銅綠假單胞菌PaHNHK01的鑒定及其對劍麻煙草疫霉的生防效果研究

關鍵詞：劍麻斑馬紋病；煙草疫霉；銅綠假單胞菌；生物防治

中圖分類號：S435.63；S476.1 文獻標志碼：A

劍麻為龍舌蘭科龍舌蘭屬的一種熱帶麻類經濟作物，是世界最常用的一類硬質纖維植物。原產于墨西哥，現廣泛分布于多個熱帶國家和地區[1]。我國從20 世紀50 年代初期的小規模種植到60 年代引種劍麻H.11648 雜交品種，后逐步發展到當代的劍麻主產地之一，廣泛分布在我國華南一帶[2]。劍麻葉片纖維豐富，纖維細胞長，細胞壁厚，質地堅韌，因此劍麻有耐磨、耐鹽堿、不易腐蝕等特性[3]。其纖維合成的聚合物復合材料具有隔熱、輕便且有韌性等優點[4]。因此劍麻纖維廣泛用于工業、農業、漁業及國防等領域[5-6]。經研究發現，劍麻中分離的皂苷元、多糖類等化學成分可用于醫療行業，為臨床提供用藥依據[7-8]。此外，劍麻麻渣還可制造飼料和有機肥[9]、提取皂素等[10-12]，大大提高了劍麻的綜合利用程度[13]。

劍麻斑馬紋病首次發現于1961年，主要的致病菌為煙草疫霉菌[14-17]，劍麻煙草疫霉可侵染整株，大多為先感染葉片，之后向莖、軸延伸，分別引起葉斑、莖腐和軸腐等癥狀，嚴重時整株劍麻死亡[18]。劍麻斑馬紋病的侵入方式主要是傷口侵入，在田間最主要的侵染方式主要是通過土壤地面徑流和雨水傳播[19]。目前生產上對斑馬紋病的防治還是以預防為主，優先采取農業技術措施防治，化學防治為輔，并結合抗病育種等綜合防治措施[20]。但長期使用化學藥劑防治不但污染環境、造成農藥殘留，而且植物自身可能會產生抗藥性。因此利用拮抗微生物通過其競爭、抗生、溶菌和誘導等各種作用機制來防治土傳病害，從而減緩或預防病原菌侵害的程度，是減輕環境污染、維護生態平衡的一種有效且綠色環保的防治途徑[21-22]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試生防菌：菌株PaHNHK01 分離自海南省海口市的胡椒植株上，保存于中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所。

供試病原菌： 煙草疫霉菌（ Phytophthoranicotianae）保存于中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶糧食與特色作物病害研究組；抑菌譜病原菌參照侯會霞等[23]的病原菌，略有改動，供試病原菌見表1。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株的篩選 用五點對峙法[24]篩選生防菌，在PDA 固體平板中心接入5 mm 煙草疫霉菌餅，以菌餅為中心，在其上下左右20 mm 處接入生防菌，以只在中心接入病原菌為對照，每個3 次重復，于28 ℃恒溫箱中培養5～8 d，待對照菌落長至平板2/3 時，測量病原菌菌落直徑（cm），計算抑菌率[25]。

1.2.2 生防菌株的鑒定 （1）形態學觀察。將生防菌接入LB 培養基中振蕩培養后按梯度稀釋并涂布于LB 平板上，于28 ℃恒溫培養18～24 h，觀察單菌落特征。采用革蘭氏染色法[26]測定生防菌株的種類。

（2）生理生化指標測定。參照《常見細菌系統鑒定手冊》[27]的方法，對生防菌株PaHNHK01的部分生理生化特性進行測定，各個指標測定參照侯會霞等[23]的方法。

（3）分子生物學鑒定。將生防細菌單菌落接種于LB 液體培養基中28 ℃、180 r/min 過夜培養，離心收集菌體，用OMEGA 細菌DNA 提取試劑盒進行生防細菌DNA 的提取。所用引物為細菌鑒定通用引物16S rDNA 和管家基因引物atpD、gapA 和rpoA，參照侯會霞等[23]和魏靖宇等[28]的引物序列和反應程序。

將PCR 反應產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選取成像清晰且符合預期條帶大小的PCR產物送深圳華大基因股份有限公司進行測序。隨后利用NCBI 數據庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg）的GenBank 進行BLAST 分析，并進行同源序列比對。然后使用MEGA 11 軟件對序列進行分析，對參考序列進行串聯拼接，利用鄰接法（neighbor-joining， NJ）構建系統發育樹，最終確定菌株的分類地位。

1.2.3 生防菌抑菌譜測定 參照1.2.1 中的方法測定生防菌株PaHNHK01 對12 種供試病原菌的抑制效果，觀察并計算其抑菌率[29]。

1.2.4 生防菌促生功能測定 采用 Salkowski 比色法測定菌株PaHNHK01 的產IAA 能力[30]，以IAA 標準液50 μg/mL 處理的LB 培養基為陽性對照（CK⁺），未接菌的LB 培養基為陰性對照（CK^?）；參照郭海等[31]的方法測定菌株PaHNHK01 的溶磷能力；采用點接法測定解鉀能力[32]；用固氮培養基測定固氮能力；采用CAS 培養基測定嗜鐵素。

1.2.5 生防菌對劍麻葉片的離體防效 選取健康、長勢一致的劍麻葉片同時接入煙草疫霉菌和生防菌PaHNHK01。分別在葉片上、中、下3 個部位用滅菌后的昆蟲針刺傷，參照邱睿等[33]的方法，在刺傷部位菌絲面朝下接種直徑為10 mm 的煙草疫霉菌餅， 并噴施1 mL 濃度為1×10⁸CFU/mL 的PaHNHK01 菌懸液；以只接煙草疫霉菌餅為陽性對照（CK⁺）；以只噴施NA 液體培養基（CK₁^?）和空白V8 菌餅（CK₂^?）為陰性對照，接種后用無菌脫脂棉和無菌水保濕，觀察發病情況并計算防效。

1.2.6 生防菌次生代謝產物對病原菌的影響 （1）銅綠假單胞菌發酵濾液的制備。取28 ℃振蕩培養48 h 的PaHNHK01 發酵液，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄沉淀，用0.22 μL 細菌過濾器過濾上清液，重復2 次，得無菌發酵液[34]。

（2）無菌發酵液抑菌活性的測定。采用含藥平板法，將無菌發酵液按不同梯度加入已融好且冷卻到55 ℃左右的V8 培養基中，充分混勻后倒入培養皿制成固體平板培養基。凝固后將5 mm劍麻斑馬紋病菌菌餅接種到平板中央，以不加PaHNHK01 發酵濾液的平板為對照，于28 ℃恒溫培養[34]，觀察病原菌菌絲生長情況并按照1.2.1的方法計算抑菌率。

（3）PaHNHK01 粗提物提取及其抑菌活性的測定。制備PaHNHK01 發酵液4 L，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，保留上清液，用等體積的乙酸乙酯萃取PaHNHK01 有機相，將萃取的有機相合并， 于42 ℃ 條件下旋轉蒸發， 留下物質即PaHNHK01 粗提物。參照1.2.6-（2）的方法測定抑菌活性。

1.3 數據處理

利用Excel 2019 和IBM SPSS Statistics 26 軟件進行數據統計與分析，采用Duncan’s 新復極差法進行試驗數據的差異顯著性檢驗；分子生物學鑒定使用DNAman 軟件進行序列拼接，用MEGA11 軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 生防菌株的活化與篩選

通過活化篩選獲得生防菌株PaHNHK01，菌株PaHNHK01 對病原菌絲生長抑制率為89.79%，PaHNHK01 對煙草疫霉菌菌絲有明顯的抑制效果（圖1）。通過光學顯微鏡對煙草疫霉菌菌絲進行觀察，發現對照正常菌絲表面光滑、粗細均勻、生長正常（圖2A），而PaHNHK01 對峙的煙草疫霉菌出現菌絲體畸形（圖2B）、膨大增粗（圖2C）、分支（圖2D）等現象。

2.2 生防菌株的鑒定

2.2.1 形態學特征 菌株PaHNHK01 的菌落在LB 平板上呈現出不透明的橘黃色菌體，其邊緣整齊，表面較光滑（圖3A）。經革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察發現，PaHNHK01 菌體細胞為桿狀，革蘭氏染色后呈紅色（圖3B），因此PaHNHK01為革蘭氏陰性細菌。

2.2.2 生理生化鑒定 生理生化測試結果顯示，菌株PaHNHK01 在氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原和明膠液化測試中呈陽性反應，在乙酰甲基甲醇、甲基紅和淀粉水解測定中呈陰性反應。此外，該菌株能利用葡萄糖、果糖和甘露醇產酸，但不能利用山梨醇和蔗糖產酸。在NaCl 濃度為2%～10%時，該菌株均可生長，但不能利用葡萄糖、蔗糖、山梨醇、果糖和甘露醇產氣（表2）。

2.2.3 分子生物學鑒定 測序結果經過DNAman軟件拼接處理后，菌株PaHNHK01 的16S rDNA有效序列長度為1397 bp，atpD、gapA 和rpoA 有效序列長度分別為964、931、931 bp。在NCBI網站進行BLAST 序列比對發現，菌株PaHNHK01與銅綠假單胞菌的同源性極高。利用MEGA 11軟件，采用鄰接法構建系統發育樹，結果顯示菌株PaHNHK01 的16S rDNA、atpD、gapA、rpoA序列與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）聚為一支（圖4、圖5）。綜合考慮生防菌的形態特征、生理生化特征以及系統發育樹分析結果，確認菌株PaHNHK01 為銅綠假單胞菌。

2.3 生防菌抑菌譜測定

生防菌PaHNHK01 對12 種供試病原菌均有不同程度的拮抗效果（圖6，表3），對4 種卵菌類病原菌菌絲的抑菌率均在75%以上，其中PaHNHK01對大豆疫霉菌（P. sojae）的抑制效果最好，抑菌率為93.33%，對辣椒疫霉菌（P. capsica）、棕櫚疫霉菌（P. palmivora）、瓜疫霉菌（P. melonis）的抑菌率分別為80.45%、76.67%、75.22%。對8 種病原真菌的菌絲抑制率均在55.33% 以上， 其中PaHNHK01 對暹羅刺盤孢菌（C. siamense）的抑制效果較強，抑制率為81.33%，對尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）抑制效果較弱，抑菌率為55.33%。

2.4 生防菌促生特性分析

生防菌促生特性結果表明，菌株PaHNHK01不具有產植物激素IAA 能力（圖7A）；在有機磷培養基和無機磷培養基上，菌株PaHNHK01 的菌落周圍均出現透明暈圈（圖7B，圖7C）；但在鉀培養基上并未觀察到菌落周圍產生透明油滴狀暈圈（圖7D）；在阿須貝無氮固體培養基上，菌株生長狀況良好（圖7E）；在CAS 固體培養基上PaHNHK01 的菌落周圍則呈現橘黃色暈圈（圖7F）。結果表明，菌株PaHNHK01 具備解有機磷、解無機磷、固氮和產鐵的能力，卻不具備解鉀的能力。

2.5 生防菌對劍麻葉片的離體防效

生防菌PaHNHK01 對劍麻離體葉片斑馬紋病有較好防效，只接種煙草疫霉菌的劍麻葉片發病嚴重，同時接種PaHNHK01 和煙草疫霉菌的葉片發病率明顯降低， 防治效果明顯（ 圖8 ），PaHNHK01 對劍麻斑馬紋病的防效為88.62%，防治效果較理想。

2.6 生防菌次生代謝產物對病原菌的影響

2.6.1 無菌發酵液對劍麻煙草疫霉菌的影響 PaHNHK01 無菌發酵液對劍麻斑馬紋病菌有明顯的抑制效果（圖9）。室內毒力測定結果表明，PaHNHK01 無菌發酵液濃度為15 μL/mL 時，抑菌率為39.61%；無菌發酵液濃度為60 μL/mL 時，抑菌率達74.89%。PaHNHK01 無菌發酵液的EC50值為20.3679 μL/mL（表4）。

2.6.2 PaHNHK01 粗提物對劍麻煙草疫霉菌的影響 PaHNHK01 粗提物對劍麻斑馬紋病菌有明顯的抑制效果（圖10）。室內毒力測定結果表明，PaHNHK01 粗提物濃度為在20 μg/mL 時，抑菌率為56.07%；粗提物濃度為80 μg/mL 時，抑菌率達89.36% 。PaHNHK01 粗提物的EC₅₀ 值為11.9456 μg/mL（表5）。

3 討論

H.11648 是我國目前劍麻主要栽培品種，該品種高產但極易受煙草疫霉的侵害[35-36]，目前生產上以預防為主，農業技術措施、化學藥劑防治與抗病育種等相結合的綜合防治措施[20， 37-38]。生產上常用的化學藥劑有敵克松、甲基托布津等[39-40]。抗病育種難度大、周期緩慢，裴超群等[41]選育的龍舌蘭雜種76416 抗病但出麻率低，目前尚無明確的高產和抗病品種來代替H.11648[42]。而農業防治費時費力，化學防治會對環境產生負面影響，還有農藥殘留等問題[43]，因此，生物防治可以有效緩解目前面臨的這些問題。本研究成功分離出1 株對劍麻斑馬紋病病原菌有抑制作用的細菌，抑制率為89.79%，通過對該菌的形態學觀察、生理生化檢測以及分子鑒定，確定菌株PaHNHK01為銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）。

目前常見的生防細菌有芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌[44]、解淀粉芽孢桿菌[45]、多粘類芽孢桿菌[23]等；假單胞菌屬的銅綠假單胞菌[46]、惡臭假單胞菌[47]等。生防真菌有深綠木霉[48]、哈茨木霉[49]等。生防放線菌主要有鏈霉菌[50]等。銅綠假單胞菌次生代謝產物非常豐富，已被鑒定的有24 種[51]，且對多數植物病原菌有抑制效果。比利時的ISWANDI 等[52]在1987 年首次從大麥根部分離到1 株銅綠假單胞菌7NSK2，利用其菌懸液處理種子和土壤，對植物有促生效果，還可以使植物根際微生物的種群得到改善。研究表明，銅綠假單胞菌對立枯絲核菌、齊整小核菌、腐皮鐮孢、柑橘黃單胞菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌等均有抑制作用[53]。譙天敏等[54]利用抗生素標記法發現銅綠假單胞菌ZB27 可以定殖在植株上，對雜交竹梢枯病有較好的防控效果。任小平等[55]研究表明銅綠假單胞菌可作為一種有較好應用前景的新型生物農藥。還有研究發現銅綠假單胞菌的抑菌機理是產生一系列化合物，如吩嗪-1-羧酸、藤黃綠膿菌素、3，4-二羥基-N-甲基-4-苯并二氫吡喃酮-丁酰胺等，這些產物對病原菌生長均有較強的抑制效果[56-57]，如銅綠假單胞菌產生的吩嗪-1-羧酸對小麥全蝕病菌、辣椒疫霉、黃瓜炭疽病菌、甜瓜蔓枯病菌和水稻紋枯病菌等病原菌均有較強的抑制作用[58]。本研究中的銅綠假單胞菌PaHNHK01 具有良好的生防潛力，對煙草疫霉、大豆疫霉、棕櫚疫霉等12 種植物病原，均有良好的抑制效果，表明PaHNHK01 具有廣譜抑菌性。而且PaHNHK01 具有較強的溶磷、固氮等促生功能。但對銅綠假單胞菌的研究大多報道的是臨床醫學領域，與臨床分離的菌株相比，從根際分離的銅綠假單胞菌毒性較低，但仍有一定毒性[59]，因此運用生防菌的代謝產物來抑制病原菌非常必要。菌株PaHNHK01 的無菌發酵濾液對劍麻斑馬紋病病原菌的抑菌效果顯著，其EC₅₀ 值為20.3679 μL/mL，其粗提物對病原菌的抑制效果更為明顯，EC50 值為11.9456 μg/mL。表明劍麻斑馬紋病病原菌的生長受生防菌PaHNHK01 代謝產物的影響，因此生防菌PaHNHK01 具有良好的生防潛力，研究結果為劍麻斑馬紋病病原菌煙草疫霉的生物防治提供良好的菌種資源。