植物同源域指蛋白6對肝癌Hep-G2細胞遷移能力的影響

【摘要】目的 探討植物同源域指蛋白6（PHF6）對肝癌Hep-G2細胞遷移能力的影響，為臨床診療提供參考。方法 根據癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫分析PHF6在人正常肝臟和肝癌組織的表達情況，以及其表達對300余例肝癌患者近十年生存率的影響。比較siNC組（轉染PHF6無義序列）和siPHF6組（轉染siRNA-PHF6）細胞PHF6 RNA表達水平，利用劃痕和Transwell實驗檢測兩組細胞遷移能力，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測兩組細胞上皮間質轉化（EMT）相關基因表達情況。結果 PHF6在肝癌患者中存在明顯過表達現象，高表達PHF6患者存活率降低。轉染48 h后，siPHF6組細胞中PHF6 RNA表達水平低于siNC組（P=0.0016）。劃痕后12、24、48、72 h，siPHF6組細胞劃痕距離均大于siNC組，siPHF6組細胞遷移數量小于siNC組。與siNC組相比，siPHF6組細胞神經鈣黏蛋白（CDH2）、纖連蛋白（FN1）的表達水平均降低，CDH1的表達水平升高（Plt;0.0001、Plt;0.0001、P=0.0018）。結論 沉默PHF6可顯著抑制肝癌細胞的遷移和EMT進程，靶向PHF6治療肝癌具有應用前途。

【關鍵詞】植物同源域指蛋白6；肝癌；Hep-G2；上皮間質轉化

【中圖分類號】R394 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2025.02.0045.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2025.02.014

肝癌是全球死亡率排名第三的癌癥，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是原發性肝癌的主要類型，占85%～90%[1-2]。目前，肝切除手術和肝移植能顯著延長早期HCC患者的生存時間，但晚期患者復發率高、預后較差[3-4]。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是指上皮細胞轉化為具有遷移能力的間充質細胞的過程。在這一過程中，上皮細胞逐漸失去黏附性，并明顯表現出間充質細胞的特征，即細胞角蛋白Cytokeratins、上皮細胞鈣黏蛋白（CDH1）等上皮細胞標志物的表達下調，神經鈣黏蛋白（CDH2）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（FN1）等間充質細胞標志物的表達增強[6]。癌癥分子靶向治療對治療肝細胞癌具有重要臨床意義。植物同源域指蛋白6（PHF6）是一種位于細胞核的染色質結合調節蛋白，具有轉錄調控功能。該基因位于人類染色體Xq26.3，屬于X連鎖基因，其突變在B?rjeson-Forssman-Lehmann綜合征中被發現[7-8]。 PHF6幾乎表達于所有組織，對神經發育和造血很重要。在造血干細胞中敲除PHF6，可增加細胞自我更新能力，驅動血癌發生，因此PHF6被認為是一種抑癌基因[9-10]。敲除PHF6損害細胞增殖使其停滯在G（2）/M期，表明PHF6缺乏導致細胞DNA損傷的積累[11]。然而， PHF6是否影響肝癌生長和轉移及作用機制尚未報道。基于此，本研究探究PHF6對肝癌細胞Hep-G2遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和分組 取Hep-G2肝癌細胞株（購自美國模式培養保藏中心），在飽和濕度細胞培養箱內培養（5% CO2、 37 ℃），培養基含有10%胎牛血清（FBS）（購自Sigma公司）和1%青鏈霉素的DMEM（購自Gibco公司）。細胞融合率達≥80%時用0.25%的胰酶（購自Gibco公司）37 ℃消化1 min后傳代。實驗分為siNC組（轉染 PHF6無義序列）、 siPHF6組（轉染siRNA-PHF6），每組使用的細胞數均為8×104個/ml細胞，每組設置3組重復實驗。

1.2 轉染PHF6基因 將8×104個/ml Hep-G2細胞接種于6孔板，每孔2 mL培養液，培養8～12 h，融合率達40%進行轉染實驗。將轉染試劑 Lipofectamine ? RNAiMAX Reagent （購自Invitrogen公司）9 μL稀釋于150 μL Opti-MEM? Medium中，同時將2 μL（30 pmol）siRNA 儲存液加入150 μL opti-MEM? Medium中混合，室溫孵育5 min 后將二者混勻， 4 ℃ 孵育15 min后滴加到對應孔中，培養6 h后更換培養液， 24～48 h后進行后續實驗。 siRNA-PHF6核酸序列如下：正義鏈， 5＇-GGCCUACAAGACAGCGCAATT3＇-；反義鏈：5＇-UUGCGCUGUCUUGUAGGCCTT3＇-，由金拓思（武漢）生物科技有限公司進行設計并合成。

1.3 劃痕實驗 將轉染后的siNC組和siPHF6組細胞進行培養，細胞融合度≥90%時用10 μl槍頭垂直劃痕，隨后用磷酸鹽緩沖液（購自Gibco公司）清洗細胞，去除雜質和脫落的細胞，于培養0、 12、 24、 48、 72 h拍照記錄相同位置細胞的遷移變化，統計不同組別間細胞遷移差異。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應 在6孔板的每孔Hep-G2細胞中添加500 μl Trizol裂解液（購自TAKARA）以提取RNA，隨后測定提取RNA的濃度，并通過凝膠電泳實驗對其質量進行檢測。利用PrimeScriptTMII cDNA Synthesis Kit（購自TAKARA）進行反轉錄，稀釋反轉錄產物cDNA，以此作為實時熒光定量聚合酶鏈式反應的模板。檢測兩組細胞基因表達變化，實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物序列，見表1。反應條件：起始95 ℃、 5 min；隨后變性溫度為95 ℃，維持 15 s，退火溫度為60 ℃，維持30 s，此過程共進行40個循環。根據2-△△CT方法計算基因表達差異， 18S作為內參。

1.5 Transwell遷移實驗 使用Transwell小室（孔徑8 μm，購于Corning公司）進行遷移實驗，轉染后的細胞重懸于200 μL不含血清的DMEM溶液中，然后接種于上室。下室加入500 μL含10 % FBS的DMEM培養基作為催化劑。 37 ℃孵育24 h后，將已遷移至下室的細胞用100%甲醇在室溫下固定30 min，利用0.5%結晶紫溶液進行30 min染色。對染色細胞進行觀察，顯微鏡拍照。

1.6 數據統計 使用GraphPad Prism 9軟件對實驗數據進行統計分析并繪圖，數據表示為（mean±SEM）；兩組間比較進行Student t-test分析；對癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中患者生存率進行對數秩檢驗分析。0.01lt;Plt;0.05標記為*， 0.001lt;Plt;0.01標記為**， Plt;0.001標記為***，Plt;0.0001標記為****。

2 結果

2.1 TCGA數據庫肝癌患者存活率分析 PHF6在肝癌患者中存在明顯過表達現象，見圖1-A；高表達PHF6患者存活率降低，見圖1-B、圖1-C。

2.2 兩組細胞PHF6 RNA表達水平比較 轉染48 h后， siPHF6組細胞PHF6 RNA表達水平低于siNC組（P=0.0016），見圖2。

2.3 劃痕、Transwell實驗結果分析 劃痕后12、 24、 48、 72 h， siPHF6組細胞劃痕距離均大于siNC組，見圖3-A、圖3-B。 siPHF6組細胞遷移數量小于siNC組，見圖3-C。

2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應分析結果 與siNC組相比， siPHF6組細胞CDH2、 FN-1的表達水平降低， CDH1的表達水平升高（Plt;0.0001、 Plt;0.0001、 P=0.002），見圖4。

3 討論

PHF6的體細胞功能突變在T細胞急性淋巴細胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）中非常普遍，也存在于急性骨髓白血病（acute myeloid leukemia，AML）中，且敲除PHF6基因的造血干細胞（HSC）的重建和自我更新能力增強，這均表明PHF6可能是一種抗癌基因[12-14]。然而，PHF6在乳腺癌和結直腸癌中顯著高表達，提示PHF6可能參與其他惡性腫瘤，本研究將探討其在肝癌中的作用機制。

本研究結果顯示，PHF6在肝癌患者中存在明顯過表達現象，高表達PHF6患者存活率降低；轉染48 h后，siPHF6組細胞中PHF6的RNA表達水平低于siNC組；劃痕后12、24、48、72 h，siPHF6組細胞劃痕距離均大于siNC組，siPHF6組細胞遷移數量小于siNC組；與siNC組相比，siPHF6組細胞CDH2、FN-1的表達水平降低，CDH1的表達水平升高。分析原因為，EMT是指上皮細胞失去相互連接和極性，轉化為間質細胞的現象。這一過程的激活是上皮癌細胞獲得惡性表型的核心機制，也是癌癥轉移和侵襲的重要環節[15]。因此，抑制EMT會干擾腫瘤的進展。敲低PHF6可能通過上調E-cadherin和下調N-cadherin和Fibronectin-1來抑制EMT過程，繼而肝癌細胞Hep-G2細胞的遷移能力減弱。

此外， PHF6能招募組蛋白賴氨酸甲基轉移酶SUV39H1至rDNA（核糖體DNA）區域，并借助SUV39H1的三甲基化酶活性來提升rDNA區域組蛋白H3的9位賴氨酸殘基甲基化（H3K9me3）的水平，從而抑制rDNA轉錄。敲低PHF6則能夠通過促進 rDNA的轉錄，進而增強細胞增殖和腫瘤生長[16]。但在T-ALL和AML的小鼠動物模型中，敲低PHF6后腫瘤增長速率卻加快；而在小鼠的急性B細胞淋巴白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）模型中，通過慢病毒技術敲低PHF6后，觀察到腫瘤的增長速率顯著減緩[17]。本研究證明敲低PHF6可抑制肝癌細胞的遷移，進而起到治療肝癌的作用，但這是否也是PHF6作為轉錄因子調控表觀遺傳進程來實現的，仍需進一步研究。

綜上所述，沉默PHF6可顯著抑制肝癌細胞的遷移和EMT進程，靶向PHF6治療肝癌具有應用前途。通過基因編輯技術降低PHF6的表達或開發PHF6的小分子抑制劑，特異性地降低PHF6的表達或功能，從而抑制肝癌細胞的生長和轉移，可作為肝癌治療的新思路。

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