩選到21 株可在七葉苷篩選培養基上產生黑色水解圈的菌株，各菌株菌落形態特征存在差異（圖1），黑色水解圈大小不同，其中菌株M3、M7、S2、S3、S4、S7黑色水解圈較大。從產自馬達加斯加香草蘭豆莢上篩選到的菌株M3 在LB 培養基培養24 h 后菌落呈圓形，乳白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊。從產自香飲所的香草蘭豆莢上篩選到的菌株S7菌落形態與M3相似。

2.2 產β-D-葡萄糖苷酶菌株的鑒定

經16S rRNA 序列測定后，用BLAST 與GenBank 中16S rDNA 序列進行同源性比較。發現菌株M1、M3、M6、S1、S3、S7 的16S rRNA序列與NCBI 數據庫中的B. paramycoides MCCC1A04098、L. macroides LMG 18474、B. subtilisDSM 10、B. altitudinis 41KF2b、B. rugosus SPB7、B. paramycoides MCCC 1A04098 相似度分別達到99.79%、99.52%、99.52%、99.93%、99.93%、99.86%（表2）。除6 株菌未檢測出外，其余15 株菌NCBI比對分析結果表明均為芽孢桿菌，其中，M1、M3、M6、S1、S3、S7 分別為副蕈狀芽孢桿菌（ Bacillus paramycoides ）、長形氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、高空芽孢桿菌（B. altitudinis）、膠質芽孢桿菌（B. altitudinis）、副蕈狀芽孢桿菌（B.paramycoides）。對菌株M3 及S7 的測序結果建立系統發育樹，結果如圖2 所示，進一步驗證M3 為Lysinibacillus macroides，S7 為B. paramycoides。

2.3 產β-D-葡萄糖苷酶菌株的產酶活性

鑒定出的15株芽孢桿菌產β-D-葡萄糖苷酶能力如圖3 所示， 菌株產酶活性在0.00294～0.01117 U/mL。分離自馬達加斯加香草蘭豆莢上的長形賴氨酸芽孢桿菌M3 酶活性最高，是副蕈狀芽孢桿菌M8 酶活力的3.8 倍。分離自香飲所香草蘭豆莢上的菌株產酶活力在0.00599～0.00736 U/mL，酶活力變化范圍低于分離自馬達加斯加香草蘭豆莢上的產酶菌株，其中菌株副蕈狀芽孢桿菌S7 酶活力高于本組中其他菌株酶活力。

2.4 香蘭素與香蘭素葡萄糖苷含量變化

從圖4可看出，每組處理噴菌60 d 后的香蘭素含量均高于20 d 時的含量。CK 在20、60 d 時的香蘭素含量分別為0.28%和0.92%。只噴M3菌株的處理在20 d 時香蘭素含量為0.49%，60 d高達2.25%，顯著高于其他處理。只噴S7 菌株的處理，在20、60 d 時的香蘭素含量分別為1.39%、1.52%，上升幅度不大。菌株M3、S7 按照1∶1噴菌處理的豆莢20、60 d 時香蘭素含量分別為0.45%、1.29%，60 d 相較于20 d 的香蘭素含量增加了186.7%。M3 與S7 按照2∶1 噴菌處理的豆莢，在20、60 d 時香蘭素含量分別為1.57%、1.66%。M3 與S7 按照1∶2 噴菌處理的豆莢發酵20、60 d 時香蘭素含量分別為1.60%、1.80%。綜上，香蘭素含量最高的是只噴M3 菌株處理的豆莢。在20、60 d 時所有噴菌處理的豆莢香蘭素含量均高于CK，說明產β-D-葡萄糖苷酶的功能微生物可有效促進香蘭素產生，提升發酵豆莢品質。

圖5 為不同處理香草蘭豆莢分別在噴菌20、60 d 后的香蘭素葡萄糖苷含量。從圖5 中可得出，噴菌后的20～60 d 內，豆莢香蘭素葡萄糖苷含量呈下降趨勢。噴無菌水豆莢在20、60 d 時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為1.63%、0.61%，60 d 相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了62.6%。只噴M3 菌株處理的豆莢發酵20、60 d 時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為3.25%、0.93%，60 d 相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了71.4%。只噴S7 菌株處理的豆莢發酵20、60 d 時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為2.83%、0.88%，60 d 相較于20 d的香蘭素葡萄糖苷含量下降了68.9%。M3 與S7按照體積比1∶1 噴灑處理的發酵豆莢20、60 d時的香蘭素葡萄糖苷含量分別為3.00%、0.58%，60 d 的相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了80.7%；M3 與S7 按照體積比2∶1 噴菌處理的豆莢發酵20、60 d 的香蘭素葡萄糖苷含量分別為3.31%、0.66%，60 d 的相較于20 d 的香蘭素葡萄糖苷含量下降了80.0%；M3 與S7 按照體積比1∶2 噴菌處理的豆莢發酵20、60 d 時香蘭素葡萄糖苷含量分別為2.38%、0.79%，60 d 的相較于20 d的香蘭素葡萄糖苷含量下降了66.8%。由此可見，香蘭素葡萄糖苷下降最多的是M3 與S7 按照體積比為1∶1噴菌處理的豆莢，而下降最少的是CK，這說明產β-D-葡萄糖苷酶的微生物菌株可顯著促進香蘭素葡萄糖苷水解。

2.5 香草蘭揮發性成分分析

采用GC-MS 對噴菌處理發酵20 d 和60 d 時的豆莢進行揮發性成分分析，噴菌發酵20 d 時檢測出的揮發性物質共47 種（表3），其中烷烴類11種、醛類12種、酸類6 種、烯烴1 種、醇類7種、酚類6 種、酮類2 種、其他類2種，占比最多的是醛類，占檢測出所有物質的28%（圖6A）。噴菌發酵60 d 時豆莢的揮發性成分共有50 種（表4），其中烷烴類有8 種、醛類14 種、酸類4 種、烯烴4 種、醇類10種、酚類5 種、酯類1 種、酮類2 種、其他類2 種，占比最多的依舊為醛類，占總物質種類數量的25.4%（圖6B）。發酵20 d含量最高的物質是香蘭素，其中M3 與S7 按照體積比1∶1噴菌的發酵豆莢香蘭素含量占比最高為80.77%，其次是只噴菌M3 菌株的豆莢，香蘭素含量為78.49%，M3 與S7 按照體積比1∶2和2∶1 噴菌處理的豆莢香蘭素含量占比約為77.00%，CK 香蘭素含量最低。發酵60d時含量最高的揮發物質也是香蘭素，M3 與S7 按照體積比1∶2噴灑的香蘭素含量最高，只噴S7處理與CK 差異不大，其他3 個噴菌處理香蘭素含量均約為88.00%。豆莢發酵20 d 時CK 和只噴M3菌株的處理均檢測到對羥基苯甲醛，且含量僅次于香蘭素。對羥基苯甲醛是合成香蘭素的重要前體物質，在發酵60 d 時每個處理均檢測到對羥基苯甲醛，且含量均大于1.00%。豆莢發酵20 d時單獨噴菌M3、S7 及二者1∶1混合的處理均檢測到2，3-丁二醇。2，3-丁二醇是香草蘭的特征風味物質，在發酵60d時不同處理豆莢中均含有2，3-丁二醇，其中噴灑S7 菌株處理的豆莢中含量高達2.57%，高于其他處理的豆莢。

如圖7所示，有18種揮發物在2個時間均有被檢出，如香蘭素、愈創木酚、乙酸、反-2-癸烯醛、香草乙酮等，且以上物質已被證明大量存在于香草蘭豆莢發酵前期[14]。只噴M3 菌株處理的豆莢60 d 時檢測出3-羥基丁酮，該物質是重要食品香料[26]，具有獨特香味，且其可在無其他碳源的情況下作為B. subtilis 的碳源[21]。

3討論

β-D-葡萄糖苷酶是纖維素酶系中一種重要的水解酶，可以催化風味前體糖苷配基（烴基或芳基）與糖基之間的糖苷鍵水解，產生芳香物質達到增香效果。微生物來源的β-D-葡萄糖苷酶數量龐大，價格低廉，制備容易且用途廣泛[27]。本研究以香草蘭豆莢為原料，分離出21 株可產β-D-葡萄糖苷酶的菌株，并鑒定出其中15 株菌均為芽孢桿菌。從產自馬達加斯加的香草蘭豆莢中篩選出的菌株中，產β-D-葡萄糖苷酶活力最高的菌株M3 為長形賴氨酸芽孢桿菌（L. macroides）。從產自中國熱帶農業科學院香料飲料研究所的香草蘭豆莢中篩選出的菌株中，酶活力最高的菌株S7為副蕈狀芽胞桿菌（B. paramycoides）。鮑捷等[28]篩選到1 株產β-D-葡萄糖苷酶的植物乳植桿菌c4-3，并使用該菌株用于豆漿的發酵，發現添加該菌株后能夠有效提升豆漿的營養。王玲[29]篩選優化了產β-D-葡萄糖苷酶的菌，并將其運用到葡萄酒發酵中，使葡萄酒的香氣物質種類和含量相較于未添加的葡萄酒有顯著差異，具有開發為釀酒增香酶制劑的潛力。

本研究發現只噴菌M3 菌株的香草蘭豆莢香蘭素含量最高，產生的揮發性成分最多，且只噴M3 菌株的豆莢在發酵60 d 時產生了3-羥基丁酮。李林海等[30]研究發現，培養條件影響微生物產生3-羥基丁酮，且微生物發酵是生產3-羥基丁酮的主要方法之一。因此，優化微生物培養條件可提升菌株產3-羥基丁酮的能力，增加香草蘭發酵豆莢香氣。M3 與S7 按照體積比1∶1 噴灑處理的香蘭素葡萄糖苷下降最多為80.7%，說明復合菌液可有效轉化香蘭素葡萄糖苷。傅航等[31]對黃芪渣進行單一菌、2 菌劑復合、3 菌劑復合發酵，發現3 菌劑復合按照1∶1∶1 比例的效果最佳。夏欣欣等[32]使用釀酒酵母和芽孢桿菌經混菌固態發酵米糠后，谷維素含量和抗氧化活性均顯著提高。焦奕豪等[33]使用酵母菌和枯草芽孢桿菌混合固態發酵沙棘果渣，研究結果發現固態發酵沙棘果渣可改善其營養價值。本研究結果為僅噴M3菌株在香蘭素含量、整體揮發性含量等方面效果最佳，M3 與S7 按照體積比1∶1 噴灑處理的香蘭素葡萄糖苷下降最多，后續研究可以增加噴菌比例，找出可以提高香草蘭品質的最佳組合。

從香草蘭豆莢中提取的香蘭素由于其純天然、安全性高、品質優等被廣泛應用于調配高端食品和化妝品中，但天然香蘭素遠遠不能滿足市場需求[34]，采用微生物輔助發酵提升香蘭素產量是獲得高品質香草蘭豆莢，彌補天然香蘭素產量難以滿足市場需求的重要措施之一。通過測定香蘭素含量、香蘭素葡萄糖苷含量、揮發成分等方式確定最佳噴菌方式組合，為后續開發微生物輔助豆莢發酵生香，提升品質提供可靠的菌株資源儲備和技術參考。未來擬研究不同發酵時期、不同噴灑量等對豆莢香氣成分及豆莢表面微生物區系的影響，揭示其提升豆莢品質的微生態機制，研發微生物輔助發酵生香關鍵技術，為獲得高品質香草蘭豆莢，開發高附加值產品提供理論與技術支撐。