花生冠腐病病原菌的分離鑒定及生物學特性研究

摘要為減少冠腐病對花生生產帶來的損失，從安徽省不同花生產區采集冠腐病病株分離病原菌，對其進行致病性測定、形態鑒定和分子生物學鑒定，并對其生物學特征進行研究，室內篩選抑菌效果較好的化學藥劑。結果表明，引起安徽省花生冠腐病的病原菌為黑曲霉（Aspergillusniger），該菌的致死溫度為59℃（15min），在pH7的PDA培養基上生長最快。藥劑篩選結果表明，50%多菌靈可濕性粉劑和43%戊唑醇懸浮劑效果最好；75%百菌清可濕性粉劑次之；其次是70%代森錳鋅可濕性粉劑；3%甲霜惡霉靈水劑與對照無明顯差異。

關鍵詞花生冠腐病；黑曲霉；分離鑒定；抑菌作用

中圖分類號S435.652"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2025）01-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

IsolationandIdentificationofthePathogenofPeanutCrownRotandItsBiologicalCharacterisiticsResearch

ZHUXiao-feng，WANGSong，JIANGTaoetal

（CropResearchInstitute，AnhuiAcademyofAgriculturalSciences/AnhuiKeyLaboratoryofCropQualityImprovement，Hefei，Anhui230031）

AbstractToreducethelosscausedbypeanutcrownrotonpeanutproduction，thepeanutcrownrotdiseaseplantswerecollectedfromdifferentpeanutgrowingareasinAnhuiProvince.Thepathogenwasisolated，andthepathogenicity，morphologyandmolecularbiologyofpathogenswereidentified.Anditsbiologicalcharacteristicswerestudied，chemicalagentswithbetterantibacterialeffectsindoorswerescreened.TheresultsconfirmedthatthepathogenofpeanutcrownrotinAnhuiProvincewas"Aspergillusniger，whichhadalethaltemperatureof59℃（15min），andthefastestgrowinginthemediumofpH7.Thedrugscreeningresultsindicatedthat50%carbendazimWPand43%tebuconazoleSChadthebestinhibitoryeffect;75%chlorothalonilWPfollowed;nextwas70%mancozebWP;3%metalaxyl-hymexazolAChadnosignificantdifferencefromtheCK.

KeywordsPeanutcrownrot;Aspergillusniger;Isolationandidentification;Fungistaticaction

基金項目財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系項目（CARS-13-合肥綜合試驗站）；安徽省油料作物產業技術體系。

作者簡介朱曉峰（1989—），女，安徽無為人，助理研究員，博士，從事花生抗病遺傳育種研究。*通信作者，研究員，碩士，從事花生種質資源鑒定和創新研究。

花生（ Arachis hypogasa "L.）是我國主要的油料和經濟作物。近年在農業生產中越來越受到重視，種植面積逐年增長，2021年全國花生種植面積超過48萬hm 總產超過1 830萬t，再創歷史新高（2022年國家統計局數據）?；ㄉ诟。╬eanut crown rot disease）是危害花生主要土傳病害之一，多在花生出苗至團棵期發生，成株期較少，是花生苗期的主要病害。該病害影響范圍廣泛，在我國花生各產區均有發生，對我國很多花生產區均存在潛在的威脅，尤其在山東、河南、江西、山西、福建等省已有大面積發生^［1-4］。冠腐病在花生上的危害最早于1926年被Jochem^［5］首次報道?；ㄉ诟∈且环N世界性的土傳病害，印度和美國每年因冠腐病造成的花生產量損失均在5%左右，嚴重的可達40%^［6］。目前已知引起花生冠腐病的病原菌主要是黑曲霉^［5-9］，但不同地理區域花生冠腐病的病原菌是否存在差異還有待研究。冠腐病在國內花生上危害較小，一般不造成大的經濟損失，國內學者并未進行系統的研究。近年來，受農業結構調整、秸稈還田等因素影響，該病害發生明顯有加重的趨勢，才逐漸受到國內學者的重視。

冠腐病在安徽省花生主產區固鎮、泗縣、肥東等地常有發生。安徽省夏花生苗期常出現高溫高濕天氣，適合冠腐病發生。一旦發病，會造成植株枯萎、缺苗斷壟的現象，嚴重影響花生的產量和品質。為明確安徽省花生冠腐病的病原菌，筆者對安徽省花生產區的冠腐病株進行多年多點采樣，并進行分離鑒定，經過形態學及分子鑒定，證實該病害病原菌為黑曲霉（Aspergillusniger）。同時，為篩選防治花生冠腐病的藥劑，選擇5種常用的殺菌劑進行室內藥劑對比試驗，篩選出效果最好的殺菌劑，進而為花生冠腐病的有效防治提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試樣品：2019—2021年花生生育期間，從安徽省固鎮縣、泗縣、肥東縣等不同花生產區采集冠腐病典型病株。

供試培養基：PDA培養基、花生秸稈培養基、大豆培養基、麥粒培養基，培養基的具體制作方法參照張建航等^［10］。

供試藥劑：75%百菌清可濕粉劑、50%多菌靈可濕粉劑、70%代森錳鋅可濕粉劑、3%甲霜惡霉靈水劑、43%戊唑醇懸浮劑。

1.2病原菌的分離與純化

取病株莖基部的病部組織，采用組織分離法，將其切成大小2mm×2mm的小組織塊，表面消毒后，置于PDA培養基上，30℃恒溫培養2～3d，在單菌落邊緣挑取菌絲，轉接到新的PDA培養基上，轉接純化3～4次。純化后的病原菌4℃保存備用。

1.3病原菌的鑒定

1.3.1病原菌的形態鑒定。

取純化后的病原菌菌絲約6mm置于PDA平板中央，倒置培養7d左右，每天肉眼觀察菌落形態特征和大小，并待孢子產生后，挑取少量菌絲體制片，在顯微鏡下觀察分生孢子形態。

1.3.2病原菌的ITS鑒定。

取50～100mg的菌絲，使用真菌DNA提取試劑盒提取菌絲總DNA，試劑盒從生工生物（上海）股份有限公司購買。引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對病原菌DNA進行PCR擴增。10μL反應體系：2×Taq"PCRMasterMix5μL，10μmol/L上、下游引物ITS1和ITS4各0.4μL，DNA模板1μL（約100ng），加入滅菌的ddH2O6.7μL。PCR擴增程序：95℃變性5min；94℃變性35s，55℃退火55s，72℃延伸1min，此過程共36個循環；循環結束后，72℃補充延伸10min。擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產物送至生工生物（上海）股份有限公司測序。在NCBI網站上利用BLAST搜索同源序列，并與已知序列進行序列比對與分析。

1.4致病性測定

以YH1、1016、9102這3個品種為試驗材料，催芽后先孢子懸浮液侵染種子，然后再以麥粒為接種體，對病原菌進行致病性測定。純化后的菌絲在PDA培養基上30℃培養7d左右，用無菌水洗下病原菌孢子，制成濃度1.0×106個/mL的孢子懸浮液，3個供試花生品種的種子置于孢子懸浮液中30℃侵染過夜后，分別種于無菌土中。待花生子葉剛長開時，在花生基部用無菌刀切約4mm2的小口，將接種過菌絲的麥粒均勻埋在植株莖稈與土層交界處四周，以正常生長不作任何處理的花生植株為對照。觀察接種后的發病植株與田間癥狀是否表現一致，從發病植株的莖基部分離病原菌，與接種菌進行對比。

1.5生物學性狀研究

1.5.1病原菌在不同培養基中的生長情況。

將菌絲分別轉接于PDA、麥粒、大豆和花生秸稈制成的4個培養基上，30℃培養3d，每種培養基設3個重復，每天觀察菌絲生長情況，記錄菌落的直徑大小。

1.5.2病原菌在不同pHPDA平板中的生長情況。

共設8個不同pH（pH5～1梯度為1）的PDA培養基處理，將菌絲分別接種于不同處理的培養基上，每個處理3次重復，30℃培養3d，每天記錄菌落的直徑。

1.5.3不同溫度處理對菌絲生長的影響。

共設50～64℃（每處理差1℃）15個處理，將大小一致、直徑2mm的菌絲塊分別放入加過100μL無菌ddH2O的離心管中，每處理3次重復，共45管，分別恒溫水浴15min后，接種于PDA平板上，30℃培養，第2天記錄菌落直徑。

1.65種化學試劑的抑菌作用

藥劑配制：75%百菌清可濕粉劑配成濃度1.43g/L，即75%百菌清可濕粉劑0.1g用70mL無菌水溶解；50%多菌靈可濕粉劑0.1g對無菌水50mL溶解；70%代森錳鋅可濕粉劑0.1g用80mL無菌水溶解；3%甲霜惡霉靈水劑1500倍液，即3%甲霜惡霉靈水劑1mL對無菌水至1500mL；43%戊唑醇懸浮劑3500倍液，即43%戊唑醇懸浮劑100μL對無菌水至350mL。

藥劑處理：在無菌操作臺上，每種藥劑用移液槍分別取200μL，使用涂抹棒將藥劑均勻地涂布在PDA平板上，然后將菌絲轉接到中央，以涂抹200μL滅菌水的培養基為對照，每處理4次重復，30℃培養3d，每天記錄菌落的擴展直徑。

2結果與分析

2.1花生冠腐病田間發病癥狀

2019—2021年花生生育期間，對安徽省花生產區冠腐病田間發病情況調查表明，該病害主要危害花生植株根頸部（圖1A）。出苗前發病時，種仁腐爛，病部長出松軟的黑色霉狀物；出苗后發病時，病原先侵染幼苗的子葉和胚軸，然后侵染莖基部，被侵染組織四周被黑色的孢子所覆蓋。隨著病情加重，病斑逐漸擴大，整個根頸區變成黑褐色并潰爛，最后幼苗枯萎死亡（圖1B、C）。

2.2病原菌的形態學鑒定

菌落在PDA培養基上呈圓形，四周呈黃色。菌絲初為白色絨毛狀，后期上面長滿黑色的分生孢子，4～5d長滿直徑9cm的培養皿（圖2A、B）。待培養7d左右，光學顯微鏡下觀察，頂囊球形或近球形，黃褐色或褐黑色，直徑700～800μm；分生孢子梗長短不一，最長為3000μm，最短僅250μm，直徑15～25μm。小分生孢子呈球形，直徑4～5μm（圖2C）。根據上述病原菌菌落形態學特征，將所分離的病原菌初步鑒定為曲霉屬Aspergillus。

2.3病原菌的ITS鑒定

PCR擴增得到一條599bp的清晰條帶（圖3）。在NCBI上采用BLAST同源性比對，結果該序列與黑曲霉菌Aspergillusniger"ITS1基因序列（GenBank登錄號：LC105682.1）相似度均達100%。根據上述分子生物學鑒定結果，并結合菌落平板生長和顯微菌絲體形態觀察結果，將該病原菌鑒定為黑曲霉Aspergillusniger。

2.4病原菌致病性

在接種病原菌7d后，3個花生品種豫花9326、白沙1016、遠雜9102均出現不同程度的病癥，莖基部被侵染的組織呈水侵狀，淡褐色，覆蓋大量的黑色孢子，葉片失水萎蔫，發病較重的12d后病株枯死，而對照植株無任何癥狀（圖4）。

2.5病原菌的生物學特征

2.5.1病原菌在不同培養基中的生長表現。

菌絲在花生秸稈和PDA培養基上生長很快，與大豆和麥粒培養基上菌絲的生長速度存在明顯差異（圖5）?；ㄉ斩捙囵B基上生長速度最快，麥粒培養基上病原菌生長速度最慢。

2.5.2病原菌在不同pH的PDA平板中的生長表現。

病原菌在pH7的PDA培養基上菌落擴展速度最快，pH為6時生長速度較pH7時稍慢，當pH為5和1即較酸性或者較堿性時，菌落生長速度最慢（圖6）。菌落在pH5的PDA培養基上，第一天生長速度最快，之后一直緩慢生長。菌絲生長速度存在差異，培養3d后，pH7與pH5、pH11、pH12存在明顯差異，與pH6、pH8、pH9之間無明顯差異。

2.5.3菌絲的致死溫度。

將經過15個溫度處理（每個處理水浴加熱15min）的所有菌絲塊，置于PDA平板上暗培養2d后，51℃菌絲擴展最快，57℃菌絲生長速度最慢（圖7），當水浴溫度達到或高于59℃時，菌絲不生長，推斷該菌在59℃處理后會致死。

2.65種藥劑的室內抑菌效果

75%百菌清可濕粉劑等5種藥劑處理后，50%多菌靈可濕粉劑和43%戊唑醇懸浮劑處理后菌落幾乎不生長，與對照存在顯著差異，抑菌效果最好；75%百菌清可濕粉劑處理效果次之；其次是70%代森錳鋅可濕粉劑，處理后第1天和第2天有抑制效果，第3天菌落生長直徑與對照無明顯差別；3%甲霜惡霉靈水劑處理后，菌落生長速度與對照無明顯差異，第3天后菌落生長速度較對照更快，抑菌效果差（圖8）。

3結論與討論

黑曲霉（Aspergillusniger）為子囊菌亞門、絲孢目、叢梗孢科、半知菌曲霉屬真菌，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產品和土壤中，寄主范圍較廣，容易造成水稻、水果等糧食和食品發霉腐爛，除能引起曲霉病外，也能產生黑曲霉毒

素^［11］。 對黑曲霉報道較多的是作為重要的發酵工業菌種，如用于飼用苧麻木質纖維素生物降解^［12］、玉米秸稈發酵^［13］等。國外已報道的引起花生冠腐病的病原菌為黑曲霉菌（ Aspergillus niger ）^{［5-6，8-9，14］}，對于花生冠腐病病原菌的系統研究，國內學者研究較少，李楊等^［7］、張霞等^［15］也認為花生冠腐病是由黑曲霉（ Aspergillus niger ）引起，但對于花生冠腐病病原菌的鑒定多基于形態學。該研究通過對病原菌的形態學觀察和分子鑒定方法，明確安徽省花生冠腐病病原菌為黑曲霉菌（ Aspergillus niger ）。

花生冠腐病是花生苗期最常見的土傳病害之一，防治花生土傳病害最經濟有效的方法是選用抗病花生品種和藥劑拌種。目前，對花生病害的防治多為化學藥劑拌種。該研究選擇5種常規的化學藥劑，通過測定藥劑對菌絲生長速度，明確5種不同殺菌劑對病原菌的抑制效果。為有效防治花生冠腐病，還需在此基礎上，進一步對病原菌的遺傳特性、致病機理進行深入研究，篩選田間防治藥劑，以期減輕花生冠腐病帶來的危害。通過對花生冠腐病病原菌的研究，可以為我國花生冠腐病的有效防控提供借鑒。

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