柚類種質資源DUS測試數量性狀分級研究

摘" " "要：【目的】驗證中國柑橘屬DUS測試指南中數量性狀對柚類種質資源的適應性，為更客觀更科學地描述柚類數量性狀和修訂柑橘屬DUS測試指南提供參考。【方法】以中國柑橘屬測試指南為標準，對117份柚類種質資源的25個數量性狀進行數據采集，根據各性狀的特點選擇合適的分級方法并確定分級范圍。【結果】25個數量性狀品種內變異系數在2.96%～26.96%之間，品種間變異系數在10.33%～62.90%之間，大部分數量性狀數據的多態性和穩定性較好；根據正態性檢驗結果對25個數量性狀進行分級，得到了25個數量性狀的分級標準，與柑橘屬測試指南的分級數相比：花萼直徑、果形指數、汁胞長度由3級增為5級，花瓣長度、花瓣寬度、葉片長度、葉片寬度、果皮厚度由9級減為7級，花瓣指數、葉形指數、中心柱大小、囊瓣數、果汁含量、可溶性固形物含量由9級減為5級，對果實質量、果實縱徑和果實橫徑3個性狀分別制定了柚和葡萄柚的分級標準；該分級標準下25個數量性狀的多樣性指數變化范圍為0.878～1.954，性狀間的相似系數分布在-0.69～0.91之間；通過主成分分析得到6個主成分，累積貢獻率達72.76%。【結論】初步建立了柚類種質資源25個數量性狀的分級指標，對柚類品種的性狀評價、利用及良種選育具有一定指導意義，同時為中國柚類種質鑒定和DUS測試指南修訂提供參考。

關鍵詞：柚類；DUS測試；數量性狀；分級

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）09-1885-18

Classification study on quantitative characteristics of pomelo germplasm resources for DUS test

CHEN Pu1， XU Zhenjiang1， JIANG Dong2， YI Jing1， SU Muqing1， DENG Chao3*， RAO Dehua1*

（1College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， Guangdong， China; 2Citrus Research Institute of Southwest University， Chongqing 400712， China; 3Development Center of Science and Technonlogy， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100122， China）

Abstract： 【Objective】 The DUS （Distinctness， Uniformity and Stability） test refers to the process of testing the specificity， consistency and stability of new plant varieties. The DUS test guideline is the technical basis and standard for DUS test of tested varieties， and has become the technical basis for variety approval， variety registration and variety protection in China. At present， the DUS testing guideline of Citrus in China （NY/T 2435—2013） covers the entire Citrus genus. However， there are great differences in some characteristics between the different species in the same genus . Therefore， this study aimed to explore the adaptability of quantitative characteristics in the DUS testing guidelines for Citrus in China to pomelo varieties， and to provide reference for more objective and scientific description of quantitative characteristics of pomelo and revision of DUS test guidelines of Citrus. 【Methods】 In this study， twenty-five quantitative characteristics of the 117 pomelo germplasm resources in the National Citrus Germplasm Resource collection were observed according to the DUS testing guideline of Citrus in China. The data of these twenty-five quantitative characteristics were collected by measurement method. The normality of the data was comprehensively judged according to the significant test value of the K-S test for each quantitative characteristics， the fitting of the frequency distribution diagram and the normality curve， and the deviation between the measured value of the Q-Q diagram and the predicted normal value. The least significant difference method was used to grade the quantitative characteristics that conformed to the normal distribution， and the range method was used to grade the quantitative characteristics that did not conform to the normal distribution. 【Results】 The intra-variety variation coefficient of the twenty-five quantitative characteristics was between 2.96% and 26.96%， and the inter-variety variation coefficient was between 10.33% and 62.90%. Most quantitative characteristics showed great polymorphism and stability. According to the results of normality test， the petal length， petal length/width， leaf blade length， leaf blade length/ width， petiole length， petiole wing width， stylar scar diameter， core diameter， fruit rind thickness， number of segments per fruit， number of seeds， fruit juiciness， total soluble solids， fruit juice acidity and edible rate conformed to normal distribution; The length of spring shoot internode， petal width， stamens number per flower and leaf blade width conformed to the approximate normal distribution， calyx diameter， fruit lengt， fruit diameter， fruit length/diameter， juice vesicles length and single-fruit weight did not conform to normal distribution. Among the six quantitative characteristics that did not follow a normal distribution， the frequency distribution of the fruit weight， fruit length and fruit diameter showed a clear bimodal distribution， which was mainly caused by the significant differences between pomelo and grapefruit species. Grapefruit and pomelo showed significant differences in these three characteristics， leading to a bimodal distribution. Therefore， if pomelo and grapefruit were uniformly graded on these quantitative characteristics， it would lead to a wide grading range and misjudge varieties with differences as no differences， thereby increase the probability of errors occurring. This study developed different grading standards for pomelo and grapefruit based on these three characteristics. After separating the data of the two species based on the three quantitative characteristics mentioned above， it was found that except for the pomelo group whose data on fruit diameter did not follow a normal distribution， the rest basically followed a normal distribution or approximate normal distribution. The least significant difference method was used to grade the quantitative characteristics that conformed to the normal distribution， and the range method was used to grade the quantitative characteristics that did not conformed to the normal distribution. The classification standards of the twenty-five quantitative characteristics were obtained. Compared with the grading numbers in the DUS testing guideline of Citrus in China， the calyx diameter， fruit shape index and juice cell length increased from 3 levels to 5 levels， the petal length， petal width， leaf length， leaf width and pericarp thickness decreased from 9 levels to 7 levels， and the petal index， leaf shape index， central column size， capsule number， juice content and soluble solids decreased from 9 levels to 5 levels. For fruit weight， fruit length and fruit diameter， the grading standards of pomelo and grapefruit were formulated respectively. The Shannon diversity index of each characteristics under this grading standard ranged from 0.878 to 1.954， and the Shannon diversity index of fruit juice acidity was relatively large， indicating that this characteristics had more phenotypes and was evenly distributed in different grades. The correlation coefficient of the twenty-five quantitative characteristics ranged from -0.69 to 0.91， and the correlation coefficient between fruit diameter and fruit weight was the highest， reaching 0.91， showing a very significant positive correlation. Six principal components were obtained by principal component analysis， with a cumulative contribution rate of 72.76%. The first principal component contained the most information， which was mainly determined by the 11 characteristics， including the fruit diameter， fruit weight， fruit length， petal width， calyx diameter， petal length， core diameter， stamens number per flower， juice vesicles length， leaf blade width and number of seeds. 【Conclusion】 This study established a preliminary classification index for the twenty-five quantitative characteristics of pomelo germplasm resources， which would have certain guiding significance for the evaluation， utilization， and breeding of pomelo germplasm resources. At the same time， it would provide reference for the identification of pomelo germplasm and the revision of pomelo DUS testing guideline in China. In addition， the classification standard of this study was based on the growth performance of pomelo in Chongqing， and the specific classification range might not be fully applicable to other ecological regions. In the process of DUS testing， researchers should make corresponding adjustments according to the expression status of standard varieties and combine with the field conditions， so as to ensure accurate evaluation and comparison of the character differences of the varieties in different regions.

Key words： Pomelo; DUS testing; Quantitative characteristics; Grade

柚[Citrus grandis（L.）Osbeck]又名拋子、文旦，葡萄柚（C. paradisi Macf.）又名西柚或圓柚，兩者均為蕓香科柑橘屬植物。柚的果實柚子，果型碩大、營養豐富、耐貯藏、便于運輸，有“天然罐頭”之稱[1]；葡萄柚果實比柚子較小，口感酸甜，略帶苦味，具有清熱退火的功效，主要用作鮮食、果汁、罐頭和色拉的原料[2]。大多學者認為葡萄柚是柚與甜橙的回交后代[3-5]，在植物分類上屬于與柚并列的一個種，在栽培上將其列入柚類[6]。柚類是柑橘屬四大栽培種類群（寬皮柑橘類、橙類、柚類、檸檬類）之一，中國作為柚類的原產地和變異中心，有著豐富的種質資源以及數千年的栽培歷史[7-9]。

植物新品種保護是實施國家知識產權和種業振興的重要組成部分，其不僅關系到育種權人的切身利益，還對推動種業的創新和發展起到關鍵作用。根據《中華人民共和國種子法》規定，申請品種權保護和品種審定、登記的農作物，均需開展特異性、一致性和穩定性（DUS）測試[10]。中國于2003年將柑橘屬列入中華人民共和國農業植物品種保護名錄（第五批）中，并于2013年發布《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 柑橘》（NY/T 2435—2013）農業行業標準（以下簡稱柑橘屬測試指南）。該指南的適用范圍包括整個柑橘屬，共有113個測試性狀，含質量性狀和假質量性狀45個，數量性狀68個。數量性狀是指表達狀態覆蓋了從一個極端到另一個極端之間的整個變異范圍的性狀[11]，如葉片長度、果實質量等。數量性狀分級是數量性狀代碼轉換的重要依據，數量性狀分級科學與否直接影響測試的最終結果。由于數量性狀極易受環境條件的影響，測試指南中沒有規定每個數量性狀的具體分級范圍，通過給出相應的一套標準品種作為標尺矯正每個生長周期中外界環境對測試結果的影響。

柑橘屬測試指南中列出了甜橙、寬皮橘、柚類和檸檬這四種類群的標準品種。其中，柚和葡萄柚雖同為柚類，兩者體型卻存在較大差異，在果型大小方面有著顯著差別。但柑橘屬測試指南對這些性狀的分級較少，例如在果實縱徑和果實橫徑上僅分為三級，第一級“小”的標準品種為葡萄柚品種馬敘，第二級“中”的標準品種為柚品種梁平柚（果實橫徑對應的是沙田柚），第三級“大”的標準品種為柚品種琯溪蜜柚。由于級數過少，僅把葡萄柚放置在最小等級中，不能很好地區分葡萄柚品種間以及柚品種間的差異。另外，柑橘屬的各種間形態大小各異，特別是柚，其果實體積是其他幾個種的數倍，采用同一套分級代碼進行測試可能會對柚品種的區分和鑒別產生偏差。

筆者在本研究中針對柚類種質資源在柑橘屬測試指南中的25個數量性狀進行分級研究，建立了一套柚類數量性狀的分級標準，可為更客觀更科學地描述柚類數量性狀和柑橘屬DUS測試指南修訂提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

117份柚類種質資源均來自國家柑橘種質資源圃（重慶）。由于中國葡萄柚的發展歷程較短，僅收集了13份葡萄柚品種資源進行研究，其余104份為柚品種資源。供試材料包括大部分柑橘屬測試指南中的標準品種，具有良好的代表性（表1）。

1.2 數據采集方法

DUS測試中數量性狀表達可通過目測或測量的方法觀測。當品種內變異較小時，通常可以通過目測而減少工作量；而當品種間差異較小，目測無法判定該性狀是否存在明顯差異，或當對一個通常采用目測的數量性狀作為與另一品種相區別的性狀沒把握時，應對該數量性狀進行測量，通過統計分析的方法判定[11]。

對柑橘屬測試指南中的25個數量性狀采集田間數據，其中18個為測量性狀，7個為群體目測性狀（T1、T2、T10、T11、T16、T17、T20）。為提升性狀觀測的精準性，調查時均采用測量的方法，以測量值對個體或群體進行記錄（表2）。

1.3 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2021計算出各性狀的最小值、最大值、中值、平均值和標準差。根據公式（1）計算品種內變異系數CV1，根據公式（2）計算品種間變異系數CV2。其中X1為每個性狀每個品種的均值，X2為各性狀的均值，S1為每個性狀每個品種的標準差，S2為各性狀的標準差。

[CV1 = S1 ÷ X1×100%]； " " " （1）

[CV2 = S2 ÷ X2×100%]。 " " " （2）

遺傳多樣性指數采用香農多樣性指數，計算公式為H’= -[Pi×ln（Pi）]，其中[Pi]表示某個性狀第i個代碼出現的概率，H’為遺傳多樣性指數。使用SPSS軟件進行K-S檢驗及LSD檢驗，通過Origin軟件繪制頻率分布直方圖和Q-Q圖，利用R語言進行相關性分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 柚類種質資源數量性狀變異情況分析

性狀表達狀態在品種內變異系數越小，該性狀在品種內表達越穩定；在品種間變異系數越大，遺傳背景越豐富，利用該性狀鑒別品種的可能性越大。對117份柚類種質資源的數量性狀進行統計分析（表3），結果表明，25個數量性狀的品種內變異系數介于2.96%～26.96%之間，其中T23可溶性固形物含量、T14果實橫徑和T15果形指數的品種內變異系數較小，分別為2.96%、3.40%和3.86%，說明這幾個性狀在品種內的穩定性較好；T11翼葉寬度和T21種子數量的品種內變異系數較大，分別為23.01%和26.96%，表明這2個性狀在品種內的穩定性較差，易受環境等因素影響。

所有數量性狀的品種間變異系數均大于品種內變異系數，變化范圍在10.33%～62.90%之間。品種間變異系數較大的有T11翼葉寬度（43.33%）、T12果實質量（39.75%）、T17中心柱大小（42.49%）、T18果皮厚度（36.79%）、T21種子數量（62.90%）和T24果汁含酸量（54.82%），這些性狀在品種間的變異幅度大，遺傳變異較為豐富。

2.2 柚類種質資源數量性狀正態性檢驗

數量性狀分級方法的選擇與性狀表達狀態是否符合正態分布密切相關，對各數量性狀的數據進行K-S正態性檢驗并繪制頻率分布直方圖和Q-Q圖（表4，圖1）。T3花瓣長度、T5花瓣指數、T7葉片長度、T9葉形指數、T10葉柄長度、T11翼葉寬度、T16花柱痕直徑、T17中心柱大小、T18果皮厚度、T19囊瓣數量、T21種子數量、T22果汁含量、T23可溶性固形物含量、T24果汁含酸量以及T25可食率這15個性狀的K-S檢驗p值大于0.05，中值與平均值接近，數據分布較均勻，Q-Q圖中實測值與預測正態值偏差不大，符合正態分布；T1春梢節間長度、T4花瓣寬度、T6雄蕊數量及T8葉片寬度這4個性狀的K-S檢驗p值小于0.05，但其頻次分布曲線與正態分布曲線較為相似，偏度與峰度值均小于1，Q-Q圖中實測值與預測正態值偏差不大，可認為符合近似正態分布；T2花萼直徑、T13果實縱徑、T14果實橫徑、T15果形指數、T20汁胞長度這5個性狀的K-S檢驗p值小于0.05，中值與平均值差距較大，頻率分布直方圖可看出對稱性較差且Q-Q圖中實測值與預測正態值偏差較大，不符合正態分布；T12果實質量的K-S檢驗p值雖大于0.05，但中值與均值相差較大，數據分布不均勻，同時其Q-Q圖中實測值與預測正態值也具有偏差，故認為不符合正態分布。

在不符合正態分布的6個性狀中，發現3個性狀的頻率分布圖呈現出明顯的雙峰分布，這些性狀分別是T12果實質量、T13果實縱徑和T14果實橫徑。進一步分析發現，這種雙峰現象主要由葡萄柚和柚兩個種之間的顯著差異所引起。葡萄柚屬于小型果而柚屬于大型果，兩者在這3個的性狀上表現出較大的差異，從而導致雙峰分布的情況。因此若將柚和葡萄柚在這些數量性狀上進行統一分級，會導致分級范圍寬而將有差異的品種錯判為無差異，進而增加錯誤發生的概率。將針對這3個性狀分別為柚和葡萄柚制定不同的分級標準，并以“編號1（僅適用于柚）”、“編號2（僅適用于葡萄柚）”的形式呈現。

上述3個性狀在柚和葡萄柚群體中的分布情況及其K-S檢驗如圖2、表5所示。對兩類群數據進行分離處理后，發現除柚群體在性狀T14的數據不符合正態分布外，其余基本符合正態分布或近似正態分布。

2.3 柚類種質資源數量性狀分級和多樣性分析

在DUS測試中，對符合正態分布的數量性狀分級使用較多的是概率分布法和最小顯著差法。概率分布法按（X-1.281 8S）、（X-0.524 6S）、（X+0.524 6S）和（X+1.281 8S）4個分點可將性狀分為3或5級（X為均值、S為標準差）；最小差異顯著法通過計算每個數量性狀的LSD0.05的值，以測量數據的中值為中心，級差大于等于2倍LSD0.05向兩側進行等距劃分，再通過實際情況對每個區間進行調整，可將數量性狀分為3～9級不等。國際植物新品種保護聯盟（簡稱UPOV）提出每個分級所包含的區間不得小于2倍LSD0.05[12]，不僅確保了每個相鄰分級之間具有明顯的差異，而且能將相對集中的數據進行較為細致的劃分。

大多性狀利用概率分布法的分級區間不滿足大于等于2倍LSD0.05的要求，且有較多的品種資源落在兩端代碼的范圍，不利于區分特殊的（如極大或者極小）品種，故對符合正態分布和近似正態分布的性狀均采用最小顯著差法進行分級。對于不符合正態分布的數量性狀，運用極差法來進行劃分。首先通過極差與分級數的比值計算出每一個數量性狀的分級級差，以分布范圍的中位數為分級中點，按公式y=G±（1/2+n）x（n=0、1、2、3、4，G為數據中位數，x為分級級差）進行級別劃分，確定各數量性狀分級區間。根據性狀的變異、數據分布情況以及田間的整體表現情況來確定分級數（表6）。

通過最小差異顯著法和極差法，將性狀T1春梢節間長度、T6雄蕊數量、T10葉柄長度、T11翼葉寬度、T16花柱痕直徑和T25可食率分成3個連續分布的分級范圍，性狀T2花萼直徑、T5花瓣指數、T9葉形指數、T12.2果實質量（僅適用于葡萄柚）、T13.2果實縱徑（僅適用于葡萄柚）、T14.2果實橫徑（僅適用于葡萄柚）、T15果形指數、T17中心柱大小、T19囊瓣數量、T20汁胞長度、T21種子數量（自然授粉）、T22果汁含量和T23可溶性固形物含量分成5個連續分布的分級范圍，性狀T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T7葉片長度、T8葉片寬度、T13.1果實縱徑（僅適用于柚）、T14.1果實橫徑（僅適用于柚）和T18果皮厚度分成7個連續分布的分級范圍，性狀T12.1果實質量（僅適用于柚）和T24果汁含酸量分成9個連續分布的分級范圍。

25個性狀的區間均大于2倍的LSD0.05，符合UPOV對相鄰分級間明顯差異的要求。將分級數與柑橘屬測試指南的分級數相比（表6），T2花萼直徑、T15果形指數、T20汁胞長度由3級增為5級；T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T7葉片長度、T8葉片寬度、T18果皮厚度由9級減為7級；T5花瓣指數、T9葉形指數、T17中心柱大小、T19囊瓣數量、T22果汁含量、T23可溶性固形物含量由9級減為5級。對于性狀T12果實質量、T13果實縱徑和T14果實橫徑，中國柑橘屬測試指南中分為了9級、3級、3級，筆者在本研究中針對柚類種質資源的分布特點，單獨劃分了柚和葡萄柚的分級范圍，這3個性狀對柚劃分為9級、7級、7級，對葡萄柚均劃分為5級，此分級范圍更適用于中國柚類的DUS測試。

利用分布頻率計算的25個數量性狀的遺傳多樣性指數H’在0.878～1.954之間變化（表7），均值為1.318，遺傳多樣性指數H’從高到低依次為：T24＞T12.1＞T18＞T14.1＞T3＞T13.1＞T8＞T7＞T4＞T14.2＞T21＞T12.2＞T17＞T9＞T5＞T13.2＞T20＞T2＞T23＞T15＞T22＞T11＞T10＞T19＞T6＞T1＞T25＞T16。T24果汁含酸量、T12.1果實質量（僅適用于柚）、T18果實橫徑等性狀的多樣性指數相對較大，表明這些性狀的表現型較多且在不同等級中均勻分布。

2.4 柚類種質資源數量性狀相關性分析

為了排除種間差異帶來的影響，除去葡萄柚品種資源單獨繪制104個柚品種資源在25個數量性狀之間的相關性熱圖（圖3）。多個性狀之間存在不同程度相關性，相關系數分布在-0.69～0.91之間，花、葉、果內部間包含的性狀相關性高。5個花性狀間的相關系數絕對值在0.25～0.73之間，平均相關系數絕對值為0.46，T2花萼直徑與T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T6雄蕊數量存在極顯著正相關關系（0.59、0.73、0.47）；T4花瓣寬度與T3花瓣長度、T6雄蕊數量呈極顯著正相關（0.66、0.50），與T5花瓣指數呈極顯著負相關（-0.48）。5個葉性狀間的相關系數絕對值在0.03～0.82之間，平均0.33，T10葉柄長度與T11翼葉寬度呈極顯著正相關（0.82）；T7葉片長度與T8葉片寬度、T9葉形指數和T10葉柄長度呈極顯著正相關（0.47、0.44、0.31）；T8葉片寬度與T9葉形指數呈極顯著負相關（-0.58）。14個果實性狀間的相關系數絕對值在0.00～0.91之間，平均0.22，T14果實橫徑與T12果實質量的相關系數最大，為0.91，呈極顯著正相關；T22果汁含量與T25可食率呈極顯著正相關（相關系數為0.76）；T13果實縱徑與T14果實橫徑、T15果形指數和T18果皮厚度呈極顯著正相關（0.60、0.55、0.47）。另外，T18果皮厚度還與T22果汁含量、T25可食率呈極顯著負相關（-0.69、-0.67），表明果皮越厚，果汁含量和可食率越低。不同類型的性狀也存在著一定的相關性，比如T2花萼直徑、T3花瓣長度、T4花瓣寬度與T9葉形指數呈極顯著負相關（-0.43、-0.43、-0.30）、與T8葉片寬度呈極顯著正相關（0.47、0.45、0.35）；T12果實質量、T13果實縱徑、T14果實橫徑與T2花萼直徑、T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T6雄蕊數量、T8葉片寬度也均呈極顯著正相關。

2.5 數量性狀主成分分析

利用SPSS將25個數量性狀進行主成分分析，以特征值大于等于1為標準，共提取出6個主成分（表8），累積貢獻率達72.76%，表明這25個數量性狀的遺傳信息可由這6個主成分代表。第一個主成分特征值為7.57，貢獻率為30.27%，包含著最多的信息，主要由果實橫徑、果實質量、果實縱徑、花瓣寬度、花萼直徑、花瓣長度、中心柱大小、雄蕊數量、汁胞長度、葉片寬度和種子數量這11個性狀決定；第二個主成分特征值為2.99，貢獻率為11.98%，包含可食率、果汁含量和果皮厚度3個性狀，主要是與果實的食用性相關的性狀；第三個主成分的特征值為2.60，貢獻率為10.40%，包含葉柄長度、翼葉寬度、葉片長度和春梢節間長度4個性狀，主要與葉片大小和春梢節間長度相關；第四個主成分的特征值為2.00，貢獻率為7.98%，包含囊瓣數量、花柱痕直徑、果形指數和花瓣指數4個性狀，為果心以及長寬比相關性狀；第五個主成分的特征值為1.61，貢獻率為6.45%，包含葉形指數1個性狀；第六個主成分的特征值為1.42，貢獻率為5.67%，包含可溶性固形物含量和果汁含酸量2個性狀，為果實品質相關性狀。

3 討 論

變異系數是衡量數據離散程度的重要指標，不僅能夠評估單一數據集內的變異性，還能夠跨數據集進行變異程度的比較。在本研究中，25個數量性狀中果實質量和果汁含酸量在品種內的穩定性較好，其變異系數分別為8.88%和15.71%，同時在品種間表現出較豐富的遺傳多樣性，變異系數分別為39.75%和54.82%，說明這兩個性狀在描述和區分品種時具有較高的實用價值和應用潛力。種子數量和翼葉寬度的品種間變異系數分別達62.90%和43.33%，盡管這兩個性狀在品種間存在較大的遺傳變異，但兩者的品種內變異系數也較大，分別為26.96%和23.01%，反映這兩個性狀在品種內的穩定性較差，因此在對種子數量和翼葉寬度進行測試時，需要考慮環境條件等因素以確保測試結果的準確性和可靠性。

DUS測試數量性狀的合理分級是特異性判定的重要環節，也是制定、修訂測試指南最重要和最關鍵的部分[13]。為方便測試數據信息化處理，以及消除同一品種在不同年度、不同測試地點間同一性狀表達數據不同造成的差異，在DUS測試中需要將性狀表達狀態實際測量值轉化為以數字表示的分級代碼。數量性狀分級過少，每一級可能導致性狀表達狀態有差異的兩個品種代碼相同，增加錯誤概率；分級過多，不僅無法排除品種內差異、校正測量誤差，還可能錯將兩個相似品種判定為有差異，導致誤判[14]。數量性狀的分級有極差法、概率分級法、中值平均標準差法以及最小顯著差法等多種。極差法又稱等距法，此方法簡單直觀，在向日葵[15]、毛花獼猴桃[16]等數量性狀的分級中得以應用；概率分級法依據數據的分布規律進行分級，適用于正態分布的性狀，該方法在棗[17]、草莓[18]、大花惠蘭[19]、杜仲[20]等數量性狀的分級中均有應用，能較準確地反映性狀的變異范圍和分布狀態，但通常只能將數量性狀分為3級或5級[21]，并且對于數據分布比較集中的性狀會存在分級區間過小的情況，使之不滿足UPOV對數量性狀的基本要求（分級級差不得小于2倍LSD0.05）；褚云霞等[22]和紀軍建等[13]利用中值平均標準差法進行數量性狀分級，此法操作簡便，但若數據呈偏態分布，僅依靠平均值和標準差進行分級可能會導致分級不夠精細或不夠準確；最小顯著差法適用于符合正態分布的性狀，能夠檢測出較小的差異，即使在性狀數據相近時也能區分出顯著性差異，同時靈活性強，可將性狀分為3～9級不等，目前已經廣泛應用于多種植物的數量性狀分級[23-25]。不同的分級方法有各自的適用范圍和局限性，分級方法的選擇需考慮測試目標、性狀的分布特征以及測試指南的要求。筆者在本研究中根據柚類種質的調查數據，將25個數量性狀進行正態性檢驗，對符合正態分布的性狀采用最小顯著差法，對不符合正態分布的性狀選用極差法，同時結合田間表現情況及未來育種發展的可能性，對25個數量性狀的分級進行調整，最終各性狀的分級區間均符合大于等于2倍LSD0.05的基本要求。由于數量性狀的表達易受到栽培環境和氣候條件的影響，本研究中的分級標準以重慶地區柚類的生長情況為基礎，具體分級范圍可能不完全適用于其他生態區域。確定的25個數量性狀表達狀態劃分可作為參考，在測試過程中研究者需根據標準品種的表達狀態并結合田間情況做出相應的調整，確保能夠準確地評估和比較不同區域內品種的性狀差異。

由于數量性狀的表達易受到栽培環境和氣候條件的影響，同一品種在不同年度或區域間的表現可能會有所變化[26]。因此即便UPOV發布了相應的測試指南，也需要針對各國家和地區的具體條件進行調整，以確保分級標準的實用性[27]。UPOV作為國際指南，對數量性狀的分級大多采用最大尺度（1～9級尺度），各成員國可結合本國的具體情況對其進行修改。筆者在本研究中針對柚類種質資源，對中國柑橘屬測試指南中的數量性狀重新進行劃分，與中國柑橘屬測試指南相比：花萼直徑、果形指數、汁胞長度由3級增為5級，花瓣長度、花瓣寬度、葉片長度、葉片寬度、果皮厚度由9級減為7級，花瓣指數、葉形指數、中心柱大小、囊瓣數量、果汁含量、可溶性固形物含量由9級減為5級。與UPOV發布的柚類測試指南（TG/204/1）相比：花瓣長度、花瓣寬度、葉片長度、葉片寬度、果皮厚度由9級減為了7級；花萼直徑、花瓣指數、果形指數、中心柱大小、囊瓣數量、汁胞長度、果汁含量、可溶性固形物含量、種子數量（自然授粉）由9級減為了5級；葉柄長度、翼葉寬度、花柱痕直徑由9級減為了3級。而對于果實質量、果實縱徑和果實橫徑，筆者在本研究中發現這3個性狀在柚類材料的頻率分布圖中呈明顯的雙峰型分布，且這種分布情況是由柚和葡萄柚的種間差異造成的。中國柑橘屬測試指南和UPOV柚類測試指南（TG/204/1）均沒有在這3個性狀上對兩者進行區分，筆者在本研究中通過對兩年的測量數據分級發現，若兩個種一起分級會導致分級區間范圍過大，可能會使兩個有差異的品種代碼相同，增加測試的錯誤概率，不利于兩種類型品種的區分[14]。玉米測試中存在著類似的情況，自交系玉米在植株高度、穗位高度和果穗長度等性狀上會明顯低于雜交種玉米，對此玉米DUS測試指南（GB/T 19557.24—2018）在這些性狀上進行劃分，對不同類型品種分別制定了分級標準和標準品種。同樣棉花DUS測試指南（NY/T 2238—2012）也采用了相同的方法，在6個數量性狀上對陸地棉和海島棉兩個種分類分級。柚與葡萄柚雖同為柚類，在較多性狀上有著相似之處，使得兩者可同用一本測試指南進行測試，但在體型的大小上卻存在較大的區別。因此筆者在本研究中參照玉米DUS測試指南的處理方法，分別在果實質量、果實縱徑和果實橫徑3個性狀上制定了柚和葡萄柚的分級標準。該分級范圍更適用于中國柚類的區分和鑒別，增強了對柚類品種鑒定的準確性，為柚類DUS測試的準確性和科學性提供理論基礎和參考。

柑橘屬含有寬皮柑橘、甜橙、檸檬、柚等幾十個種，這些種親緣關系較近，但在形態上卻差異巨大。目前中國柑橘屬的DUS測試僅有《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 柑橘》（NY/T 2435—2013）一個測試指南可依，采用同一個指南作為測試標準可能會對性狀表達狀態的判斷產生偏差。例如柑橘屬指南中“果實：果臍”、“果實：乳突”在柚類中就鮮有表達。國際植物新品種保護聯盟（UPOV）已將柑橘屬分為了寬皮柑橘、橙、檸檬和來檬、柚和葡萄柚等不同組，每組都有其特定的測試指南，可以更精確地反映不同品種間的差異。因此，為更好地開展柚類品種測試工作，服務廣大育種者和生產者，使中國柚類品種的DUS測試工作有其特有的標準可依，確保植物品種DUS測試數據的準確性和權威性，應當結合國際測試指南，有針對性地制定適合中國柚類品種鑒定及保護的DUS測試指南，從而更精準地為柚類品種DUS測試服務。

4 結 論

依據《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 柑橘》對25個數量性狀數據進行了分級研究，確定了各數量性狀的分級范圍，對柚類DUS測試數量性狀描述分級具有較好的指導作用，并可對下一步修訂柑橘屬DUS測試指南提供參考。

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基金項目：農業農村部物種品種資源保護項目：申請保護品種DUS測試及已知品種庫維護（h20230603）

作者簡介：陳璞，女，在讀碩士研究生，研究方向為種業。E-mail：402103519@qq.com

*通信作者Author for correspondence. E-mail：dengchaowin@sina.com；E-mail：huard_001@163.com