鸚鵡魚惡臭假單胞菌的分離鑒定及致病性研究

摘"要：為有助于防控惡臭假單胞菌引起的魚病，從天津市某養殖場發病血鸚鵡（Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus♂）的中腎、肝臟處提取到一株細菌，并對其進行病原的分離鑒定、人工回歸感染試驗以及藥敏試驗。病灶處分離出的病原菌命名為AC4，經人工回歸感染后證明AC4具有致病性，臨床癥狀與其自然發病癥狀一致，半致死濃度為3×10⁸"CFU/mL。對提取分離出來的致病菌生化鑒定后再進行16S rRNA測序，分離菌革蘭氏染色為陰性桿狀，該株分離菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）。藥敏試驗結果顯示，該菌株對氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松、左氧氟沙星、頭孢吡肟、鏈霉素、多黏菌素B、卡那霉素、阿米卡星等敏感。

關鍵詞：血鸚鵡（Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus♂） ； 惡臭假單胞菌（ Pseudomonas putida）；分離鑒定；藥敏試驗

惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）為假單胞科（Pseudomonadaceae） 假單胞屬（Pseudomonas）革蘭氏陰性需氧桿菌，無芽孢，觸酶陽性，氧化酶陽性，不發酵糖，在麥康凱培養基上生長，廣泛存在于土壤、水、植物以及腐物中，同時也是海淡水魚類腸道菌群的重要成員之一^[1]。惡臭假單胞菌具有腐蝕作用，在土壤及水體中常常可以發現，而且惡臭假單胞菌以感染淡水魚為主，影響水產養殖行業的發展，對多種水產養殖動物有致病性，有較強危害。研究表明，惡臭假單胞菌可引起水生動物感染發病，如引起黑鯛（Sparus macrocephlus）腸胃炎^[2]，歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）爛鰓病^[3]，羅氏沼蝦（Macrobra chiumrosenbergiideman）黃鰓、黑鰓病^[4]，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）皮膚嚴重潰瘍^[5]等，可導致香魚（Plecoglossus altivelis）、黃鰭短須石首魚（Umbrina roncador）^[6]、大黃魚（Larimichthys crocea）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）死亡^[7-8]。當水生動物體表受損或者抵抗力下降時，惡臭假單胞菌會侵染機體，嚴重時會直接導致動物體死亡，已成為威脅水產養殖業發展的重要病原之一，但惡臭假單胞菌感染養殖血鸚鵡（Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus♂）的致病機理尚未見報道。

本試驗從發病血鸚鵡的中腎及肝臟分離到一株致病菌，通過細菌的分離純化、主要生理生化特性測定、16S rRNA基因序列鑒定及回歸感染試驗，確定其為惡臭假單胞菌，同時進行藥物敏感性試驗，以期為鸚鵡魚細菌病的有效防治提供技術支持。

1"材料與方法

1.1"試驗魚

本試驗發病魚由天津市寶坻區某觀賞魚養殖場提供。患病而病死的魚可以觀察到體表大部分鱗片已經脫落，體表有嚴重出血且部分已經潰爛。眼球突出且有腫大現象，眼瞼側也有潰爛狀況，輕輕摁壓病魚眼球，可以發現眼球周圍有發膿現象，胸鰭基部腫脹。對病死魚進行解剖，肉眼可見其肝臟腫大且呈黑紅色，腎臟腫大，脾臟呈粉紅色。腸道內無食物，部分組織器官已經化成血水。

1.2"試驗方法

1.2.1"病原菌的分離與純化"取患病魚的典型癥狀組織器官，以肝臟、腎臟以及中腎作為材料，首先用低溫高速離心機離心后，無菌操作轉接至普通營養肉湯中制成菌懸液，做好標記后在恒溫搖床中28 ℃培養18 h后，稀釋不同濃度后通過無菌操作分別轉接至普通營養瓊脂平板培養基中，做好標記，28 ℃培養24 h后，找最適生長狀態的培養基，選取單菌落通過無菌操作進行進一步劃線純化，三次劃線純化以后獲得純培養的菌株，后通過無菌操作接種于普通營養肉湯中制成菌懸液，恒溫搖床28 ℃培養18 h后，在無菌操作臺里，按照1∶1的比例加入甘油，放入凍存管中，后放入超低溫冰箱（-80 ℃），做好標記保存。編號為：AC4。

1.2.2"人工回歸感染試驗"將健康的鸚鵡魚進行一段時間的養殖，保持水溫在28 ℃左右，每天正常喂食，正常換水，三周后未發現異常狀況，進行人工回歸感染試驗。將60尾健康的血鸚鵡魚平均分成6組，每組10尾魚，分別放入含菌量3×10⁸、3×10^7.5、3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵"CFU/mL的曝氣自來水中進行浸泡法感染，對照組加入等量的生理鹽水，進行人工回歸感染的血鸚鵡全部隔離至養殖箱內，每天觀察感染魚的發病癥狀以及死亡狀況，并做好記錄，期間無需換水喂食，連續觀察5 d，每天勤觀察魚的狀況，一旦發現有癥狀的血鸚鵡魚立即解剖，重新進行病原菌的分離鑒定，以回收檢測到原感染菌的存在，作為分離菌致病性的判定標準。半致死量根據已報道文獻中提到的寇氏法進行計算^[9]。

1.2.3"細菌的形態觀察和生理生化鑒定"在普通營養瓊脂平板上通過無菌操作接種得到的純培養菌株，在恒溫搖床28 ℃培養24 h，后進行菌落大小、形態的觀察。在無菌操作下挑取單個菌落，對細菌進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察染色后其形態特征以及顏色變化。根據查詢的文獻進行各項生理生化特性測定。

1.2.4"16S rRNA基因序列鑒定及發育樹的構建

1.2.4.1"16S rRNA基因序列鑒定"將菌懸液記錄后，送金唯智生物科技有限公司進行測序，通過NCBI中的BLAST檢索系統對測序結果進行比對，將其同屬的細菌16S rRNA選取出來，用MEGA7軟件開始構建系統發育樹。

1.2.4.2"16S rRNA基因序列系統發育樹的構建"將所測得的序列在NCBI中的BLAST上的檢索系統對測序結果進行比對，選取序列保存為text格式，運行Bioedit，使用其中的CLUSTAL W進行比對。序列進行反向互補以后，再運用MEGA7建樹，將前面的文件轉化格式為mega格式，進行激活后再進行建樹。

1.2.5"病原菌藥物敏感性測定"取超低溫冰箱中保存的菌懸液AC4，無菌操作下接種于普通營養肉湯管， 28 ℃恒溫培養，18 h后將其接種在五個普通營養瓊脂平板上，將鑷子洗凈并消毒后，用鑷子把不同的藥敏片輕輕放置在平板表面，輕輕壓緊，將普通營養瓊脂平板封口后放入培養箱中，在28 ℃恒溫下培養24 h后，肉眼觀察后，用直尺測量抑菌圈的直徑并記錄結果。根據抑菌圈直徑的大小可以判斷病原菌對于藥物的敏感程度。

2"結果

2.1"病原菌菌落形態與特征

在患病魚的中腎、肝臟中提取分離到的菌株，通過普通營養瓊脂平板的培養，28 ℃恒溫培養24 h后，可以觀察到AC4培養菌板上，AC4菌落生長旺盛，其表面光滑呈正圓形狀，菌落偏乳白色且不透明，菌落表面微微濕潤，菌落邊緣很規整，菌落中央有凸起狀態。

進行革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察發現呈紅色，如圖1（見封二），可以判斷AC4是革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下，AC4以短桿棒狀呈現，細菌呈分散狀，且單個細菌處于運動狀態。

2.2"病原分離菌的生理生化特性

AC4菌株的主要生理生化特性見表1。由表1可知，該菌株呈陽性的項目有：精氨酸雙水解酶、接觸酶、檸檬酸鹽、氧化酶以及硝酸鹽還原等等。該菌株呈陰性的項目有：V-P試驗、葡萄糖產氣、脲酶、硫化氫、鳥氨酸脫羧酶、甲基紅、乳糖、麥芽糖、明膠、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、蔗糖以及肌醇等等。根據以上的生理生化分析，將最后所得結果和形態學特征所結合結果證明該分離菌AC4的生理特性和假單胞菌的生理特性基本一致。

2.3"構建系統發育樹

構建系統發育樹前，先進行基因序列對比，通過MEGA7軟件構建完成的系統發育樹如圖2所示（見封二）。

2.4"人工感染試驗結果

人工回歸感染試驗，給試驗組的血鸚鵡進行人工感染，對照組潑灑生理鹽水，浸泡AC4菌組的魚可以發現4～5 h后出現游動緩慢、反應遲鈍的情形，11～12 h后有部分魚感染死亡，48 h后可以發現進行人工感染的魚全部死亡，具體情況見表2。對死魚進行解剖可以觀察到，鰓發紅，體表大部分鱗片已經脫落，體表有嚴重出血且部分已經潰爛；眼球突出且有腫大現象，眼瞼側也有潰爛狀況，輕輕摁壓病魚眼球，可以發現眼球周圍有發膿現象；胸鰭基部腫脹；肉眼可見其肝臟腫大且呈黑紅色，腎臟腫大，脾臟呈粉紅色；腸道內無食物，部分組織器官已經化成血水?？梢园l現癥狀與AC4原菌株相同，將解剖得到的患病魚的中腎、脾臟進行細菌分離、純化后送去鑒定，可以證實性狀也相同。對照組的血鸚鵡都很健康，沒有任何癥狀，所以可以證明AC4菌株是血鸚鵡的致病菌，而且AC4菌株的致病作用很強。

2.5"試驗菌種分類

根據AC4分離菌形態特征、致病性狀、生理生化特性，和進行鑒定所做的16S rRNA結果可以確定，AC4分離菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。

2.6"藥敏試驗

由藥敏試驗中各藥紙片所形成的抑菌圈大?。ū?）可知，AC4菌對慶大霉素、阿卡米星、卡那霉素、環丙沙星、頭孢吡肟、多黏菌素B、左氧氟沙星等7種抗生素重度敏感；對頭孢噻肟、氯霉素、四環素、鏈霉素、氨曲南等5種抗生素中度敏感；對呋喃妥因、青霉素、哌拉西林、亞胺培南、氨芐西林、紅霉素、頭孢曲松、頭孢他啶等8種抗生素耐藥。

3"討論

假單胞菌屬細菌廣泛分布于海水、淡水、土壤中，部分種類是水產養殖中常見致病菌，其中惡臭假單胞菌在自然界中屬正常菌群，具備較強分解能力，常被篩選為各種降解功能菌。惡臭假單胞菌也是一種人-禽-魚共患的病原菌^[10]，能夠引起新生兒發病^[11]并且導致人食物中毒^[12]。分離菌株AC4的16S rRNA PCR鑒定結果顯示，AC4分離菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。根據白明煥等^[13]提出的VP反應陰性，硝酸鹽還原反應、氧化酶反應陽性，不產生H₂S， 能利用精氨酸，不能利用賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸等惡臭假單胞菌生化鑒定結果，本試驗中分離獲得AC4菌株具備上述特征。

在回歸感染試驗中，浸泡惡臭假單胞菌AC4菌懸液的健康鸚鵡魚48 h已全部死亡。白明煥等^[13]研究表明，用分離的惡臭假單胞菌回歸感染長薄鰍，在第3天開始出現死亡，14 d 后死亡率最高為 85%。方振華等^[14]將惡臭假單胞菌菌懸液人工感染中華草龜后，6 d 部分個體死亡，20 d 后人工感染的中華草龜全部死亡。由此可判斷出，健康鸚鵡魚感染惡臭假單胞菌后的病程較快，可導致較大規模死亡，應該對此予以關注。

楊敏等^[15]研究顯示，從患病養殖大鯢內分離的惡臭假單胞菌對頭孢拉定、新霉素、多黏菌素、頭孢曲松敏感，對氨芐西林、多西環素、慶大霉素等耐藥。段亞佼等^[16]發現，從潰爛癥狀的雜交鲇體內分離得到的惡臭假單胞菌，對左氧氟沙星、氟哌酸、多西環素等藥物敏感，對青霉素、頭孢西丁、磺胺甲基異惡唑、阿奇霉素、氨芐西林、氟苯尼考以及福平等藥物產生了耐藥性。陳詩宇等^[17]的實驗中，惡臭假單胞菌對頭孢曲松處于中度敏感狀態。方振華等^[14]的研究中，卡那霉素對惡臭假單胞菌的抑菌圈為0 mm，說明有耐藥性作用。本試驗中AC4菌對慶大霉素、阿卡米星、卡那霉素、環丙沙星、頭孢吡肟、多黏菌素B、左氧氟沙星等7種藥物敏感，對呋喃妥因、青霉素、哌拉西林、亞胺培南、氨芐西林、紅霉素、頭孢曲松、頭孢他啶等藥物產生了耐藥性。以上說明，細菌的抗藥性在不同地區和不同宿主之間存在顯著的差異。假單胞菌屬增長速度極快，能快速適應不同的環境條件，抗生素抗性基因產生迅速。由于在目前中國水產養殖中，使用抗生素是主要的防病治病策略，故其不利影響可能持續擴大，使治療更加困難。因此，構建健康養殖環境，開發針對性疫苗，或環境友好的中藥制劑等是防控該病的理想策略。

參考文獻：

[1]

周志剛，石鵬君，姚斌，等.海水魚消化道菌群結構研究進展[J].海洋水產研究，2007，28（5）：123 -131.

[2] 毛芝娟，王美珍，陳吉剛，等.黑鯛腸炎病原惡臭假單胞菌的分離和鑒定[J].漁業科學進展，2010，31（3）：23-28.

[3] 樊海平.惡臭假單胞菌引起的歐洲鰻鱺爛鰓病[J].水產學報，2001，25（2）：147-150.

[4] 陶保華，石和榮，黃俊文，等.假單胞菌引起羅氏沼蝦黃鰓，黑鰓病的研究[J].中山大學學報：自然科學版，2000，39（1）：255-259.

[5] ALTINOK I，KAYIS S，CAPKIN E.Pseudomonas putida infection in rainbow trout[J].Aquaculture，2006，261（3）：850-855.

[6] WAKABAYASHI H，SAWADA K，NINOMIYA K，et al.Bacterial hemorrhagic ascites of ayu caused by Pseudomonas sp.[J]. Fish Pathology，1996，31（4）：239-240.

[7] 任燕，陳獻稿，劉鵬威，等.大黃魚假單胞菌病病原的分離鑒定及藥物敏感試驗[J].廣東農業科學，2012，39（18）：151-154.

[8] 趙曉偉，許瀚之，黃華，等.大菱鲆源惡臭假單胞菌的分離鑒定及全基因組分析[J/OL].水產科學，2024，1-10[2024-11-09].https：//doi.org/10.16378/j.cnki.1003-1111.24010.

[9] 萬安，張曉可，于道平，等.本科半致死量實驗的模擬教學方法[J].安慶師范大學學報（自然科學版），2017，23 （3）：116-119.

[10] 楊圓圓，楊移斌，曹海鵬，等.雜交鱘源惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥敏特性研究[J].浙江農業學報，2017，29（12）：1978-1985.

[11] 魯玉姣，高喜容，莊嚴，等.29例新生兒惡臭假單胞菌感染臨床特點分析[J].中國中西醫結合兒科學，2023，15（3）：233-236.

[12] 張若煜，羅欣，朱立賢，等.牛肉源假單胞菌的分離鑒定及菌株致腐能力差異比較[J].現代食品科技，2022，38（3）：115-124.

[13] 白明煥，耿毅，鄧龍君，等.長薄鰍惡臭假單胞菌的分離鑒定及其感染的病理損傷[J].浙江農業學報，2019，31（2）：207-215.

[14] 方振華，代小梅，丁利，等.中華草龜惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥物敏感性分析[J].中國畜牧獸醫，2019，46 （10）：3115-3123.

[15] 楊敏，吳青，沙莎.養殖大鯢惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥物敏感性分析[J].中國獸醫雜志，2018，54（1）：87-90.

[16] 段亞佼，黃小麗，詹瑰然，等.雜交鲇惡臭假單胞菌的分離鑒定及其病理損傷研究[J].水生生物學報，2017，41（2）：371- 378．

[17] 陳詩宇，王利.鯽魚惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥敏分析[J].水產養殖，2019，40（10）：25-28.

Separation identification and pathogenicity study of Pseudomonas putida from blood parrotfish

WANG Baofeng¹，YI Wei¹，YU Jie¹，YOU Hongzheng²

（1.Tianjin Agriculture Eco-Environmental Monitoring and Agri-product Quality Testing Center，Tianjin 300190，China；2.Tianjin Fishery Research Institute，Tianjin 300202，China）

Abstract：To help preventing disease caused by the bacterium Pseudomonas putida， a strain of bacterium was isolated from the kidney and liver of the blood parrotfish （Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus♂） in a farm in Tianjin， and the pathogen isolation and identification，artificial regression infection experiment and drug sensitivity test were conducted. The pathogenic bacteria were isolated from the lesion and named AC4.After artificial regression of infection，AC4 was proved to be pathogenic. The clinical symptoms were consistent with its natural symptoms， and the semi-lethal concentration was 3×10⁸"CFU/mL. After biochemical identification of the isolated pathogenic bacteria，16S rRNA sequencing， the Gram staining of the bacteria showed Gram-negative rod-shaped bacteria， and the isolated bacteria belongs to the genus Pseudomonas. "Susceptibility test showed that the strain was highly sensitive to aztreonam，ceftazidime，ceftriaxone，levofloxacin，cefepime，streptomycin，polymyxin B，kanamycin，and amikacin.

Key words：Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus♂;Pseudomonas putida; separation identification;drug sensitive test

（收稿日期：2024-10-15）