芒果乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵基因MiCTR1的克隆與序列分析

關(guān)鍵詞：芒果；乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子；CTR；克隆；表達(dá)分析

中圖分類號：S667 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

芒果（Mangnifera indica L.）是著名的熱帶水果，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，中國的芒果產(chǎn)量居世界第二[1-3]，其中，臺農(nóng)1 號芒果（Tainung No.1）在我國海南、廣東、廣西等地均有大面積種植，它不僅品質(zhì)優(yōu)良，還豐產(chǎn)性好、適應(yīng)性強(qiáng)。芒果屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后代謝旺盛且對乙烯非常敏感，容易后熟而變黃、變軟，繼而腐爛，致使其品質(zhì)大幅降低，貨架期短，影響芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。CTR1是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的負(fù)調(diào)控因子，乙烯受體接收到乙烯信號后，能夠與CTR1 反應(yīng)，共同完成乙烯反應(yīng)的負(fù)調(diào)控模式[5]。CTR1 由多基因家族編碼，它們在結(jié)構(gòu)和基因時空表達(dá)上各有特點(diǎn)[6]。目前已經(jīng)分離擬南芥[7]中的AcTR1 基因，在模式植物的基礎(chǔ)上，CTR 基因在其他果實(shí)中的研究也取得了進(jìn)展。番茄[8]和番木瓜[6]中分別分離出4 個CTR 基因，分別為LeCTR1～4 和CpCTR1～4，蘋果中分離了5 個MdCTR基因[9]，獼猴桃中分離了2 個AdCTR 基因[10]，而在大多數(shù)植物或果實(shí)中只分離到1 個CTR1 基因，如小麥[11]、大豆[12]、梨[13]、甘蔗[14]、甜瓜[15]等。隨著研究的深入，每一種果實(shí)中可能將會有更多的CTR 基因不斷被克隆。CTR1 直接影響果實(shí)成熟、衰老、軟化進(jìn)程，在植物的生長、果實(shí)成熟過程中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用，且在不同植物中表達(dá)模式可能不同。在番茄果實(shí)成熟過程中，4個CTR1-like 基因中只有LeCTR1 轉(zhuǎn)錄本含量隨著果實(shí)后熟進(jìn)程而明顯增強(qiáng)，且能被外源乙烯所誘導(dǎo)[8]。木瓜的4 個CTR1-like 基因中，CpCTR2 和CpCTR4 與果實(shí)硬度呈顯著負(fù)相關(guān)，表明CpCTR可能在果實(shí)軟化中起重要作用[6]。桃子PpCTR1基因的表達(dá)量在乙烯釋放量達(dá)到最大量時相應(yīng)減少，表明PpCTR1 基因與果實(shí)成熟軟化有密切關(guān)系[16]。

課題組前期已經(jīng)分離并克隆了乙烯受體基因[17]，但芒果的CTR1 基因的分離和鑒定還未見報(bào)道。本研究以臺農(nóng)1 號芒果為材料，結(jié)合芒果全基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對MiCTR1 基因進(jìn)行克隆和序列分析，并通過實(shí)時熒光定量PCR 檢測其在芒果采后不同時期的相對表達(dá)量，揭示乙烯抑制劑1-MCP 處理對采后芒果CTR1 基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為研究CTR1 在果實(shí)成熟、衰老中的作用提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為延長果實(shí)的貯藏壽命奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

臺農(nóng)1號芒果采摘于廣西百色市，挑選大小均勻、成熟度8～9 成的果實(shí)為材料。1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）購于龍杏生技制藥股份有限公司；植物總RNA 提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；RNAprep Pure 植物總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR 試劑盒和ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 芒果采摘之后參照YUAN 等[18]的方法進(jìn)行處理，分為對照組（CK）和處理組（0.1 mg/L 1-MCP），處理之后的芒果分別用厚度為0.007 mm 的聚乙烯薄膜袋子分裝，置于25 ℃，相對濕度為85%～90%的條件下貯藏10 d，每2 d 取樣測定乙烯釋放速率和實(shí)時熒光定量分析。果肉樣品用液氮冷凍后，于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乙烯釋放速率檢測 參照MIKU?A 等[19]的方法，采用乙烯分析測定儀檢測果實(shí)的乙烯釋放速率，結(jié)果以μL/（kg·min）計(jì)。

1.2.3 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成按照HiPure HP Plant RNA Mini Kit 提植物總RNA小提試劑盒說明書，提取芒果組織總RNA。取總RNA 1 μg 使用HiScript?ⅡQ RT SuperMix forqPCR 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，用于后續(xù)基因克隆和實(shí)時熒光定量分析。

1.2.4 基因克隆 根據(jù)前期芒果轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果，使用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。以采后芒果果皮cDNA 為模板擴(kuò)增目的片段全長。擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 uL）：2×Es TaqMaster Mix （Dye） 25.0 μL， 10 μmol/L 引物各2.0 μL，cDNA 模板2 μL，ddH₂O 補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，連接至pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐霉素的LB 固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 使用ExPASy-ProtParam、TMPRED、SignalP 5.0 Serve 和NetPhos 3.1 軟件預(yù)測MiCTR1 蛋白的理化特性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和磷酸化位點(diǎn)；使用NCBI 的CD-Search 軟件分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；使用SOPMA 和Phyre2軟件分析蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)；使用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行不同物種間同源基因的多序列比對分析；使用MEGA 6.0 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并進(jìn)行1000 次Bootstrap 檢驗(yàn)。

1.2.6 實(shí)時熒光定量分析 通過qRT-PCR 檢測MiCTR 基因的表達(dá)情況，以芒果Actin1 為內(nèi)參基因[20]，熒光定量PCR 引物見表1。參照TransstartTip Green qPCR Super Mix 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系（20.0 μL）：2×Trans Taq HiFiPCR SuperMix 10.0 μL，cDNA 模板1.0 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，ddH₂O 補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)3 次重復(fù)，采用2^–ΔΔCT 法計(jì)算MiCTR 基因的相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Duncan 法比較平均值之間的差異顯著性，使用Origin 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiCTR1基因克隆和序列分析

利用RACE 技術(shù)克隆獲得MiCTR1 基因的3'末端和5'末端序列，將其與中間片段進(jìn)行拼接，獲得MiCTR1 基因。MiCTR1 基因的cDNA 開放閱讀框長度為1551 bp，編碼516 個氨基酸。將MiCTR1 蛋白的氨基酸序列與其他物種的同源蛋白經(jīng)過BLAST 比對分析發(fā)現(xiàn)（圖1），其與阿月渾子（Pistacia vera，XP_031265951.1）、全緣黃連木（Pistacia integerrima，KAJ0042545.1）、苦楝樹（Melia azedarach，KAJ4705780.1）、甜橙（Citrussinensis，XP_031265951.1）、巴西橡膠樹（Heveabrasiliensis，XP_021639805.2）的相似度分別為85.16%、85.35%、70.02%、68.64%、62.06%，表明MiCTR1 與其他物種的同源性蛋白相似度較高。

2.2 MiCTR1 蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

通過ExPASy 軟件中的Protparam 預(yù)測MiCTR1 蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白的分子式為C₂₅₀₃H₃₉₃₂ N₇₁₂O₇₉₇S₂₆，總原子數(shù)為7970，分子量為57.58 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為5.72，負(fù)電荷和正電荷的氨基酸殘基總數(shù)分別為64（Asp+Glu）和50（Arg+Lys）個，脂肪系數(shù)為70.78。

MiCTR1 蛋白在氨基酸序列的第253 和第137處有疏水峰和親水峰（圖2），分別為1.689 和–2.878。親水值在–2.000 以下的親水峰有20 個，而疏水值在+2.000 以上的疏水峰為0 個。其親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸，且親水性總平均值為–0.596，故推測MiCTR1 蛋白為親水性蛋白。

2.3 MiCTR1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

利用NetPhos3.1軟件預(yù)測MiCTR1 蛋白磷酸化位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)閾值為0.5），如圖3 所示，MiCTR1 蛋白含有111 個磷酸化位點(diǎn)，其中含絲氨酸（Ser）82 個，蘇氨酸（Thr）15 個，酪氨酸（Tyr）14 個。由此可預(yù)測，MiCTR1蛋白調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是以絲氨酸（Ser）的磷酸化修飾為主，蘇氨酸（Thr）為輔。

2.4 MiCTR1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用TMHMM Server v5.0 軟件對MiCTR1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖4 所示，MiCTR1 蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測MiCTR1 蛋白的信號肽，結(jié)果如圖5 所示，MiCTR1蛋白無信號肽序列（Likelihood 為0.0018），推測其為非分泌蛋白。使用PSORT II 軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示MiCTR1 蛋白定位于細(xì)胞核。

2.5 MiCTR1蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用NCBI 的CD-Search 分析MiCTR1 蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖6 所示，MiCTR1 蛋白在氨基酸序列189～285 處含有1 個保守的PB1 結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，是形成大分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物以確保細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中特異性所必需的模塊化結(jié)構(gòu)域。

2.6 MiCTR1 蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過ExPASy 軟件中的SOPMA 對MiCTR1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖7 所示，該蛋白由α-螺旋（16.09%）、延伸鏈（12.79%）、β-轉(zhuǎn)角（1.74%）和無規(guī)則卷曲（69.38%）4種結(jié)構(gòu)組成，其中以無規(guī)則卷曲為主。利用SWISSMODEL軟件預(yù)測MiCTR1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8 所示，該蛋白有7 個β-折疊，4 個α-螺旋。

2.7 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

使用MEGA 6.0 軟件的Neighbor-Joining 法構(gòu)建MiCTR1 與其他物種CTR1 氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果表明（圖9），MiCTR1 與扁桃（Prunus dulcis）、桃（Prunus" persica）的CTR1親緣關(guān)系最近，其次是甜櫻桃（Prunus avium）、杏（Prunus armeniaca）、梅（Prunus mume）。

2.8 MiCTR1 基因在芒果貯藏期的表達(dá)分析

CTR1能與乙烯受體家族成員結(jié)合而被激活，阻礙乙烯的傳遞使植物表現(xiàn)出乙烯響應(yīng)不敏感。由圖10A 所示，對照組的MiCTR1 基因在貯藏0～6 d 內(nèi)的表達(dá)量快速上調(diào)，而后緩慢下調(diào)。處理組的MiCTR1 基因的表達(dá)量在2～4 d 內(nèi)上調(diào)，4～6 d出現(xiàn)短暫下調(diào)之后，在貯藏后期上調(diào)。相比對照，乙烯抑制劑1-MCP 處理下調(diào)了MiCTR1 基因的表達(dá)，但在貯藏第10 天的表達(dá)量高于對照。前期研究顯示，在貯藏的0～6 d，1-MCP 處理的芒果軟化程度更低[18]，這可能與MiCTR1 基因的表達(dá)特性有關(guān)，表明MiCTR1 基因在芒果的后熟軟化中起作用。

由圖10B所示，處理組芒果在采后貯藏的前6d內(nèi)乙烯釋放速率比較慢，在第6天開始快速上升，第7天達(dá)到最高峰后快速下降。對照組芒果的乙烯釋放速率從第5天開始快速上升，到第7天達(dá)到最高峰，而后快速下降。結(jié)果表明，經(jīng)1-MCP處理后的芒果未推遲乙烯釋放速率高峰的出現(xiàn)，但是極顯著降低了峰值（Plt;0.01）。

3討論

本研究克隆了臺農(nóng)1 號芒果MiCTR1 基因，通過生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)，MiCTR1 基因編碼的蛋白為親水蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，MiCTR1蛋白含有一個PBI 結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核，這與番木瓜[6]中CpCTRs 的定位結(jié)果一致。同源分析發(fā)現(xiàn)，MiCTR1 與扁桃、桃的CTR1 親緣關(guān)系最近。

芒果采后后熟軟化受到乙烯轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，CTR1 在乙烯信號通路中發(fā)揮著核心作用[21]。本研究中MiCTR1 基因的相對表達(dá)量在芒果采后貯藏的前6 d 快速上升。前期的研究顯示芒果硬度在相同時期快速下降[18]，二者剛好呈現(xiàn)相反的趨勢，這與番木瓜[6]的結(jié)論一致。MiCTR1 基因在芒果后熟期間表達(dá)上調(diào)，推測其可能在芒果的軟化中起作用。此外，榴蓮[22]、蘋果[23]中CTR1 基因的表達(dá)也分別在果實(shí)成熟期間上調(diào)。CTR 基因的表達(dá)還受到乙烯和乙烯抑制劑的影響，1-MCP 處理顯著抑制番木瓜CpCTRs[6]、桑葚MaCTR1[21]、榴蓮DzCTR1[22]、晚熟品種李子PsCTR1[24]的表達(dá)，這與本研究結(jié)果一致。經(jīng)1-MCP 處理的蘋果果實(shí)中MdCTR1 基因的相對表達(dá)量高于對照果實(shí)[25]，說明乙烯抑制劑對CTR1 基因的表達(dá)調(diào)控在不同物種中存在差異。乙烯對CTR 基因的表達(dá)調(diào)控也存在物種差異，在番茄中，LeCTR1 的表達(dá)在其花衰老和果實(shí)成熟期間上調(diào)，并且被乙烯高度上調(diào)[26]，乙烯還使榴蓮[22]、梨子[13]和李子[24]的CTR1 的表達(dá)上調(diào)，而桑葚MaCTR1[21]的表達(dá)受到乙烯的抑制，而最早從擬南芥中分離出來的AtCTR1，其表達(dá)則不受包括乙烯在內(nèi)的外部刺激的影響[27]。

在本研究中，對照組的乙烯釋放量在貯藏的6～8d最高，而MiCTR1 基因的相對表達(dá)量在第6天和第8 天也相對較高，說明乙烯能使MiCTR1基因表達(dá)上調(diào)。而1-MCP 處理組芒果MiCTR1 基因的表達(dá)則未出現(xiàn)這樣的規(guī)律。由于CTR1 是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，因此還有報(bào)道指出特定組織中CTR1 的水平與該組織的乙烯敏感性呈負(fù)相關(guān)[28]。西葫蘆CpCTR1 和CpCTR2 在雄花花瓣中的表達(dá)高于雌花，可能是雄花對乙烯的敏感性較低導(dǎo)致的[29]。芒果果實(shí)在成熟過程中對乙烯的敏感性可能也會發(fā)生變化，因此，MiCTR1 基因的表達(dá)隨著果實(shí)的后熟軟化上調(diào)，同時也受到乙烯抑制劑的調(diào)控。