芒果MiERF3基因的克隆及表達分析

關鍵詞：芒果；ERF 轉錄因子；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號：S31 文獻標志碼：A

芒果，素有“熱帶水果之王”之美譽，具有很高的營養和經濟價值。其中貴妃芒果以其黃、紅相間的果皮以及核薄肉厚的特點深受人們喜歡[1]。果皮色澤是最直觀的果實品質性狀，花色苷是貴妃芒果最重要的色素物質[2]，使果實展現為與其他芒果品種不同的紅色。乙烯是一種重要的植物激素，對果實的后熟生理變化和次生代謝具有重要的調控作用[3]。伴隨生物學技術的發展，關于乙烯對果實后熟生理變化的影響及次生代謝的調控研究取得了顯著的進展[4]。

研究指出，乙烯可以影響苯丙氨酸轉氨酶（PAL）和查爾酮異構酶（CHI）的活性，從而實現對花青素生成的促進或抑制[5]。ERF 轉錄因子是乙烯信號通路的關鍵下游成分，作為最大的轉錄因子家族之一，起到調節信號傳導和生理反應的作用[6]。AP2/ERF 轉錄因子超家族存在于眾多植物中， 該家族蛋白特征明顯， 含有典型的AP2/ERF 結構域，具有結合DNA 的功能[7]。AP2/ERF 最早從煙草和擬南芥中分離發現，功能域主要由轉錄調控功能域、DNA 結合功能域、寡聚化位點功能域和核定位信號功能域4 個部分構成[8]。AP2/ERF 轉錄因子家族成員包含AP2/ERF結構域，該結構域是ERF 行使轉錄調控的關鍵，也是與其他轉錄因子區分的主要依據[9-10] 。AP2/ERF 家族轉錄因子根據其含有的結構域數量和是否含有其他類型結構域為依據，將其分為4個亞族（AP2、DREB、ERF、RAV）和單獨成員（Soloist）[11–13]。

大量文獻表明，在許多水果中已經發現ERF轉錄因子作為與果實色澤轉變相關的激活因子或抑制因子，在果實成熟的過程中，ERF 轉錄因子因其多樣性，可能發揮多種功能[14–17]。研究表明，番茄果實中的SiERF6 能夠參與調控類胡蘿卜素合成途徑和乙烯代謝途徑，在成熟過程中發揮重要的調控作用[18]。經乙烯處理后，SlERF-E1、SlERF-E2 和SlERF-E4 能夠有效調控番茄果實成熟轉色[19]。WANG 等[20]的研究結果表明，6 個ERF基因在桃子成熟過程中顯著上調，表現出與成熟相關的表達模式。有研究表明，乙烯信號轉導過程中，AP2/ERF 轉錄因子能夠結合乙烯合成相關基因啟動子從而調控果實成熟與發育，也可以激活新受體的合成或受體的降解來調控乙烯反應的轉導[6]。如，在梨中，轉錄因子PbERF24 可以結合PbACO54 的啟動子參與梨果實成熟[21]；在蘋果中，MdERF2/3 可以通過結合MdACS1 啟動子中的DRE 結合位點參與果實成熟[22-23]；CpERF9 作為轉錄抑制因子，通過結合CpPME1/2 和CpPG5 啟動子中的GCC box 來控制木瓜果實成熟[24-25]；在香蕉中，MaERF9 和MaERF11 也可作為轉錄激活物或抑制物，在轉錄過程中結合乙烯合成相關基因啟動子達到調控果實成熟的作用[26]。因此，本研究結合前期報道及本課題組轉錄組測序數據，以采后貴妃芒果為材料，通過PCR 擴增技術，獲得1 個AP2/ERF 轉錄因子MiERF3，并進行不同層面的生物信息學分析，隨后對其在芒果不同組織部位以及芒果貯藏階段的基因表達量進行檢測。本研究旨在進一步探討ERF 在芒果乙烯信號傳導過程中的作用，以及其在芒果采后貯藏保鮮應用中的功能，為相關領域提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用產自海南省陵水縣英州鎮芒果基地（18°25′N，109°51′E）的貴妃芒果（Mangiferaindica L. var.）作為試材。在果實達到八成熟階段時，立即進行采摘并運送至實驗室。在培養箱恒溫恒濕條件下，將采摘后的芒果分別貯藏0（即采摘當天）、3、6、9、12 d，溫度25 ℃，濕度為95%。隨后，采集芒果陰面的果皮樣本，經過液氮速凍處理后，保存于?80 ℃的冰箱，以備后續的基因克隆及qRT-PCR 分析使用。

大腸桿菌DH5 α 感受態、農桿菌GV3101 感受態、酵母菌Y2H 感受態購自海口基睿生物科技有限公司提供。DL 2000 DNA marker、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶 SpeⅠ、BglⅡ、瓊脂糖、T4 DNA 連接酶、氨芐青霉素、卡那霉素等購自海南合輝實業有限公司。引物合成與測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因組RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成 通過CTAB 法提取芒果果皮基因組RNA 后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對RNA 質量進行嚴格檢測。使用超微量分光光度計（Implen， Germany）對2 μL 的RNA 樣本進行濃度和純度的精確測定。參照MonScript ? RTIII All-in-One Mix withdsDNase 試劑盒說明書進行逆轉錄RNA。所有合格的樣品保存于?20 ℃備用。

1.2.2 MiERF3 基因克隆與序列分析 結合實驗室前期結果與對芒果轉錄組數據的分析，篩選出MiERF3 基因。隨后，利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ ） 、Expasy （ https：//web.expasy.org/translate/ ） 、Uniprot （ https：//www.uniprot.org/blast/）在線工具以及TBtools 等專業軟件工具，對MiERF3 基因序列進行深入分析。使用Primer 5軟件設計全長引物（表1），利用PCR 技術擴增目標基因。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收約720 bp 大小的目的條帶。將回收的片段與pMD19-T 載體在4 ℃條件下進行過夜連接，并將連接產物轉入DH5α，隨后進行菌落PCR 驗證。將陽性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果使用DNAMAN 6.0 軟件進行序列比對。

利用NCBI Blast 程序對克隆得到的MiERF3基因的CDS 序列進行比對分析。此外，利用在線軟件NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）預測MiERF3 蛋白質的保守結構域。利用ExPASy ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）、NetPhos 3.1（Serverhttps：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）、SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM Server v 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）等在線軟件進行序列分析。同時，通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件對MiERF3 蛋白的結構進行分析。

為了探究MiERF3在不同物種中的保守性和進化關系，使用DNAMAN 6.0 軟件進行了多序列比對，并利用MEME 5.5.0軟件分析其motif 結構，將motif 數設為10。使用MEGA-X 軟件構建系統進化樹。

1.2.3 亞細胞定位 采用洋蔥內表皮轉化法[31]進行亞細胞定位分析，在原方法上進行了適度優化。首先，設計特異性引物（表1），并運用雙酶切技術，將目的片段構建至pCAMBIA1302-GFP（35S：：GFP）表達載體中，生成35S：：MiERF3-GFP 融合表達載體。選用SpeⅠ和BglⅡ作為酶切位點。將重組質粒轉化至GV3101 農桿菌，并制備OD600 為0.8～1.0 的懸浮液。將洋蔥內表皮（2 cm×2 cm）浸泡于該懸浮液中，減壓處理10 min。使用濾紙緩慢吸取洋蔥內表皮過多的液體，確保其干燥后，再轉移到鋪有濾紙的MS 固體培養基上培養48 h。培養結束后，制作玻片樣本，并通過倒置熒光顯微鏡觀察并記錄熒光信號。

1.2.4 MiERF3 毒性及自激活檢測 運用雙酶切構建表達載體，引物序列見表1。利用T4 DNA 連接酶將啟動子序列插入到載體上，構建重組質粒。將pGBKT7-MiERF3 重組質粒、pGADT7 空載質粒與Y2H 酵母感受態（50 μL）、Carrier DNA（10 μL）以及PEG/LiAc buffer（500 μL）充分混勻。30 ℃水浴 30 min 后42 ℃水浴15 min，5000 r/min 離心40 s 棄上清，ddH2O 400 μL 重懸，離心30 s 棄上清。用ddH₂O 50 μL；重懸，涂至DDO 培養基上，29 ℃培養48～96 h。挑取正常生長的酵母菌落用0.9% NaCl 溶液將其梯度稀釋，點至QDO、QDO/X-α-Gal/AbA（1000 ng/mL）培養基上，觀察酵母菌生長狀況。pGBKT7-Lam、pGADT7-T 為陰性對照，pGBKT7-p53、pGADT7-T為陽性對照。

1.2.5 MiERF3 的表達分析 用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，分析芒果在采后貯藏期和不同組織部位中MiERF3 基因的表達。芒果Actin1 基因為內參基因，采用Primer 5 軟件設計引物（表1）。參照ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix（Vazyme，中國）試劑盒進行qRT-PCR。PCR 反應體系10 μL，反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 s，進行40 次循環。每個樣品設置3 次生物學重復，基因相對表達量計算采用2-ΔΔCT法，以0 d 為參照，設其相對表達量為1。數據統計與分析使用WPSOffice 2022 軟件，相對表達量可視化圖形使用GraphPad Prism 8 軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 MiERF3基因的克隆及生物信息學分析

以貴妃芒果陰面果皮cDNA 為模板，用MiERF3-F/R 引物對其編碼區序列進行PCR 擴增，擴增產物與目的基因大小一致（圖1）。MiERF3（XP_044473973.1）基因CDS序列全長為717 bp，編碼238 個氨基酸。MiERF3 蛋白分子式C₁₁₃₀H₁₇₆₃N₃₃₉O₃₅₅S₉，相對分子量26.066 kDa，等電點（pI）為8.62，正、負電荷的氨基酸殘基總數分別為30個和27個，脂肪系數為51.10，不穩定系數為59.70，總平均親水性為?0.655，由此推測MiERF3 蛋白為不穩定的親水蛋白。對MiERF3蛋白進行磷酸化位點預測（圖2A），MiERF3 含有Ser（22個）、Thr（16 個）、Tyr（6 個）共44 個磷酸化位點。MiERF3 蛋白無信號肽（圖2B）、不含跨膜區域（圖2C），在細胞膜內，不屬于分泌型蛋白。采用SOPMA 軟件預測MiERF3 蛋白的二級結構，發現無規則卷曲為150個氨基酸（61.67%）、α-螺旋為49 個氨基酸（20.9%）、延伸鏈為19 個氨基酸（12.18%）β-折疊為10 個氨基酸（4.20%）（圖3A）。利用SWISS-MODEL預測該蛋白的三級結構（圖3B），MiERF3 蛋白含有3 個反平行的β-折疊和1 個α-螺旋結構，符合AP2 結構域典型的結構特征。

2.2 MiERF3 氨基酸同源序列比對及motif分析

ERF蛋白關鍵保守結構域是其發揮功能的基礎。使用NCBI 網站的CD-Search 工具預測MiERF3蛋白功能結構域，結果顯示（圖4A），MiERF3蛋白N端第39位至98位是1個含59 個氨基酸的AP2結構域。

選取與MiERF3同源性較高的9個物種的ERF轉錄因子進行motif 分析，結果顯示，這些motif 結構相似，有4 種motif 在所有蛋白中均含有，與MiERF3 所含的motif 數目和種類一致的有3 種，分別為阿月渾子、楝、克萊門柚（圖4B）。

經氨基酸同源性比對發現，芒果MiERF3 與楝（Melia azedarach， KAJ4725160.1）、克萊門柚（Citrus x clementina， XP_006452450.1）、番木瓜（Carica papaya， XP_021906162.1）、阿月渾子（ Pistacia vera， XP_031286524.1 ） 、雷公藤（Tripterygium wilfordii， XP_038689087.1）、水銀草（Mercurialis annua， XP_050215426.1）氨基酸序列的相似性分別為68.67%、78.22%、66.54%、92.02%、63.93%和59.76%。將上述氨基酸序列通過DANMAN 5.0 軟件進行多重比對，結果顯示（圖4C），MiERF3 與其他物種的ERF 蛋白序列相似，AP2 結構域高度保守，在該結構域中，第14 位氨基酸為丙氨酸（A），而天冬氨酸（D）則位于第19位，表明MiERF3蛋白具有ERF 亞家族的序列特征，屬于AP2/ERF 家族中的ERF 亞族成員。

選取漆樹科植物、模式植物、熱帶植物等不同物種ERF 蛋白構建進化樹，結果顯示（圖4D），芒果MiERF3 與同樣是漆樹科的阿月渾子ERF3-like 聚在一起，親緣關系最近，其次是木薯、甜橙，而熱帶植物番木瓜、菠蘿以及模式植物番茄則與芒果MiERF3 親緣關系較遠。

2.3 MiERF3 亞細胞定位

熒光倒置顯微鏡下觀察到，35S：GFP 對照洋蔥內表皮細胞中的細胞核和細胞壁均檢測到了綠色熒光信號，而35S：MiERF3-GFP 融合蛋白僅在細胞核中出現綠色熒光信號（圖5），這表明芒果MiERF3 蛋白定位于洋蔥細胞細胞核中，符合轉錄因子所具有的核定位特征。

2.4 MiERF3毒性及自激活檢測

將pGBKT7（空載）和pGBKT7-MiERF3 重組質粒轉入Y2H Gold 感受態，酵母菌在SDO 培養基上生長正常且與對照菌斑生長大小基本一致（圖6A），證明MiERF3 蛋白沒有毒性。

將pGBKT7-MiERF3重組質粒、pGADT7 空載質粒轉入Y2H Gold 感受態，菌株可在DDO 培養基上正常生長。進一步觀察發現， 實驗組（ pGBKT7-MiERF3+pGADT7 ） 和陽性對照（ pGBKT7-p53+pGADT7-T ） 在QDO 和QDO/X-α-Gal/AbA 培養基上的菌斑大小基本一致，且在QDO/X-α-Gal/AbA 培養基上的菌斑為藍色，而陰性對照（pGBKT7-lam+pGADT7-T）在QDO 和QDO/X-α-Gal/AbA 培養基上均未生長出菌斑（圖6B）。表明MiERF3 蛋白具有較強轉錄自激活活性。

2.5 MiERF3 在芒果組織中的特異性分析

為了探究MiERF3基因在芒果不同組織部位表達情況，采用實時熒光定量方法對貴妃芒果同一時期的核、葉、花、莖、果肉、陰面果皮和陽面果皮組織樣品進行檢測。結果顯示（圖7A），MiERF3 基因在芒果陽面果皮中表達量最高，其次是陰面果皮和莖，在核、葉、花和果肉等組織中的表達量則極低。

2.6 MiERF3 基因在采后貯藏的表達特征分析

為了探究MiERF3基因在貴妃芒果貯藏過程中的表達情況，選擇采后貯藏0、3、6、9、12 d的陰面果皮組織，提取總RNA 后逆轉錄，再進行qRT-PCR 檢測。結果表明（圖7B），在果實貯藏過程中，MiERF3 基因的表達量整體呈先上升后下降的趨勢。在貯藏初期（0 d），該基因的表達量處于最低水平，隨著果實的成熟，MiERF3 基因的表達量開始上調，并在第6 天達到峰值，此時其表達量是初始時期的4 倍。這一結果表明MiERF3 基因在芒果果實采后貯藏和成熟過程中可能發揮著一定的作用。

3 討論

芒果果皮顏色直接影響著芒果的外觀和品質，與多個色澤相關物質的相對含量密切相關。這些物質的變化決定了芒果的美觀度、營養價值以及保健功效[21， 27]。果實采后保鮮技術手段的選擇對于果皮顏色以及果實風味的影響巨大。由于芒果果實屬于典型的呼吸躍變型，生產上往往選擇在果實八成熟時采收，隨后使用乙烯利進行催熟再銷售。乙烯利處理會促進果實成熟，加速果皮轉色，使果實硬度降低，快速到達其最佳銷售狀態。乙烯是ERF 的命名來源，展現了其與ERF之間的密不可分關系[28]。乙烯通過信號轉導機制，在植物體內誘導ERF 參與生長發育及脅迫防御等生理過程。在擬南芥中，乙烯與位于內質網膜上的乙烯受體結合，導致與受體相關聯的激酶CTR1 失活，進而無法對EIN2 的C 端進行磷酸化[29]。非磷酸化的EIN2 隨后進入細胞核，使得轉錄因子EIN3 得以穩定存在并發揮其作用。隨后，EIN3 激活包括ERF1 在內的多個轉錄因子的轉錄過程，這些轉錄因子調控其他乙烯響應基因，完成整個乙烯信號響應過程[30]。因此，本研究通過課題組前期研究結果選擇MiERF3 作為研究對象，旨在探究其在貴妃芒果中的生理及分子層面的作用，為芒果產業生產實踐提供一定的理論依據和參考。

魏玲等[31]在貴妃芒果中成功鑒定出1 個MiERF2 基因，該基因屬于ERF 亞家族成員。經過分析發現，信號肽和跨膜結構在該基因編碼的蛋白質中并不存在。在親緣關系上，阿月渾子的PvERF109-like 與MiERF2 的關系最為接近。這一發現與本研究的結果存在一定的相似性。本研究發現，芒果中的MiERF3 屬于ERF 亞家族，其編碼的蛋白質具有親水性但不夠穩定，不含有信號肽，也未發現跨膜結構。在MiERF3 蛋白質二級和三級結構預測中，該蛋白質主要由無規則卷曲構成，同時包含α-螺旋、β-折疊和延長鏈等結構元。MiERF3 蛋白質具有典型的AP2 結構域三維結構。通過系統進化分析，發現MiERF3 與同為漆樹科的阿月渾子PvERF3-like 蛋白的親緣關系最為接近。且亞細胞定位和轉錄自激活分析實驗，證明MiERF3 是一個定位于細胞核且具有轉錄自激活活性的轉錄因子。

為了深入研究MiERF3 基因在芒果不同組織部位以及成熟階段中的表達情況，本研究采用實時熒光定量的方法進行了詳細分析。結果顯示，MiERF3 基因主要在芒果的陽面果皮中表達，其表達量顯著高于其他部位。此外，隨著果實的逐漸成熟，MiERF3 基因的表達量也在不斷增加，特別是在采后貯藏的第6 天，該基因的表達量達到了最高峰，但隨后開始呈現下降趨勢。這一發現為進一步了解MiERF3 基因在芒果生長發育過程中的作用提供了重要依據。鄭珍珍等[32]發現，在草莓果實成熟的過程中，FaERF003 的表達水平迅速上升，其變化趨勢與乙烯前體ACC 的含量變化十分相似。易萍等[33]也觀察到MiERF113 基因在果皮和果肉中均有表達，并且隨著果實的逐漸成熟，其表達量也在不斷增加，在果實采后貯藏的第12 天，MiERF113 基因的表達量達到最高，這與本研究結果具有一定的相似性。因此，推測MiERF3 基因具有類似功能，在芒果成熟過程中尤其是果皮轉色方面發揮著重要的作用。然而，MiERF3 基因在乙烯信號轉導通路中的分子機制以及功能驗證還有待探索。