國產硫酸慶大霉素滴眼液中抑菌劑的使用現狀分析

摘要：目的 分析國產硫酸慶大霉素滴眼液中抑菌劑使用現狀及存在的問題。方法 采用新建的硫酸慶大霉素滴眼液中抑菌劑含量測定方法，結合抑菌劑影響因素試驗、抑菌劑與包材的相容性對23批次國產硫酸慶大霉素滴眼液中的抑菌劑進行檢測，分析該產品中抑菌劑使用的合理性。結果 硫酸慶大霉素滴眼液中羥苯乙酯的含量隨產品剩余效期減少而降低，產品使用的低密度聚乙烯滴眼劑瓶對抑菌劑羥苯乙酯存在吸附作用。結論 目前國產硫酸慶大霉素滴眼液中抑菌劑羥苯乙酯的使用存在一定問題，建議企業重視處方中抑菌劑種類和含量的篩選以及抑菌劑穩定性的考察，并改進包裝材料，以確保產品的安全有效。

關鍵詞：硫酸慶大霉素滴眼液；抑菌劑；低密度聚乙烯滴眼劑瓶；羥苯乙酯

中圖分類號：R917，R978.1 文獻標志碼：A

Analysis of antimicrobial preservative used in domestic gentamicin

sulfate eye drops

Mei Qian， Zhang Tingting， Li Yitian， Li Jie， and Liu Ying

（Henan Provincial Institute for Drug and Medical Device Control， Henan Chemical Quality Evaluation and Control Engineering Technology Research Center， Zhengzhou 450018）

Abstract Objective To investigate the current situation and analyze the existing problems with the antimicrobial preservative in domestic gentamicin sulfate eye drops. Methods In order to evaluate the rationality of the antimicrobial preservative to be added to gentamicin sulfate eye drops， 23 batches of domestic gentamicin sulfate eye drops were analyzed by a newly established quantitative method for antimicrobial preservatives. The influence factor test， compatibility of antimicrobial preservative， and packaging material were also studied. Results The content of ethyparaben in gentamicin sulfate eye drops would decrease with the reduction of residual validity periods. Besides， it was proven that ethyparaben would be absorbed by low-density polyethylene bottles for eye drops. Conclusion Some problems existed with the usage of antimicrobial preservatives， such as hydroxyphenyl ethyl ester， in domestic gentamicin sulfate eye drops. It was suggested that enterprises should pay attention to the screening type and dosage of antimicrobial preservatives， ensure the stability of preservatives， and improve packing materials so as to guarantee the safety and effectiveness of the product.

Key words Gentamicin sulfate eye drops; Antimicrobial preservatives; Low-density polyethylene bottles for eye drops; Ethyparaben

硫酸慶大霉素是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有良好的抗菌作用[1]，其滴眼液為直接用于眼部的外用多劑量無菌液體制劑，主要用于治療結膜炎、角膜炎、眼瞼炎及瞼板腺炎等感染。為防止在使用過程中被微生物污染，多劑量眼用制劑一般應加適當抑菌劑[2]，但所有的抑菌劑都具有一定細胞毒性，用于人體可能產生安全性風險。目前各國都非常關注抑菌劑的安全性和有效性，國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）[3]和《英國藥典》[4]、《美國藥典》[5]均要求測定眼用制劑中抑菌劑的含量。我國對于滴眼液中抑菌劑的控制尚不完善，缺乏使用劑量和含量的控制研究，《中國藥典》2020年版二部收載了38個滴眼液品種，僅有11個列出抑菌劑含量檢查，可能造成抑菌劑選擇和使用不規范，存在潛在風險；其次，《中國藥典》2020年版四部通則中未收載統一規范的滴眼劑常用抑菌劑的檢測方法，不利于實施有效的監管[6]。

目前國內2家硫酸慶大霉素滴眼液在產企業添加的抑菌劑種類及濃度均為羥苯乙酯（0.3 mg/mL），但該品種現行標準中未收載抑菌劑檢查，本研究新建HPLC法考察樣品是否存在處方外違規使用抑菌劑的情況，并結合抑菌劑與包材的相容性等方面分析其抑菌劑應用的合理性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

e2695高效液相色譜儀（2998 PDA檢測器、2489紫外檢測器，美國Waters公司）；Ultimate 3000雙三元液相色譜儀（美國Thermo公司）；QE plus離子軌道阱高分辨質譜儀（美國Thermo公司）； XPE205電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

色譜級甲醇、乙腈（德國Merck公司），色譜級三乙胺、乙酸（北京百靈威科技有限公司），超純水由Millipore 純水儀制備，其余試劑均為分析純。

1.2 試藥

標準物質：羥苯甲酯（批號100278-201906）、羥苯乙酯（批號100847-201604）、羥苯丙酯（批號100444-202005）、硫柳汞鈉（批號135050-201401）、苯扎氯銨（批號100549-201805）、苯扎溴銨（批號135051-202002）均購自中國食品藥品檢定研究院，對羥基苯甲酸（批號LRAC5151）購自Sigma-Aldrich公司。

樣品：硫酸慶大霉素原料2批次（A企業與B企業各1批次），硫酸慶大霉素滴眼液23批次（A企業17批次，B企業6批次），低密度聚乙烯藥用滴眼劑瓶2批次（A企業與B企業各1批次）；輔料（包括硼酸、硼砂、羥苯乙酯，各1批次）均由A企業提供。

2 試驗方法及結果

2.1 抑菌劑含量測定

2.1.1 檢測波長的選擇

取羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉、苯扎氯銨和苯扎溴銨對照品溶液，采用二極管陣列檢測器分別在210～400 nm進行光譜掃描，結果顯示尼泊金類（羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯）均在257 nm附近有最大吸收，季銨鹽類（苯扎溴銨、苯扎氯銨）在263 nm處有最大吸收，有機汞類（硫柳汞）僅有末端吸收，無最大吸收。在214 nm波長處6種抑菌劑均有較大吸收，最終選擇檢測波長為214 nm。

2.1.2 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18（5 μm，4.6 mm× 150 mm），以1%三乙胺溶液（用磷酸調節pH值至3.05）為流動相A，甲醇為流動相B，按表1進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長214 nm。

2.1.3 溶液的制備

供試品溶液：精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液：精密稱（量）取羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉和苯扎溴銨對照品各適量，加水溶解并定量稀釋制成約含羥苯甲酯、羥苯乙酯和羥苯丙酯各6 μg/mL、硫柳汞20 μg/mL、苯扎溴銨100 μg/mL的混合溶液，作為對照品溶液（1）。另精密量取苯扎氯銨對照品適量，加水稀釋制成約含苯扎氯銨100 μg/mL的溶液，作為對照品溶液（2）（因苯扎氯銨由系列同系物組成，其中n-C12H25同系物的色譜峰與苯扎溴銨峰的保留時間一致，故苯扎氯銨對照品溶液需單獨配制）。

2.1.4 系統適用性試驗

稱（量）取羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉、苯扎氯銨和苯扎溴銨對照品各適量，加水溶解并定量稀釋制成約含羥苯甲酯、羥苯乙酯和羥苯丙酯各6 μg/mL、硫柳汞20 μg/mL、苯扎溴銨和苯扎氯銨各100 μg/mL的混合溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，結果各峰之間的分離度均不小于1.5，見圖1。

2.1.5 專屬性試驗

按制劑的處方比例分別稱取硫酸慶大霉素原料與輔料（硼酸、硼砂）適量，照“2.1.3”項下供試品溶液制備方法配制，得相當于慶大霉素0.1 mg/mL的空白輔料溶液。分別精密量取空白溶劑（水）與空白輔料溶液進樣，記錄色譜圖，見圖2。結果空白溶劑與輔料均不干擾6種抑菌劑的測定。

2.1.6 線性關系考察

精密稱取羥苯甲酯對照品13.18 mg、羥苯乙酯對照品11.98 mg、羥苯丙酯對照品12.23 mg，硫柳汞鈉對照品10.44 mg，精密量取苯扎溴銨對照品1 mL，苯扎氯銨對照品0.8 mL，分別加水溶解并定量稀釋，制成約含羥苯甲酯0.48 mg/mL、羥苯乙酯0.48 mg/mL、羥苯丙酯0.48 mg/mL、硫柳汞1 mg/mL、苯扎溴銨1 mg/mL和苯扎氯銨1 mg/mL的貯備液。精密量取上述各貯備液適量，用水定量稀釋制成不同濃度的系列混合線性溶液，其中苯扎氯銨線性溶液單獨配制（計算時以n-C12H25與n-C14H29同系物峰面積之和作為苯扎氯銨的峰面積），進樣，記錄色譜圖。結果6種抑菌劑的峰面積與濃度之間的線性關系均良好，見表2。

2.1.7 檢測限與定量限

精密量取“2.1.5”項下線性溶液，用水逐級稀釋。以信噪比S/N約為3：1計為檢測限，以信噪比S/N約為10：1為定量限，結果如表2所示。

2.1.8 精密度試驗

取“2.1.2”項下對照品溶液（1）和（2），分別連續進樣6針，記錄色譜圖，結果6種抑菌劑的峰面積RSD分別為0.3%（羥苯甲酯）、0.4%（羥苯乙酯）、0.8%（羥苯丙酯）、0.6%（硫柳汞）、0.5%（苯扎溴銨）、0.1%（苯扎氯銨），表明進樣精密度良好。

2.1.9 重復性試驗

取同一批次供試品（A企業，批號200802）6瓶，分別精密量取1 mL，各置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，進樣并記錄色譜圖，結果6份供試品溶液僅檢出羥苯乙酯，含量的RSD為0.8%，表明重復性良好。

2.1.10 回收率試驗

按制劑的處方比例分別稱取硫酸慶大霉素原料與輔料（硼酸、硼砂）適量，用水溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素0.1 mg/mL的空白輔料溶液。分別精密稱（量）取6種抑菌劑對照品適量，加空白輔料溶液溶解并定量稀釋，分別配制高、中、低濃度的溶液，各濃度平行配制3份。按外標法計算回收率，結果6種抑菌劑的回收率均良好，見表2。

2.1.11 穩定性試驗

取硫酸慶大霉素滴眼液（A企業，批號200802），照“2.1.3”配制供試品溶液。取該供試品溶液與“2.1.3”項下對照品溶液（1）和（2）于室溫放置，分別在第0、2、4、6、8和12 h時間點進樣，記錄色譜圖，以6種抑菌劑的峰面積為指標考察兩種溶液的穩定性。結果供試品溶液中羥苯乙酯峰面積RSD為0.2%，對照品溶液中各抑菌劑峰面積的RSD分別為0.3%（羥苯甲酯）、0.3%（羥苯乙酯）、0.5%（羥苯丙酯）、0.4%（硫柳汞）、0.3%（苯扎溴銨）、0.1%（苯扎氯銨），無明顯變化趨勢，表明各抑菌劑在室溫12 h內的穩定性良好。

2.1.12 耐用性試驗

取“2.1.4”項下系統適用性溶液，分別在改變色譜柱品牌、柱溫、流速與流動相pH值的條件下進樣，考察各抑菌劑之間的分離度，結果本方法在改變4種色譜柱品牌，柱溫±5 ℃，流速±20%，流動相pH值±0.05時，各峰之間的分離度均不小于1.5，表明該方法的耐用性良好。

2.1.13 樣品測定

按“2.1.3”項下的方法制備對照品溶液及供試品溶液，對2家生產企業的23批次硫酸慶大霉素滴眼液進行抑菌劑含量測定。結果2家企業樣品均僅檢出羥苯乙酯，與處方一致，未發現違規添加抑菌劑情況，其中A企業樣品中羥苯乙酯含量為標示量（0.3 mg/mL）的88.8%～97.0%，B企業樣品中羥苯乙酯含量為標示量（0.3 mg/mL）的74.6%～92.0%，見圖3。

2.2 羥苯乙酯含量與產品效期相關性分析

對2家企業遠、中、近/過效期共5批次（A企業3批次，B企業2批次）樣品中羥苯乙酯含量測定結果分別進行分析，結果每個企業樣品中羥苯乙酯的含量均隨產品剩余效期的減少而降低，見圖4，相關性分析顯示二者存在顯著正相關（雙尾顯著性值0.037＜0.05）。

2.3 影響因素試驗

擬采用影響因素試驗考察影響羥苯乙酯穩定性的因素，為制劑生產工藝、貯藏條件等制定及抑菌劑使用合理性提供依據。取2家企業各1批次樣品，通過高溫60 ℃（5、10和30 d取樣），高濕92.5%相對濕度、25 ℃（5和10 d取樣）和強光4500 Lx照射（5和10 d取樣）等影響因素試驗，測定其羥苯乙酯的含量。結果高濕與光照條件下，羥苯乙酯含量無明顯變化，但高溫條件下，隨放置時間延長，A企業樣品中羥苯乙酯含量由96.3%降至77.5%，B企業樣品中羥苯乙酯含量由91.2%降至65.1%。

2.4 羥苯乙酯與包材相容性

據文獻報道[7]，若高溫加熱時間較長，羥苯乙酯含量有明顯降低，降解產物含量增加。為考察高溫條件下，羥苯乙酯含量降低的原因是自身降解或包材吸附，模擬2家企業的處方工藝自制小樣，分別灌裝至其提供的低密度聚乙烯藥用滴眼劑瓶（以下簡稱“聚乙烯瓶”）中，密封，按“2.3”項下條件進行高溫試驗，同時以玻璃試管為對照進行平行試驗，采用LC-MS法對樣品進行分析，色譜柱為GL Sciences InertsilTM ODS-3（100 mm×3.0 mm，5 μm），流動相A為0.5%乙酸溶液，流動相B為乙腈，照表3梯度洗脫表進行洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量1 μL。質譜檢測器，ESI源（-），噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度350 ℃，輔助氣溫度350 ℃，輔助氣流量10 mL/min，鞘氣流量40 mL/min，掃描模式fullscan負離子模式，掃描起止時間2～10 min，掃描范圍m/z：120～145。

結果高溫60 ℃條件下，隨放置時間延長，兩種容器的自制樣品中羥苯乙酯的降解產物對羥基苯甲酸含量均緩慢增加，且增加量基本一致，表明高溫可使羥苯乙酯部分降解，見圖5A。但玻璃試管自制樣品中羥苯乙酯僅含量下降3.8%，聚乙烯瓶自制樣品中羥苯乙酯含量下降29.1%，見圖5B，提示高溫條件下，羥苯乙酯含量降低是由自身降解和聚乙烯瓶吸附共同導致，但降解量遠小于被吸附量，表明羥苯乙酯與聚乙烯瓶的相容性較差。

3 小結

由于抑菌劑存在一定的眼表毒性，其正確選擇和合理使用是保證眼用制劑安全、有效性的關鍵。理論上抗生素滴眼液一般并不需要額外添加較高濃度的抑菌劑，但長期以來我國在藥品研發、生產和檢驗過程中對抑菌劑使用重視不夠[8]，導致普遍存在抑菌劑濫用的現象，缺乏完善的抑菌劑有效性與安全性評價。

硫酸慶大霉素滴眼液在我國上市時間為1984年，早期處方研究不充分，目前由于各方面原因導致在產企業很少，更缺乏對其處方和包材選擇的合理性研究。本研究發現硫酸慶大霉素滴眼液貯存于低密度聚乙烯包裝材料中，隨著時間的推移抑菌劑羥苯乙酯含量會降低，并從羥苯乙酯與低密度聚乙烯瓶的相容性方面說明了該品種處方中抑菌劑使用存在一定問題，建議企業統籌考慮產品特點、抑菌作用以及穩定性等多方面因素完善抑菌劑合理使用的評價，并加強包材與抑菌劑相容性考察，改進包裝材料，確保產品的安全有效。

參 考 文 獻

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文章編號：1001-8689（2024）09-1019-06

收稿日期：2023-10-24

作者簡介：梅芊，女，生于1986年，碩士，副主任藥師，主要從事抗生素藥品質量分析與質量控制，E-mail： mmqqggll@163.com

*通信作者，E-mail： ying_leaf@263. net