利用胚挽救技術(shù)創(chuàng)制無(wú)核葡萄新材料

摘" " 要：【目的】以無(wú)核葡萄為母本進(jìn)行無(wú)核葡萄新材料創(chuàng)制，探明火焰無(wú)核、克倫生、紅寶石無(wú)核等無(wú)核葡萄品種為母本胚培養(yǎng)的幼果最佳采樣時(shí)間，并通過(guò)分子標(biāo)記輔助育種對(duì)雜種植株的無(wú)核性狀進(jìn)行早期鑒定，篩選雜交F1代無(wú)核材料，提高無(wú)核葡萄育種效率。【方法】通過(guò)胚挽救技術(shù)創(chuàng)制無(wú)核葡萄新材料，并利用無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11、GLSP1-569、SCF27-2000、SCC8-1018等對(duì)雜種植株無(wú)核性狀進(jìn)行鑒定。【結(jié)果】共獲得雜種植株1059株，其中以紅寶石無(wú)核為母本進(jìn)行胚挽救的成苗率在12.48%以上，明顯高于其他品種為母本的組合；火焰無(wú)核、克倫生、紅寶石無(wú)核為雜交母本時(shí)，分別在第一次授粉后38、48、55 d采集幼果的胚挽救效率最高；利用無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11、GLSP1-569、SCF27-2000、SCC8-1018對(duì)雜種植株無(wú)核性狀進(jìn)行鑒定，所有雜交組合雜種后代的無(wú)核率均在58%以上。【結(jié)論】紅寶石無(wú)核更適合作為胚挽救育種的母本材料，火焰無(wú)核、克倫生、紅寶石無(wú)核為雜交母本時(shí)，分別在第一次授粉后38、48、55 d進(jìn)行幼果采集效果較好，無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11、GLSP1-569、SCF27-2000、SCC8-1018可以準(zhǔn)確對(duì)雜種植株的無(wú)核性狀進(jìn)行鑒定，縮短無(wú)核葡萄育種時(shí)間。

關(guān)鍵詞：無(wú)核葡萄；胚挽救；分子標(biāo)記；輔助育種；新種質(zhì)

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2024）09-1705-11

Creation of new seedless grape materials via embryo rescue

WANG Dong， YUE Miaoqi， BAO Min， WANG Qili， WANG Xiping*

（College of Horticulture， Northwest A amp; F University/State Key Laboratory for Crop Stress Resistance and High-Efficiency Production/Key Laboratory of Northwest Horticultural Crop Biology and Germplasm Creation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： 【Objective】The experiment aimed to explore the optimum sampling time of the young berries for embryo rescue and to verify the feasibility of identification of seedless traits in hybrid offsprings using molecular markers in grape. 【Methods】 Flame Seedless， Zicui Seedless， Crimson Seedless， Ruby Seedless were selected as female parents for hybridization， and the sampling time gradients for young fruits were set for the female parent cultivars. The sampling times for young berries of Flame Seedless were 36 d， 38 d， and 40 d after the first pollination， the sampling times for young berries of Crimson Seedless were 44 d， 46 d， 48 d， and 50 d after the first pollination， and the sampling times for young berries of Ruby Seedless were 53 d， 55 d， and 57 d after the first pollination. The young fruits were taken to the laboratory for sterilization. After sterilization， the fruits were placed in a super clean environment. The seeds were taken out from the young fruits and cultured in MM3 medium for 8-12 weeks in the dark. After the dark cultivation， the seeds were placed in an ultraclean workbench. Under a dissecting microscope， the embryos were removed with a surgical knife and placed in WPM medium. They were cultured at room temperature with light for 40-60 days. The embryo development rate and embryo seedling rate of different cultivars were recorded. The seedless trait of the hybrid offsprings was identified using the nuclear free molecular marker p3-VvAGL11， GLSP1-569， SCF27-2000， SCC8-1018. 【Results】 The embryo development rates of the three crossing combinations of Ruby Seedless as the female parent were significantly higher than those of the other combinations. Moreover， the embryo seedling rates of these three combinations were significantly higher than those of the other combinations. A sampling time gradient was set for crossing combinations of Flame Seedless， Crimson Seedless， and Ruby Seedless as female parents. It was found that the two combinations of Flame Seedless × Jumeigui and Flame Seedless × Shine Muscat had embryo development rates of 10.74% and 8.25%， embryo seedling rates of 4.03% and 3.10%， respectively， when the berries were collected on 38th d after the first pollination， higher than those collected on 36th d and 40th d. The crossing combination of Crimson Seedless × Shine Muscat had embryo development rates of 7.69% and seedling rates of 4.07%， respectively， when the berries were collected on 48th days after the first pollination， higher than those collected on 44th d， 46th d， and 50th d. The three combinations of Ruby Seedless × Hutai No. 8， Ruby Seedless × Zuijinxiang， and Ruby Seedless × Jingxiangyu had embryo development rates of 28.25%， 24.78%， and 33.88%， respectively， when the berries were collected on 55th d after the first pollination and the embryo seedling rates were 17.14%， 18.42%， and 20.09%， respectively， higher than those collected on 53th d and 57th d. The molecular marker p3-VvAGL11， GLSP1-569， SCF27-2000， SCC8-1018， were successfully used for identification of seedless trait. The seedless rates of hybrid offsprings of Ruby Seedless × Zuijinxiang， Ruby Seedless × Jingxiangyu and Ruby Seedless × Hutai No. 8 were 63.79%， 59.17% and 62.00%， respectively. The seedless rates of the hybrid offsprings of Crimson Seedless × Shine Muscat， Flame Seedless × Jumeigui， Flame Seedless × Shine Muscat， Zicui Seedless × Zuijinxiang were 72.73%， 58.33%， 100.00%， and 100.00%， respectively. 【Conclusion】 Ruby Seedless was suitable as a maternal material for seedless breeding via embryo rescue in grape for higher seedless rate. The optimal sampling times for the young fruits of Flame Seedless， Crimson Seedless and Ruby Seedless were 38 days， 48 days and 55 days after the first pollination. Preselection of seedless trait of the grape hybrid offspring could be achieved using the molecular marker p3-VvAGL11， GLSP1-569， SCF27-2000， SCC8-1018.

Key words： Seedless grape; Embryo rescue; Molecular markers; Assisted breeding; New germplasm

近年來(lái)，隨著葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)的不斷成熟和消費(fèi)市場(chǎng)的多樣化，無(wú)核葡萄（Vitis vinifera L.）的需求量大幅增加[1]，但無(wú)核葡萄品種較少，特別是性狀優(yōu)良的無(wú)核葡萄品種較少，多數(shù)無(wú)核品種存在著果粒較小、抗性差等問(wèn)題[2]，急需借助育種手段培育新的無(wú)核葡萄品種，滿足市場(chǎng)對(duì)無(wú)核葡萄的需求。傳統(tǒng)的無(wú)核葡萄育種主要以有核葡萄作母本與無(wú)核葡萄父本雜交，雜交后代僅有0%～5.9%的無(wú)核率，選育一個(gè)無(wú)核葡萄新品種需要15～20 a（年），育種效率較低[3]。采用胚挽救技術(shù)可對(duì)以無(wú)核葡萄作母本進(jìn)行雜交獲得的合子胚在其敗育前進(jìn)行人工離體培養(yǎng)，然后促使幼胚發(fā)育一定時(shí)間后萌發(fā)成苗，隨著胚挽救技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于中國(guó)無(wú)核葡萄育種中，成為無(wú)核葡萄育種的重要手段[4-5]。

影響葡萄胚挽救成苗的因素主要包含親本基因型、取樣時(shí)間、胚離體培養(yǎng)時(shí)間、胚珠處理方法、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基添加物、培養(yǎng)條件等[6]，其中親本基因型，特別是母本基因型對(duì)無(wú)核葡萄胚挽救成苗率有較大的影響，選擇合適的母本，有助于提高無(wú)核葡萄胚挽救成苗率，Ula?等[7]和Liu等[8]通過(guò)選取多種母本進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)克倫生適合作為胚挽救母本，劉可可等[9]研究認(rèn)為火焰無(wú)核和紅寶石無(wú)核的胚挽救成苗率較高，適合作為母本。此外，雜交幼果的取樣時(shí)間對(duì)胚挽救成苗率也具有重要影響，史文靜等[10]研究認(rèn)為，火焰無(wú)核和昆香無(wú)核的最佳采樣時(shí)間為首次授粉后45 d和51 d，郝燕等[11]認(rèn)為火焰無(wú)核為母本時(shí)最佳采樣時(shí)間為首次授粉后40 d，因此通過(guò)試驗(yàn)篩選出適合不同無(wú)核葡萄品種作為母本時(shí)的最佳幼果采樣時(shí)間也具有十分重要的意義。利用分子標(biāo)記技術(shù)，在植物苗期即可對(duì)其性狀進(jìn)行鑒定，從而縮短育種周期[12]，常用的葡萄無(wú)核分子標(biāo)記有p3-VvAGL11、5U-VviAGL11、SCF27-2000、GSLP1-569、SCC8-1018以及VMCF7F2-198等[13-17]，p3-VvAGL11和SCF27-2000檢測(cè)無(wú)核性狀的準(zhǔn)確率較高[18]。筆者主要對(duì)影響無(wú)核葡萄胚挽救成苗率的母本基因型以及取樣時(shí)間開(kāi)展研究，輔以p3-VvAGL11、GLSP1-569、SCF27-2000、SCC8-1018等無(wú)核分子標(biāo)記鑒定，以期對(duì)提高無(wú)核葡萄新品種培育的效率和創(chuàng)制無(wú)核葡萄新種質(zhì)材料提供一定的參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以歐亞種葡萄（V. vinifera）火焰無(wú)核（Flame Seedless）、紫脆無(wú)核（Zicui Seedless）、森田尼無(wú)核（Centennial Seedless）、紅寶石無(wú)核（Ruby Seedless）為母本；以歐亞種（V. vinifera） 京香玉（Jing-xiangyu），歐美雜交種葡萄（V. vinifera × V. labrusca）戶太8號(hào)（Hutai No .8）、陽(yáng)光玫瑰（Shine Muscat）、醉金香（Zuijinxiang）等為父本，共9個(gè)雜交組合（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間雜交 去雄：在花穗有5～10個(gè)花蕾開(kāi)放時(shí)，將已開(kāi)放花朵去除干凈，用鑷子或指尖掐去花帽，露出雄蕊，然后用鑷子或指尖掐去花藥，只保留柱頭，在操作時(shí)要注意不要傷及柱頭，以免影響授粉效果。在雄蕊去除干凈以后，立即向花穗噴灑純水進(jìn)行保濕并套袋，然后用鉛筆將去雄時(shí)間用吊牌做好標(biāo)記，懸掛于花穗的枝條上。

人工授粉：在去雄結(jié)束后2～3 d授粉，觀察柱頭上的黏液情況，柱頭上出現(xiàn)小水滴式黏液時(shí)，為授粉最佳狀態(tài)，按照每30穗花穗使用40 mL花粉，將花粉倒入測(cè)序袋中，用測(cè)序袋將花穗套住，袋內(nèi)充滿空氣后扎緊袋口，輕輕拍擊測(cè)序袋底部使花粉飛起，均勻散落在柱頭上。授粉后，重新將紙袋套好，在吊牌上標(biāo)記好授粉時(shí)間以及花粉品種，在首次授粉結(jié)束后的第2天上午重復(fù)進(jìn)行一次授粉，確保授粉充分，提高授粉效果。

1.2.2 設(shè)定幼果采樣時(shí)間 幼果采樣時(shí)間，按照首次授粉后天數(shù)來(lái)計(jì)算，在本試驗(yàn)中，火焰無(wú)核為母本的雜交組合按照36、38、40 d時(shí)間梯度采樣；以克倫生為母本的雜交組合按照44、46、48、50 d時(shí)間梯度采樣；以紅寶石無(wú)核為母本的雜交組合按照53、55、57 d時(shí)間梯度采樣，其余雜交組合采樣時(shí)間參考實(shí)驗(yàn)室以往采樣時(shí)期，用剪刀連同果柄一起將果實(shí)剪下，放置于塑料袋中，然后將其放置于冰盒之中帶回實(shí)驗(yàn)室，放置于4 ℃冰箱中待用。

1.2.3 胚珠離體培養(yǎng) 將葡萄果粒放置于網(wǎng)兜中用流水沖洗不少于4 h，沖洗完畢后，將果粒放置于螺口瓶中并在超凈工作臺(tái)中消毒。消毒具體步驟如下：使用75%乙醇沖洗果粒30 s，倒掉廢液，用無(wú)菌水沖洗果粒2～3次，將無(wú)菌水倒掉；再用1%的次氯酸鈉消毒20 min，無(wú)菌水沖洗2～3次，倒掉廢液。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將滅菌的幼果胚珠剝離，并將剝離好的胚珠整齊地?cái)[放在MM3胚發(fā)育培養(yǎng)基上，室溫下遮光培養(yǎng)8～12周。MM3胚發(fā)育培養(yǎng)基的成分為：MM3+0.5 g·L-1水解酪蛋白+60 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠+1.5 g·L-1活性炭+0.1 g·L-1肌醇。

1.2.4 胚萌發(fā)培養(yǎng) 胚發(fā)育培養(yǎng)結(jié)束后，將胚珠放置于解剖鏡下，對(duì)胚珠尖端進(jìn)行縱剖，在解剖鏡下可以看到明亮的乳白色胚，用手術(shù)刀將胚挑出，放置于WPM胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，室溫光照培養(yǎng)40～60 d。WPM胚萌發(fā)培養(yǎng)基的成分為：WPM+3 g·L-1 植物凝膠+0.2 mg·L-1 6-BA+0.1 g·L-1肌醇+1.5 g·L-1活性炭+20 g·L-1蔗糖。胚挽救具體流程見(jiàn)圖1。

1.2.5 雜種后代無(wú)核性狀分子標(biāo)記檢測(cè) 利用CTAB法提取葡萄雜交親本及其子代的葉片DNA，利用無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11、GLSP1-569、SCF27-2000、SCC8-1018進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)。引物序列及分子標(biāo)記長(zhǎng)度見(jiàn)表2。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

胚發(fā)育率/%=發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)×100；成苗率/%=正常苗數(shù)/接種胚珠數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)核葡萄胚挽救結(jié)果

本試驗(yàn)共配置雜交組合9個(gè)，獲得雜交果粒4060個(gè)，接種胚珠9404個(gè)，可正常發(fā)育胚2092個(gè)，平均胚發(fā)育率為22.25%，成苗1059株，平均胚成苗率11.26%（表3）。其中，紅寶石無(wú)核×京香玉組合胚發(fā)育率和成苗率最高，分別為30.23%和15.46%。在以火焰無(wú)核作為母本的3個(gè)組合中，以巨玫瑰作為父本，成苗率最高，為2.78%。在以紅寶石無(wú)核為母本的3個(gè)組合中，以京香玉作為父本，成苗率最高，為15.46%。在以巨玫瑰為父本的2個(gè)組合中，以火焰無(wú)核作為母本成苗率最高，為2.78%。在以陽(yáng)光玫瑰為父本的兩個(gè)組合中，以克倫生為母本成苗率最高，為2.60%。在以戶太8號(hào)為父本的兩個(gè)組合中，以紅寶石無(wú)核為母本成苗率最高，為12.48%。在以醉金香為父本的兩個(gè)組合中，以紅寶石無(wú)核為母本成苗率最高，為13.59%。

2.2 幼果取樣時(shí)間對(duì)葡萄胚挽救效率的影響

對(duì)火焰無(wú)核×巨玫瑰和火焰無(wú)核×陽(yáng)光玫瑰兩個(gè)雜交組合幼果取樣時(shí)間均設(shè)置初次授粉后36、38、40 d三個(gè)時(shí)間梯度，兩個(gè)組合均在初次授粉后38 d時(shí)胚發(fā)育率和胚成苗率最高，胚發(fā)育率分別為10.74%和8.25%，胚成苗率分別為4.03%和3.10%。對(duì)克倫生×陽(yáng)光玫瑰雜交組合幼果取樣時(shí)間設(shè)置44、46、48、50 d四個(gè)幼果取樣時(shí)間梯度，該組合在初次授粉后48 d時(shí)胚發(fā)育率和成苗率最高，分別為7.69%和4.07%。對(duì)紅寶石無(wú)核×戶太8號(hào)、紅寶石無(wú)核×醉金香、紅寶石無(wú)核×京香玉三個(gè)雜交組合幼果取樣時(shí)間均設(shè)置初次授粉后53、55、57 d三個(gè)時(shí)間梯度，3個(gè)雜交組合均在初次授粉后55 d時(shí)胚發(fā)育率和胚成苗率最高，胚發(fā)育率分別為28.25%、24.78%、33.88%，胚成苗率分別為17.14%、18.42%、20.09%（表4）。

2.3 雜種后代無(wú)核性狀分子標(biāo)記鑒定

2.3.1 利用四種無(wú)核分子標(biāo)記對(duì)親本進(jìn)行檢測(cè) 分別利用葡萄無(wú)核探針GSLP1-569及無(wú)核分子標(biāo)記SCF27-2000、SCC8-1018、p3-VvAGL11對(duì)10個(gè)親本進(jìn)行檢測(cè)（圖2）。利用GSLP1-569可以檢測(cè)到火焰無(wú)核和陽(yáng)光玫瑰兩個(gè)親本在569 bp處擴(kuò)增出特異性條帶（圖2-A），因此GSLP1-569可以用來(lái)對(duì)火焰無(wú)核×巨玫瑰1個(gè)雜交組合的后代進(jìn)行無(wú)核早期鑒定。

利用SCF27-2000可以檢測(cè)到火焰無(wú)核、紫脆無(wú)核、紅寶石無(wú)核、克倫生、戶太8號(hào)、醉金香、京香玉、森田尼無(wú)核等8個(gè)親本在2000 bp處擴(kuò)增出特異性條帶（圖2-B），因此SCF27-2000可以用來(lái)對(duì)火焰無(wú)核×巨玫瑰、火焰無(wú)核×陽(yáng)光玫瑰、克倫生×陽(yáng)光玫瑰3個(gè)雜交組合的后代進(jìn)行無(wú)核早期鑒定；利用SCC8-1018酶切后可以檢測(cè)到火焰無(wú)核、紫脆無(wú)核、紅寶石無(wú)核、克倫生、森田尼無(wú)核等5個(gè)親本在1000 bp附近處擴(kuò)增出特異性條帶，戶太8號(hào)、醉金香、京香玉、巨玫瑰只在750 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，陽(yáng)光玫瑰在1000 bp附近和750 bp處都存在特異性條帶（圖2-C）。因而SCC8-1018可以對(duì)火焰無(wú)核×巨玫瑰、紫脆無(wú)核×醉金香、紅寶石無(wú)核×戶太8號(hào)、紅寶石無(wú)核×醉金香、紅寶石無(wú)核×京香玉5個(gè)雜交組合后代進(jìn)行無(wú)核早期鑒定；利用p3-VvAGL11可以檢測(cè)到火焰無(wú)核、紫脆無(wú)核、紅寶石無(wú)核、克倫生、森田尼無(wú)核等5個(gè)親本在198 bp處擴(kuò)增出特異性條帶（圖2-D），因此p3-VvAGL11可以對(duì)火焰無(wú)核×巨玫瑰、火焰無(wú)核×陽(yáng)光玫瑰、紫脆無(wú)核×醉金香、克倫生×陽(yáng)光玫瑰、紅寶石無(wú)核×戶太8號(hào)、紅寶石無(wú)核×醉金香、紅寶石無(wú)核×京香玉7個(gè)雜交組合的后代進(jìn)行無(wú)核早期鑒定。

2.3.2 無(wú)核分子標(biāo)記對(duì)雜交F1代進(jìn)行檢測(cè) 利用無(wú)核探針GSLP1-569，無(wú)核分子標(biāo)記SCF27-2000、SCC8-1018、p3-VvAGL11對(duì)火焰無(wú)核×巨玫瑰的12株雜交后代進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)，其中GSLP1-569檢測(cè)出8株雜種后代在569 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，SCF27-2000檢測(cè)出10株雜種后代在2000 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，SCC8-1018檢測(cè)出9株雜種后代在1000 bp附近處擴(kuò)增出特異性條帶，p3-VvAGL11檢測(cè)出11株雜種后代在198 bp處擴(kuò)增出特異性條，使用4種無(wú)核分子標(biāo)記都可以擴(kuò)增出特異性條帶的雜種植株有7株，該雜交組合后代的無(wú)核率為58.33%（表5）；SCF27-2000、p3-VvAGL11對(duì)火焰無(wú)核×陽(yáng)光玫瑰的4株雜交后代進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)，其中 SCF27-2000檢測(cè)出4株雜種后代在198 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，p3-VvAGL11檢測(cè)出4株雜種后代植株在2000 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，2種無(wú)核分子標(biāo)記對(duì)該雜交組合后代的無(wú)核率為100.00%；SCC8-1018、p3-VvAGL11對(duì)紫脆無(wú)核×醉金香的2株雜交后代進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)，其中SCC8-1018檢測(cè)出2株雜種后代在1000 bp附近處擴(kuò)增出特異性條帶，無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11檢測(cè)出2株雜種后代在198 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，以上2種無(wú)核分子標(biāo)記都可以擴(kuò)增出特異性條帶的雜種植株有2株，該雜交組合后代的無(wú)核率為100.00%；p3-VvAGL11、SCF27-2000對(duì)克倫生×陽(yáng)光玫瑰的22株雜交后代進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)，其中p3-VvAGL11檢測(cè)出18株雜種后代在198 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，SCF27-2000檢測(cè)出17株雜種后代在2000 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，使用2種無(wú)核分子標(biāo)記都可以擴(kuò)增出特異性條帶的雜種植株有16 株，該雜交組合后代的無(wú)核率為72.73%。

利用SCC8-1018、p3-VvAGL11對(duì)紅寶石無(wú)核×戶太8號(hào)的202株雜交后代中隨機(jī)抽取50株進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)，其中SCC8-1018檢測(cè)出34株雜種后代在1000 bp附近處擴(kuò)增出無(wú)核特異性條帶，無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11檢測(cè)出38株雜種后代在198 bp處擴(kuò)增出無(wú)核特異性條帶，使用2種無(wú)核分子標(biāo)記都可以擴(kuò)增出特異性條帶的雜種植株有31株，該雜交組合后代的無(wú)核率為62.00%；SCC8-1018、p3-VvAGL11對(duì)紅寶石無(wú)核×醉金香的230株雜交后代中隨機(jī)抽取58株進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)，其中SCC8-1018檢測(cè)出41株雜種后代在1000 bp附近處擴(kuò)增出無(wú)核特異性條帶，p3-VvAGL11檢測(cè)出41株雜種后代在198 bp處擴(kuò)增出無(wú)核特異性條帶，使用2種無(wú)核分子標(biāo)記都可以擴(kuò)增出特異性條帶的雜種植株有37株，該雜交組合后代的無(wú)核率為63.79%；SCC8-1018、p3-VvAGL11對(duì)紅寶石無(wú)核×京香玉的587株雜交后代中隨機(jī)抽取120株進(jìn)行無(wú)核性狀檢測(cè)，其中SCC8-1018檢測(cè)出91株雜種后代在1000 bp附近處擴(kuò)增出無(wú)核特異性條帶，p3-VvAGL11檢測(cè)出94株雜種后代在198 bp處擴(kuò)增出無(wú)核特異性條帶，2種分子標(biāo)記都可以擴(kuò)增出無(wú)核特異性條帶的雜種后代有71株，該雜交組合后代的無(wú)核率為59.17%。

3 討 論

通過(guò)無(wú)核葡萄胚挽救技術(shù)，打破了假單性結(jié)實(shí)型葡萄在作為母本進(jìn)行無(wú)核育種時(shí)難以獲得種子的局限[19-21]，使得以無(wú)核葡萄作為母本進(jìn)行雜交育種成為了可能[22]，極大地提高了無(wú)核葡萄育種效率，筆者以無(wú)核葡萄為母本通過(guò)胚挽救技術(shù)成功獲得了1059株雜種植株。

Notsuka等[23]通過(guò)試驗(yàn)認(rèn)為，在影響胚挽救效率中，母本的選擇起到了至關(guān)重要的作用；Ji等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)，以紅寶石無(wú)核作母本，成苗率高達(dá)23.00%，明顯高于作為母本的粉紅無(wú)核等其他品種；Ula?等[7]和Liu等[8]通過(guò)選取多種母本對(duì)比，發(fā)現(xiàn)克倫生適合作為胚挽救母本；賈姍姍[25]等試驗(yàn)表明，紅寶石無(wú)核適合作母本，胚挽救成苗率較高，而克倫生作母本時(shí)，胚挽救成苗率較低；劉可可等[9]研究表明，火焰無(wú)核和紅寶石無(wú)核的胚挽救成苗率較高，適合作母本。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)父本同為戶太8號(hào)時(shí)，母本為紅寶石無(wú)核的成苗率明顯高于火焰無(wú)核，當(dāng)父本同為醉金香時(shí)，母本為紅寶石無(wú)核的成苗率明顯高于紫脆無(wú)核，因此紅寶石無(wú)核相比火焰無(wú)核和醉金香更適合作胚挽救育種的母本，這與前人研究結(jié)果一致[24-26]；以克倫生為母本時(shí)，成苗率僅為2.60%，這與朱佩佩等[27]得出的結(jié)論一致，但是與Ula?等[7]的研究結(jié)論相反；以火焰無(wú)核作母本時(shí)，成苗率最高僅為2.78%，這與劉可可等[9]等研究發(fā)現(xiàn)火焰無(wú)核適合作母本的結(jié)論相反；以森田尼無(wú)核為母本時(shí)，沒(méi)有獲得雜種植株，而朱佩佩等[27]在利用森田尼無(wú)核為母本時(shí)，成苗率為14.40%，并依此認(rèn)為森田尼無(wú)核是胚挽救育種中比較適合的母本材料；以紫脆無(wú)核為母本時(shí)，成苗率僅為1.16%，成苗率比較低。因此，在無(wú)核葡萄胚挽救育種時(shí)，筆者建議要謹(jǐn)慎選用克倫生、火焰無(wú)核、森田尼無(wú)核和紫脆無(wú)核葡萄作為母本，其胚挽救成苗率較低甚至沒(méi)有成苗。

取樣時(shí)間對(duì)無(wú)核葡萄胚挽救效率也有很大的影響[10-11]，前人研究發(fā)現(xiàn)，起初，由于胚在果實(shí)內(nèi)部繼續(xù)發(fā)育，葡萄胚挽救成功率與采樣時(shí)間呈正相關(guān)，而在某一采樣時(shí)間之后，胚開(kāi)始急劇敗育，胚挽救成功率也急劇下降，與采樣時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)[28]。因此，在合子胚發(fā)育到最佳狀態(tài)時(shí)對(duì)幼果采樣，胚挽救的成功率最高。劉可可等[9]和李志瑛等[29]通過(guò)研究認(rèn)為火焰無(wú)核作母本時(shí)，最佳采樣時(shí)間為首次授粉后42 d；Giancaspro等[30]和Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)以紅寶石無(wú)核為母本時(shí)，最佳采樣時(shí)間為花后55 d。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，以火焰無(wú)核為母本的雜交組合，在第一次授粉后38 d采樣的胚挽救效率最高，這與劉可可等[9]和Li等[31]的研究結(jié)果存在差異；以克倫生為母本的雜交組合，在首次授粉后48 d采樣的胚挽救效率最高，以紅寶石無(wú)核為母本的雜交組合，在首次授粉后55 d采樣的胚挽救效率最高，這與前人的研究結(jié)果一致[30-31]。

通過(guò)無(wú)核分子標(biāo)記輔助育種，可以有效地節(jié)約物力和人力，縮短育種周期，提高育種效率[17，29，32]。目前，常用的無(wú)核分子標(biāo)記有p3-VvAGL11、5U-VviAGL11、SCF27-2000、GSLP1-569、SCC8-1018以及VMCF7F2-198[13-17]等。陳豆豆等[18]研究表明，p3-VvAGL11和5U-VviAGL11檢測(cè)無(wú)核性狀的準(zhǔn)確率較高，Akkurt等[33]研究表明，無(wú)核分子標(biāo)記SCF27-2000、SCC8-1018在檢測(cè)以兩個(gè)無(wú)核葡萄品種作為親本的雜交后代時(shí)準(zhǔn)確率較高，無(wú)核分子探針GSLP1-569更適合檢測(cè)與無(wú)核白親緣關(guān)系較近品種的雜交后代[8]。李莎莎等[2]利用無(wú)核探針GSLP1-569對(duì)火焰無(wú)核×左優(yōu)紅雜種后代進(jìn)行鑒定，后代無(wú)核率為57.14%，對(duì)火焰無(wú)核×北冰紅雜種后代進(jìn)行鑒定，后代無(wú)核率60.00%；玉賽賽等[34]利用無(wú)核分子標(biāo)記SCF27-2000對(duì)克瑞森無(wú)核×左優(yōu)紅的雜種后代進(jìn)行鑒定，后代無(wú)核率為76.92%，對(duì)紅寶石無(wú)核×雪蘭紅雜種后代進(jìn)行鑒定，后代無(wú)核率為18.75%，對(duì)美麗無(wú)核×木星的雜種后代進(jìn)行鑒定，后代無(wú)核率為50%。筆者利用無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11、GLSP1-569、SCF27-2000、SCC8-1018分別對(duì)火焰無(wú)核×巨玫瑰、火焰無(wú)核×陽(yáng)光玫瑰、紫脆無(wú)核×醉金香、克倫生×陽(yáng)光玫瑰、紅寶石無(wú)核×戶太8號(hào)、紅寶石無(wú)核×醉金香、紅寶石無(wú)核×京香玉7個(gè)雜交組合的雜種后代進(jìn)行無(wú)核鑒定，無(wú)核率分別為58.33%、100%、100%、72.73%、62.00%、63.79%、59.17%。

4 結(jié) 論

綜上所述，以無(wú)核葡萄為母本進(jìn)行胚挽救育種可以顯著提高無(wú)核葡萄育種效率，紅寶石無(wú)核是比較理想的母本材料；其次還要根據(jù)母本的品種特性選擇最佳的幼果采樣時(shí)間，來(lái)提高育種效率；通過(guò)無(wú)核分子標(biāo)記p3-VvAGL11、GLSP1-569、SCF27-2000、SCC8-1018進(jìn)行無(wú)核鑒定，可以對(duì)雜種后代的無(wú)核性狀進(jìn)行早期預(yù)測(cè)，提高無(wú)核葡萄胚挽救育種的效率。

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基金項(xiàng)目：陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目（2023-YBNY-077）；陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：王棟，碩士，研究方向?yàn)楣麡?shù)資源與遺傳育種。E-mail：wd29220914@163.com

*通信作者Author for correspondence. E-mail：wangxiping@nwafu.edu.cn