老年醫院分離銅綠假單胞菌的耐藥性及耐消毒劑基因分析

摘要：目的 分析老年患者分離銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）的耐藥性和耐消毒劑基因的分布情況。方法 " 收集2019—2022年老年患者分離的111株PA，采用VITEK 2 Compact進行細菌鑒定和耐藥性分析，PCR法檢測耐消毒劑基因，采用SPSS 21.0對結果進行統計分析。結果 15種藥物中PA耐藥率最高的是左氧氟沙星（30.63%），最低的是多黏菌素B（1.80%），耐碳青霉烯銅綠假單胞菌（carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA）占比為23.42%（26/111），多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug-resistant PA，MDR-PA）占比為20.72%（23/111）。共檢出3種耐消毒劑基因：qacE⊿1-sulΙ、emrE及merA基因，陽性率分別為16.22%（18/111）、91.89% （102/111） 和46.85% （52/111），只有3株PA所有消毒劑基因均未檢出。消毒劑基因攜帶模式最多見為模式c（41.44%，46/111）；其次為模式f（36.94%，41/111）。CRPA組和非CRPA組之間、MDR組和非MDR組之間qacE⊿1-sulΙ檢測陽性率具有顯著差異。此外，MDR組qacE⊿1-sulΙ、emrE及merA基因同時檢出的比率顯著高于非MDR組。結論 老年患者分離PA中攜帶耐消毒劑基因的比率高，攜帶qacE⊿1-sulΙ基因與耐藥性之間可能存在一定的相關性。臨床需科學合理使用消毒劑和抗菌藥物，盡量減少細菌產生對兩者的抗性。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；消毒劑；耐藥性；老年患者

中圖分類號：R446.5 文獻標志碼：A

Analysis of drug resistance and disinfectant-resistant genes of Pseudomonas aeruginosa isolated from geriatric hospital

Li Yulin1， Tang Qiuping1， Dong Yena1， Hu Yang2， Long Zhiren3， Su Chengdan3， Zhang Xun3， Guo Ziqi3， and Cheng Xi1

（1 School of Laboratory Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500; 2 School of Clinical Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500; 3 Department of Laboratory Medicine， Chengdu 8th People's Hospital， Chengdu 610000）

Abstract Objective This study investigated the drug resistance and distribution of disinfectant-resistant genes among Pseudomonas aeruginosa （PA） isolated from geriatric patients. Methods A total of 111 clinical strains of PA were isolated from geriatric patients from 2019 to 2022. The bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing were carried out with VITEK 2 Compact. Then disinfectant-resistant genes were screened by PCR among these strains. Finally， SPSS 21.0 was used to analyze the results. Results Among the 15 drugs， levofloxaxcin had the highest drug resistance rate （30.63%） to PA， while polymyxin B had the lowest resistance rate （1.80%）. The proportion of CRPA was 23.42% （26/111）， and the proportion of MDR-PA was 20.72% （23/111）. Three disinfectant resistance genes were detected： qacE ⊿1-sulI， emrE and merA. The positive rates of the three were 16.22% （18/111）， 91.89% （102/111）， and 46.85% （52/111）， respectively. The situation where no disinfectant resistance gene was detected only occurred in three PA strains. The most common mode of carrying disinfectant resistance genes was pattern c （41.44%， 46/111）; next was pattern f （36.94%， 41/111）. There was a significant difference in the positive rate of qacE ⊿1-sulI between the CRPA group and the non-CRPA group （P）， and between the MDR group and the non-MDR group. In addition， the rate of simultaneous detection of qacE ⊿1-sulI， emrE and merA in the MDR group was significantly higher than that in the non-MDR group. Conclusion The proportion of strains carrying disinfectant-resistant genes in PA isolated from elderly patients was high. There might be a certain correlation between carrying qacE ⊿1-sulI and drug resistance. Clinical practice should require the scientific and rational use of disinfectants and antibiotics to minimize bacterial resistance to both.

Key words Pseudomonas aeruginosa; Disinfectants; Drug resistance; Geriatric patients

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）廣泛分布在水、土壤、植物及動物，人體的皮膚、呼吸道和腸道中，同時PA也存在于醫院環境，是臨床上引起醫院感染的重要條件致病菌。根據2020年和2021年全國細菌耐藥監測報告，PA在2020年和2021年臨床分離細菌中均排名第四，在革蘭陰性菌中分離率排名第三 [1-2]。新冠病毒感染控制期間，大規模使用消毒劑進行常規消殺以切斷病毒傳播途徑已經成為了重要的常態化手段。根據《2019新型冠狀病毒感染的肺炎疫源地消毒措施》，患者所有接觸使用的物品以及血液、分泌物、排泄物及可能污染的環境物體表面、空氣、空調系統等均應進行嚴格的消毒處理，執行預防性清潔消毒、隨時與終末消毒原則[3]。消毒劑的大量使用，有可能對環境中原本的微生態造成一定的影響，例如：可能引起醫院環境中細菌對某些消毒劑的抗性增加。而醫院環境中未被消殺徹底而存活的條件致病菌，有可能會引起免疫力低下患者的醫院感染，因此對其消毒劑抗性和耐藥性進行研究具有一定的臨床價值。本研究以醫院感染的重要病原菌、同時也是醫院環境中常見的PA為研究對象，對其耐消毒劑相關基因攜帶情況和耐藥性進行分析，以期為臨床消毒、預防和治療PA感染提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定和藥敏儀（法國Bio-Mérieux公司）、T100 PCR儀與水平電泳儀（美國Bio-Rad公司）、ChemiDoc化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）、哥倫比亞血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）、2×Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術有限公司）、DNA MarkerΙ和DP204 DNA產物純化試劑盒（天根生化科技有限公司）、引物合成（北京擎科生物科技股份有限公司成都分公司）。

1.2 菌株來源

收集成都市第八人民醫院（成都醫學院附屬老年醫院）2019—2022年臨床分離的PA 86株，共計111株非重復PA，所有菌株經VITEK 2 Compact鑒定。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，由成都醫學院附屬第一醫院檢驗科惠贈。

1.3 臨床信息收集

所有菌株來源患者的信息利用LIS在系統收集，包括標本類型、年齡、性別和臨床診斷等臨床信息。標本類型主要為痰液，占比為91.00%（101/111），尿液標本占比4.50%（5/111），膿液標本占2.70（3/111），肺泡灌洗液占1.80（2/111）。患者中男性61例，女性50例，大多數為患有慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的老年患者，平均年齡為（82.93±7.9）歲。前后兩組患者的年齡、性別比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

1.4 藥敏試驗

VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定和藥敏儀測定細菌對頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、妥布霉素、阿米卡星、氨曲南、環丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、亞胺培南、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、多黏菌素B和替卡西林/克拉維酸等15種常用抗菌藥物的藥敏結果，結果判讀依據2020年CLSI M100文件進行。

1.5 PCR檢測耐消毒劑基因攜帶情況

細菌DNA提取：取純培養的3～4個菌落至100 μL自制的lysis buffer中，混勻后置100 ℃金屬浴中加熱10 min，13000 r/min離心5 min，吸取上清液即為菌株DNA，置于-20 ℃冰箱保存。

耐消毒劑基因的引物序列參考程錦娥等[4-5]，見表1。 PCR反應體系包含：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，補雙蒸水至總體積25 μL。PCR擴增條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，退火1 min（表1），72 ℃ 1 min，30 cycles；72 ℃ 5 min。

1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，陽性產物DNA純化后送北京擎科生物科技股份有限公司成都分公司測序，測序結果于NCBI網站上與目的基因進行BLAST比對。

1.6 統計學分析

采用SPSS19.0進行統計學分析。計數資料采用例數和百分比描述，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥性分析

由表2可見，PA對15種抗生素耐藥率最高的是左氧氟沙星（30.63%），其次是環丙沙星（28.83%）；耐藥率最低的是多黏菌素B（1.80%），其次是阿米卡星（2.70%）。對亞胺培南和美羅培南的耐藥性分別為22.52%和9.91%。111株PA中共有26株對亞胺培南和美羅培南中的一種或兩者都耐藥，即耐碳青霉烯銅綠假單胞菌（CRPA）占比達到23.42%（26/111）；多重耐藥銅綠假單胞菌（MDR-PA）共有23株，占比達到20.72%（23/111），其中18株都是CRPA。

2.2 耐消毒劑基因分布情況

本研究檢測的9種耐消毒劑基因中，只檢出了qacE⊿1-sulΙ 、emrE和merA共3種耐消毒劑基因。其中qacE⊿1-sulΙ基因陽性株數最少，為18株，陽性率為16.22% （18/111）；emrE基因檢出最多，為102株，陽性率為91.89% （102/111） ；merA基因檢出52株，陽性率為46.85% （52/111），其他基因均未檢出，詳見圖1。

由表3可見，在111株PA中3種消毒劑耐藥基因qacE⊿1-sulΙ、emrE和merA共有7種攜帶模式，最多見為模式c，占比41.44%（46/111）；其次為模式f（36.94%，41/111）。無論在CRPA還是非CRPA中，都是以模式c和模式f最為多見。有8株PA（7.21%，8/111）同時檢出3種耐消毒劑基因，即模式g。在CRPA中模式g的比例（15.38%，4/26）高于非CRPA中的比例（4.71%，4/85）。所有耐消毒劑基因均未檢出的情況，即模式a，只存在于3株非CRPA中。

由表4可見，消毒劑耐藥基因中只有qacE⊿1-sulΙ的檢出陽性率在CRPA組和非CRPA組之間存在顯著性差異（P＜0.05），同樣在MDR組和非MDR組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。此外，MDR組和非MDR組之間3種耐消毒劑基因全部檢出陽性的情況也存在顯著性差異。

3 討論

自2019年新型冠狀病毒感染發生以來，全球消毒劑的使用量激增，在防止疫情擴散方面起到了有效的作用。但是正如濫用藥物可引起細菌產生耐藥性，消毒劑的過量使用也可能會誘導細菌產生對消毒劑的抗性。細菌對消毒劑產生抗性的機制與耐藥性機制類似，包括細胞膜通透性的降低、改變消毒劑作用靶點、質粒介導的消毒劑抗性和主動外排泵系統，產生相關特異性酶分解有害物質等[6]。研究發現細菌對小分子化合物類消毒劑、滅菌劑產生抗性的主要機制為細菌外排泵系統增強，小分子化合物被排出所致[7]。細菌耐藥性產生的機制與耐消毒劑的機制類似[8]，可分為天然性耐藥和獲得性耐藥，天然性耐藥由染色體遺傳基因介導而代代相傳；獲得性耐藥一般由攜帶有耐藥基因的質粒介導，可在不同細菌種屬間傳播。如：研究者在金黃色葡萄球菌和產氣腸桿菌中發現位于質粒和轉座子上的耐消毒劑基因[9-10]。細菌耐消毒劑和耐藥性產生的機制有交叉之處，如消毒劑耐藥基因qacE⊿1-sulΙ可同時導致細菌耐磺胺類藥物和常見消毒劑[11]，有的細菌外排泵既可以外排抗菌藥物又可以外排消毒劑，如：Anteneh發現銅綠假單胞菌可同時對多種抗生素和消毒劑產生交叉耐藥性，其主要機制是調節基因mexR、nalC或nalD及相應氨基酸突變導致的MexAB-OprM藥物外排泵的過度表達[12]。因此細菌耐消毒劑和耐藥性可能存在一定的關系。對于細菌耐藥性一直是全球關注的重點，但是目前對于消毒劑抗性的關注還比較有限。

本研究對PA菌株中進行9種耐消毒劑基因的攜帶情況和耐藥性研究，檢出的耐消毒劑基因共3種：qacE⊿1-sulΙ、emrE和merA。其中emrE基因陽性率最高（91.89%，102/111） ，merA基因其次（46.85%，52/111）。僅有3株PA的9種耐消毒劑基因檢測都為陰性，同時，這3株菌對所檢測的藥物也均顯示敏感。耐消毒劑基因qacE⊿1-sulΙ、emrE和 merA的攜帶模式以模式c（-+-）和模式f（-++）最為多見，占比分別為41.44%和36.94%。所有檢出的消毒劑基因中qacE⊿1-sulΙ基因陽性率雖然最低（16.22%， 18/111）；但是無論是在CRPA組還是MDR-PA組，qacE⊿1-sulΙ基因檢出陽性率都顯著高于非CRPA和非MDR-PA組，提示該耐消毒劑基因可能與細菌耐藥性具有一定的相關性。qacE⊿1-sulΙ屬于表達多種消毒劑外排泵的Qac基因家族，位于一類整合子3'保守端，qacE⊿1為消毒劑氯已定的耐藥基因，sulΙ為磺胺耐藥基因[4]。emrE編碼的EmrE蛋白首次發現于大腸埃希菌中，對乙錠和甲基紫精（又名百草枯二氯化物，是1種速效滅生性觸殺性除草劑）具有抗性[13]。merA基因編碼汞離子還原酶，細菌產此酶一般耐受汞離子滅菌劑。本研究的qacE⊿1-sulΙ基因檢出陽性率低于程錦娥等報道的80.9%和鄧晶榮等[14]報道的60.0%，這可能與不同地區不同時期細菌特性、消毒劑使用的種類和劑量情況有關。本院常用消毒劑為含氯消毒液和75%酒精，可能對細菌產生一定的選擇性壓力。

本研究中老年患者分離PA的耐藥性與山東老年慢阻肺急性發作（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）患者分離的PA耐藥性相比，對左氧氟沙星、環丙沙星的耐藥率都接近30%，但我院亞胺培南和美羅培南的耐藥率更低[15]。根據全國細菌耐藥監測網數據，2021年銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率全國平均為17.7%[2]，而本研究中PA對碳青霉烯類藥物的耐藥率（23.42%）高于全國平均值，這可能與老年患者多患有慢性基礎疾病長期用藥有關，這一點與監測報告中，65歲以上患者分離PA對亞胺培南（28.8%）的耐藥率在所有年齡段中最高較為一致[16]。PA容易感染免疫力低下的人群，尤其是對于患有COPD的老年人容易引起呼吸道感染。慢性阻塞性肺疾病急性加重抗感染治療中國專家共識顯示，與國外不同，我國老年AECOPD下呼吸道感染病原菌以革蘭陰性桿菌為主，尤其是PA和肺炎克雷伯菌分離率位居前列，對于社區發病的AECOPD患者需評估PA感染危險因素并進行分層治療[17]。因此對于老年COPD患者，尤其要注意PA感染引發AECOPD的風險。本研究中MDR-PA占比20.72%，低于2019—2020年革蘭陰性菌監測報告中MDR-PA占比39.7%[16]。臨床應注意合理用藥，減少CRPA和MDR-PA的產生。

國外學者發現亞致死濃度的消毒劑可以提高革蘭陰性菌，如陰溝腸桿菌、大腸埃希菌和PA的耐藥性，其機制有：亞致死濃度的消毒劑可促進水平基因元件，如質粒和轉座子的轉移；苯扎氯銨可誘導PA中MexCD-OprJ多重藥物外排泵的表達[18]。正確適當的消毒方式可能不會影響細菌的耐藥性；但如果消毒劑的使用不合理，促使細菌產生抗性，消毒劑抗性基因也能通過質粒、噬菌體等可移動遺傳元件進行傳播，有時消毒劑和藥物通過同一機制（如：外排泵）產生抗性，則存在提高細菌耐藥性的可能。所以需要在醫院環境中在劑量濃度和時長上均合理規范使用消毒劑，達到殺死細菌的效果，避免細菌對消毒劑和藥物的抗性增強。如果醫院感染控制措施到位，也可能使得醫院環境中的PA與臨床分離的PA無交叉，在吳泰順等[19]的研究中，醫院感染中內源性感染是主要途徑，PA更多來自于患者自身的定植菌，而非外部環境。

滅菌率與滅菌時間和劑量呈正相關，消毒劑用量不足會導致消毒不徹底甚至消毒失敗，引起細菌對消毒劑的抗性，增加發生醫院感染的風險[20]；同樣消毒劑濫用也可導致不良后果，如：醫院環境消毒大量使用含氯消毒劑，稀釋的次氯酸鈉是可直接被皮膚吸收，可導致過敏反應。此外，在意外吸入和攝入后會引發人體出現如惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道疾病和腎臟問題[21]。同時消毒劑由于長期或過量使用，進入環境后不斷富集，可能對環境微生態產生影響，微生物會通過表型適應、基因突變和水平基因轉移等方式提高對消毒劑的耐受性或產生抗性基因，這些消毒劑抗性基因可通過食物或環境等傳播給人，這可能會給醫療健康帶來更多負擔[22]。因此臨床需要認真考慮調整消毒劑種類、劑量和適用范圍，嚴格按照說明書使用劑量和適用范圍進行操作，不定期地更換消毒劑，才能減少該類事件發生。

參 考 文 獻

全國細菌耐藥監測網. 2020年全國細菌耐藥監測報告[J]. 中華檢驗醫學雜志， 2022， 45（2）： 122-136.

全國細菌耐藥監測網. 2021年全國細菌耐藥監測報告[J]. 中華檢驗醫學雜志， 2023， 46（6）： 566-581.

魏秋華， 任哲. 2019新型冠狀病毒感染的肺炎疫源地消毒措施[J]. 中國消毒學雜志， 2020， 37（1）： 59-62.

程錦娥， 朱科衡， 鄒澤鵬， 等. 銅綠假單胞菌耐消毒劑基因檢測[J]. 中國微生態學雜志， 2015， 27（11）： 1288-1290.

孫海平， 林寧. 多藥耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株發現tehA基因[J]. 臨床檢驗雜志， 2011， 29（1）： 13-15.

張可玟， 胡泓， 陳剛. 微生物消毒劑抗性機理[J]. 生物化學與生物物理進展， 2022， 49（1）： 34-47.

Meier A B， Guldimann C， Markkula A， et al. Comparative phenotypic and genotypic analysis of Swiss and Finnish Listeria monocytogenes isolates with respect to benzalkonium chloride resistance[J]. Front Microbiol， 2017， 8： 397.

劉運德， 樓永良. 臨床微生物學檢驗技術[M]. 北京： 人民衛生出版社， 2016： 51-52.

Mitchell B A， Brown M H， Skurray R A. QacA multidrug efflux pump from Staphylococcus aureus： Comparative analysis of resistance to diamidines， biguanidines， and guanylhydrazones[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1998， 42（2）： 475-477.

Ploy M C， Courvalin P， Lambert T. Characterization of In40 of Enterobacter aerogenes BM2688， a class 1 integron with two new gene cassettes， cmlA2 and qacF[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1998， 42（10）： 2557-2563.

陳茶， 黃彬， 藍鍇， 等. 銅綠假單胞菌“泛耐株”耐藥相關基因研究[J]. 中國抗生素雜志， 2009， 34（2）： 111-113.

Amsalu A， Sapula S A， De Barros Lopes M， et al. Efflux pump driven antibiotic and biocide cross-resistance in Pseudomonas aeruginosa isolated from different ecological niches： A case study in the development of multidrug resistance in environmental hotspots[J]. Microorganisms， 2020， 8（11）： 1647.

Ninio S， Rotem D， Schuldiner S. Functional analysis of novel multidrug transporters from human pathogens[J]. J Biol Chem， 2001， 276（51）： 48250-48256.

鄧晶榮， 牟鳳林， 邵林， 等. 多耐藥銅綠假單胞菌抗藥基因檢測及對常用消毒劑的抗性分析[J]. 甘肅醫藥， 2017， 36（7）： 562-564.

徐紅天， 張麗， 顧騰振， 等. 老年AECOPD患者下呼吸道感染炎性因子及銅綠假單胞菌毒力基因與耐藥性[J]. 中華醫院感染學雜志， 2023， 33（3）： 330-334.

李耘， 鄭波， 呂媛， 等. 中國細菌耐藥監測（CARST）研究2019—2020革蘭陰性菌監測報告[J]. 中國臨床藥理學雜志， 2022， 38（5）： 432-452.

慢性阻塞性肺疾病急性加重抗感染治療中國專家共識編寫組. 慢性阻塞性肺疾病急性加重抗感染治療中國專家共識[J]. 國際呼吸雜志， 2019， 39（17）： 1281-1296.

Kampf G. Biocidal agents used for disinfection can enhance antibiotic resistance in Gram-negative species[J]. Antibiotics （Basel， Switzerland）， 2018， 7（4）： 110.

吳泰順， 肖錦暉， 張勤， 等. 銅綠假單胞菌醫院感染與外環境關系的研究[J]. 中國公共衛生， 2004， 20（6）： 680-682.

Labreck P T， Bochi L A C， Stanbro J， et al. Systematic analysis of efflux pump-mediated antiseptic resistance in Staphylococcus aureus suggests a need for greater antiseptic stewardship[J]. mSphere， 2020， 5（1）： e00959-l9.

Dhama K， Patel S K， Kumar R， et al. The role of disinfectants and sanitizers during COVID-19 pandemic： Advantages and deleterious effects on humans and the environment[J]. Environ Sci Pollut R， 2021， 28（26）： 34211-34228.

Mahmood A， Eqan M， Pervez S， et al. COVID-19 and frequent use of hand sanitizers; human health and environmental hazards by exposure pathways[J]. Sci Total Environ， 2020， 742： 140561.

文章編號：1001-8689（2024）09-1032-06

收稿日期：2023-11-06

基金項目：四川省大學生創新創業訓練計劃項目（No. S202213705057）；成都醫學院四川養老與老年健康協同創新中心項目（No. 19Z12）

作者簡介：李玉林，女，生于2001年，主要從事細菌的耐藥機制，E-mail： 3447565155@qq.com

*通信作者，E-mail： cissi7@foxmail.com