西羅莫司新類似物FIM-R140的分離和結(jié)構(gòu)鑒定

摘要：目的 從西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌FC904發(fā)酵液的粗提物中分離純化未知雜質(zhì)FIM-R140，鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。方法 采用硅膠柱層析和制備液相分離純化獲得FIM-R140，進(jìn)行理化性質(zhì)以及IR、UV、NMR和HRMS等波譜分析，鑒定該雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。用SRB測(cè)定化合物體外抗腫瘤活性，用沙氏液體培養(yǎng)基二倍稀釋法測(cè)定化合物的抗真菌活性。結(jié)果與結(jié)論 純化獲得HPLC純度為97.05%的FIM-R140，結(jié)構(gòu)鑒定為31-差向雷帕霉素，為首次報(bào)道的西羅莫司同分異構(gòu)體。FIM-R140的抗腫瘤活性較西羅莫司略低，對(duì)白念珠菌的抑菌作用弱于西羅莫司。

關(guān)鍵詞：西羅莫司；31-差向雷帕霉素；吸水鏈霉菌FC904；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號(hào)：R979.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation and identification of sirolimus analogue FIM-R140

Chen Xiaqin， Chen Xiaoming， Liu Ying， Ying Jiayin， Li Kualiang， Huang Jie， and Yang Guoxin

（Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou 350007）

Abstract Objective To isolate and identify FIM-R140， a metabolite from the broth of the sirolimus producing strain Streptomyces hygroscopicus FC904. Methods FIM-R140 was separated and purified by silica gel chromatography and preparative liquid chromatography. Its chemical structure was determined by physicochemical properties and spectral analysis including IR， UV， NMR， and HRMS. The anti-cancer activity of FIM-R140 was determined by the SRB method in vitro， and the antifungal activity was evaluated by the serial two-fold broth dilution method. Results and Conclusion FIM-R140 with HPLC of 97.05% was obtained， and it was identified as 31-epi-rapamycin， a sirolimus isomer， which was reported for the first time. The anti-cancer activity and anti-fungus activity of FIM-R140 were slightly weaker than those of sirolimus.

Key words Sirolimus; 31-epi-rapamycin; Streptomyces hygroscopicus FC904; Isolation and purification; Structure identification

西羅莫司（sirolimus），又名雷帕霉素（rapamycin），為大環(huán)三烯內(nèi)酯類藥物（圖1），1975年首次報(bào)道的從智利復(fù)活節(jié)島土壤中分離出的吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）NRRL 5491產(chǎn)生的一種抗真菌代謝產(chǎn)物[1-2]，后續(xù)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)西羅莫司具有免疫抑制[3]、抗腫瘤[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]、抗衰老及延長(zhǎng)壽命[6]等作用。西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌FC904（Streptomyces hygroscopicus FC904）及其突變株在發(fā)酵過程中除產(chǎn)生西羅莫司外，還產(chǎn)生許多西羅莫司衍生物[7-12]。由于西羅莫司衍生物結(jié)構(gòu)與西羅莫司類似，不易分離，成為了西羅莫司原料藥中雜質(zhì)的主要來源。隨著人們對(duì)藥物安全性的日益關(guān)注，對(duì)藥物中雜質(zhì)的控制已經(jīng)成為藥品質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，最大化地檢測(cè)并分離到未知雜質(zhì)，逐步完善對(duì)雜質(zhì)譜的認(rèn)知，才能不斷提高對(duì)藥物的雜質(zhì)控制水平。

在吸水鏈霉菌FC904發(fā)酵液的粗提物中存在HPLC保留時(shí)間與本實(shí)驗(yàn)室已分離得到的西羅莫司衍生物不同的未知雜質(zhì)，相對(duì)保留時(shí)間RRT=1.18，緊挨著西羅莫司異構(gòu)體出峰（圖2），暫命名為FIM-R140。對(duì)其進(jìn)行UV掃描，結(jié)果表明該雜質(zhì)在266、277和288 nm有強(qiáng)吸收峰，與西羅莫司的紫外吸收行為一致，推測(cè)其也屬于西羅莫司類似物。本文報(bào)道FIM-R140的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

西羅莫司發(fā)酵液粗提物和西羅莫司對(duì)照品由福建科瑞藥業(yè)有限公司提供；人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT-15、人食管癌細(xì)胞ECA-109、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人腺胃癌細(xì)胞SGC7901、人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞786-0、人乳腺癌細(xì)胞T47D購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。白念珠菌CPCC360003、白念珠菌CMCC（F）98001購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要儀器

LC-8A制備液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Bruker AM-500核磁共振儀（德國Bruker公司）；Agilent 6454 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國安捷倫公司）； AccuTOF-MS高分辨質(zhì)譜分析儀（日本JEOL公司）；Spectrum Two紅外光譜儀（美國PerkinElmer公司）。

1.3 HPLC檢測(cè)條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 μm，

1.8 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；柱溫：45℃；樣品架溫度：5℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：1.5 mL/min；流動(dòng)相A為0.1%甲酸；流動(dòng)相B為甲醇-乙腈（50：50， V/V），采用梯度洗脫程序，0～5 min，36% A；5～17 min，36%～25% A；17～22 min，25%～10% A；22～24 min，10% A；24～

25 min，10%～36% A；25～30 min，36% A。

1.4 分離純化

稱取200～300目硅膠裝填玻璃層析柱，將西羅莫司的發(fā)酵液粗提物用適量丙酮溶解后上樣，樣品吸附后，以丙酮-石油醚（1：4， V/V）混合溶劑洗脫，分瓶收集，用高效液相色譜儀跟蹤檢測(cè)，將分離得到的含F(xiàn)IM-R140的洗脫液減壓濃縮，除去溶劑，得到淺黃色泡沫狀固體，得到FIM-R140的粗品。

將淺黃色泡沫狀固體溶解于少量甲醇中，通過制備液相色譜儀分離。制備色譜分離條件：色譜柱為UniSil 10-100 C18 （21 mm×250 mm，10 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水溶液（80：20， V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 277 nm；柱溫為室溫；流速為8 mL/min。分段收集，HPLC跟蹤檢測(cè)。將分離得到的組分減壓濃縮去除甲醇后用等體積的二氯甲烷分別萃取兩次，合并二氯甲烷層，減壓濃縮除去二氯甲烷獲得FIM-R140較純產(chǎn)物。將較純FIM-R140產(chǎn)物再進(jìn)行一次制備液相色譜儀分離，合并純度為95%以上的部分。重復(fù)上述步驟，獲得FIM-R140純品。

1.5 FIM-R140的初步生物學(xué)活性

1.5.1 FIM-R140體外抗腫瘤活性測(cè)定

取細(xì)胞以1×104 個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置37 ℃ 5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)24 h。待其貼壁后，分別加入西羅莫司（對(duì)照）和FIM-R140，其終濃度達(dá)到0.0006、0.0024、0.0098、0.039 、0.156、0.625、2.5和10 μmol/L，每組4個(gè)復(fù)孔， 每孔終體積為200 μL。置上述條件下培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入50 μL 4 ℃預(yù)冷的TCA溶液 （50%，W/V），放置于4℃中固定細(xì)胞1 h后，用去離子水沖洗3～5遍，室溫晾干。每孔加入0.4%

（W/V ）的SRB染液100 μL，染色15 min后倒掉，用1% （V/V）乙酸沖洗3～5遍，室溫晾干。用100 μL Tris-base堿液（10 mmol/L，pH 10.5）溶解染料，水平搖床上振蕩20 min，采用酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定光吸收值。本實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。FIM-R140體外抗腫瘤活性的IC50使用Graphpad prism軟件從抑制率換算得到的。

1.5.2 FIM-R140對(duì)白念珠菌的抑制作用

待測(cè)菌懸液的制備：將白念珠菌接種于沙保羅瓊脂培養(yǎng)基上，置28 ℃培養(yǎng)48 h后，取1接種環(huán)培養(yǎng)物混懸于2 mL無菌生理鹽水中震蕩使之懸浮均勻后，用沙保羅液體培養(yǎng)基稀釋菌懸液至1×105～

5×105 CFU/mL。待測(cè)樣品溶液配制：乙醇溶解配成200 μg/mL溶液。應(yīng)用二倍稀釋法測(cè)抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 分離純化

西羅莫司發(fā)酵液粗提物通過正相硅膠柱層析方法富集FIM-R140粗品（圖3），再利用制備液相色譜儀分離獲得FIM-R140，HPLC分析結(jié)果表明其純度為97.05%（圖4）。

2.2 理化性質(zhì)

質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明FIM-R140的分子式為C51H79NO13，與西羅莫司的分子式一致；紫外吸收行為、紅外光譜主要特征峰、溶解度與西羅莫司類似（表1）。

2.3 結(jié)構(gòu)解析

FIM-R140的13C NMR圖譜及DEPT中，大多數(shù)的譜線是成對(duì)出現(xiàn)且一強(qiáng)一弱，1H NMR譜中強(qiáng)弱信號(hào)比例約為2.5：1，提示該化合物在DMSO中存在構(gòu)象異構(gòu)，與西羅莫司相似，可能是由于酰胺鍵旋轉(zhuǎn)受阻引起的[13]。

FIM-R140的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示該化合物含51個(gè)碳原子，結(jié)合其主要構(gòu)象體的13C NMR和DEPT譜，可推斷出該化合物的分子結(jié)構(gòu)中含10個(gè)甲基，13個(gè)亞甲基，20個(gè)次甲基，3個(gè)季碳及5個(gè)羰基碳，與西羅莫司一致。13C NMR圖譜中碳的范圍（160～220 ppm）有5個(gè)信號(hào)，結(jié)合HSQC譜，它們應(yīng)為酮羰基。烯碳范圍內(nèi)（110～160 ppm）有8個(gè)信號(hào)，一個(gè)半縮酮碳（99.03 ppm）。FIM-R140的13C NMR譜與西羅莫司對(duì)比發(fā)現(xiàn)，化學(xué)位移值為13.35 ppm的碳信號(hào)消失，在HSQC譜中相關(guān)聯(lián)的氫信號(hào)δH 0.83也消失，該信號(hào)為西羅莫司C-51位的甲基信號(hào)；而在δH 0.95出現(xiàn)新的甲基信號(hào)；在HMBC譜中可觀察到該甲基上的氫與C-30（δC 212.59）的羰基碳、C-31（δC 40.51）和C-32（δC 38.65）都有相關(guān)信號(hào)；在HSQC譜中找到與C-31、C-32分別直接相連的氫H-31（δH 2.68）和H-32（δH 1.21、1.45）。在ROESY譜中觀察到H-51和H-32的有相關(guān)信號(hào)，再結(jié)合COSY和TOCSY譜可推測(cè)出該未知雜質(zhì)與西羅莫司結(jié)構(gòu)上的不同點(diǎn)在于C-31與C-51甲基連接的構(gòu)型發(fā)生變化，從R-型轉(zhuǎn)化為S-型，同時(shí)引起附近的碳位移變化。圖5為FIM-R140部分二維核磁相關(guān)信號(hào)示意圖，表2列出FIM-R140與西羅莫司主要構(gòu)型的13C NMR 和1H NMR化學(xué)位移歸屬。

2.4 FIM-R140體外生物學(xué)活性

2.4.1 FIM-R140對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

FIM-R140對(duì)受試的腫瘤細(xì)胞株的IC50值略大于西羅莫司（表3），說明FIM-R140的抗腫瘤活性較西羅莫司低。

2.4.2 FIM-R140對(duì)白念珠菌的抑制作用

FIM-R140的抗菌活性檢測(cè)結(jié)果（表4）表明，F(xiàn)IM-R140對(duì)白念珠菌CMCC（F）98001及白念珠菌CPCC360003的MIC均為1.250 μg/mL，說明FIM-R140對(duì)白念珠菌CMCC（F）98001及白念珠菌CPCC360003均有抑制作用，但弱于西羅莫司。

3 結(jié)論與討論

未知雜質(zhì)FIM-R140在西羅莫司發(fā)酵液粗提物中含量低，首先通過正相硅膠柱層析方法富集到FIM-R140粗品；再利用柱效高、分離效果好的制備液相色譜儀進(jìn)行最后的純化，獲得了純度為97.05%的未知雜質(zhì)FIM-R140。結(jié)合多種結(jié)構(gòu)鑒別分析，包括紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振譜等波譜分析，表明未知雜質(zhì)FIM-R140為31-差向雷帕霉素（圖6），屬于西羅莫司的同分異構(gòu)體，這是首次報(bào)道的西羅莫司同分異構(gòu)體。本研究表明，F(xiàn)IM-R140的抗腫瘤活性較西羅莫司略低；對(duì)白念珠菌CPCC360003和白念珠菌CMCC（F）98001具有較強(qiáng)的抑制作用，但活性弱于西羅莫司。西羅莫司是mTOR變構(gòu)抑制劑，在體內(nèi)先與FK506結(jié)合蛋白（FKBP12）結(jié)合后的復(fù)合物再與西羅莫司靶蛋白（mannian target of mTOR）的FRB結(jié)合域結(jié)合，形成FKBP-西羅莫司-mTOR三元復(fù)合物并抑制mTOR活性[14-15]。FIM-R140與西羅莫司結(jié)構(gòu)上的不同點(diǎn)在于C-31與C-51甲基連接的構(gòu)型發(fā)生變化，可能會(huì)引起FRB結(jié)構(gòu)域與西羅莫司的相互作用發(fā)生變化，造成FIM-R140的抗腫瘤活性和抗真菌活性均低于西羅莫司。因此對(duì)未知有關(guān)雜質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，有助于原料藥的雜質(zhì)譜分析研究，有利于藥物質(zhì)量控制及生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，以便進(jìn)一步提高藥品質(zhì)量。

參 考 文 獻(xiàn)

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文章編號(hào)：1001-8689（2024）09-1013-06

收稿日期：2023-11-07

基金項(xiàng)目：福建省公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（No. 2021R10050013）

作者簡(jiǎn)介：陳夏琴，女，生于1985年，助理研究員，從事微生物藥物化學(xué)研究，E-mail： chenxiaqin007@163.com

*通信作者，E-mail： guo-xinyang@163.com