微型月季‘玲之妖精’的離體培養研究

2025-01-28 00:00:00方荷芳周鑫平康旭東彭曉龍李同建賈明良

安徽農學通報 2025年2期

摘要" 為促進微型月季‘玲之妖精’的種苗規模化生產以及后續利用細胞工程方法進行種質改良，以微型月季‘玲之妖精’為試驗材料，利用組織培養方法進行離體培養研究，主要包括不同外植體消毒滅菌處理、愈傷組織誘導、愈傷組織增殖、腋芽萌發誘導、腋芽繼代增殖以及生根誘導等。結果表明，葉片外植體合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌5 min，適合的愈傷組織誘導培養基為MS+6-芐基腺嘌呤（6-BA） 0.5 mg/L+2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D） 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，愈傷組織增殖培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+萘乙酸（NAA） 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L；莖段外植體合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌8 min，適合腋芽萌發的培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，腋芽繼代增殖的培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L；生根適宜的培養基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂 6.5 g/L。本研究為微型月季品系改良和遺傳轉化提供參考。

關鍵詞" 微型月季；離體培養；愈傷組織誘導；繼代增殖

中圖分類號" Q813.1" " " "文獻標識碼" A" " " "文章編號" 1007-7731（2025）02-0040-06

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.02.008

Research on in vitro culture of miniature Chinese rose ‘Lingzhi Yaojing’

FANG Hefang" " ZHOU Xinping" " KANG Xudong" " PENG Xiaolong" " LI Tongjian" " JIA Mingliang

（Jiujiang University， Jiujiang 332000， China）

Abstract" In order to promote the large-scale seedling production and subsequent germplasm improvement by cell engineering methods， the goblins of miniature Chinese rose ‘Lingzhi Yaojing’ were used as experimental materials to study in vitro culture， including different explants disinfection and sterilization， callus induction， callus proliferation， axillary bud germination induction， axillary bud subculture proliferation， and rooting induction. The results showed that the suitable sterilization method for leaf explants was 75% ethanol disinfection for 30 s+0.1% mercury chloride sterilization for 5 min， and the suitable callus induction medium was MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. Callus proliferation medium was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. The appropriate sterilization method for stem explants was 75% ethanol disinfection for 30 s+0.1% mercury chloride sterilization for 8 min. The medium suitable for axile germination was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. The subculture proliferation medium for axillary bud was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. The suitable medium for rooting was 1/2MS+NAA 0.1 mg /L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. This study provides a reference for the improvement and genetic transformation of microrose strains.

Keywords" miniature Chinese rose; in vitro culture; callus induction; subculture proliferation

月季為薔薇科薔薇屬多年生觀賞植物，觀賞價值極高。月季品種繁多，其中微型月季是一類適合盆栽及地被栽培的品種，具有較高的市場價值[1]。現已有諸多關于微型月季的研究，如馬俊麗等[2]通過研究68種微型月季種質資源發現，其表型性狀間存在差異，品種間變異系數較高；彭華等[3]對江西地區引種的微型月季品種進行了鑒定評估，認為北京紅和紫色美地蘭綜合表現較好；付存念等[4]研究表明，溫州地區引種的微型月季品種中，人間天堂、羽毛等品種綜合評價較高。此外，關于盆栽微型月季生產的裝備化[5]和自動化[6]方面也有相關研究。微型月季種苗的主要生產方式為扦插，對此有諸多報道，如周丹燕[7]研究發現，微型月季白柯斯特適合扦插的基質配比為草炭∶珍珠巖=2∶3；瞿輝等[8]研究表明，萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）處理對微型月季扦插生根有明顯的促進作用；王燕等[9]對華南地區冬季溫室微型月季扦插母株進行補光處理，提高了其插穗品質。由于微型月季株型矮小、莖節數量較少，因此扦插方式繁殖系數較低，難以滿足市場需求，因此對其離體培養的研究主要集中在不同的微型月季品種的外植體滅菌、腋芽萌發誘導以及增殖和生根等方面[10-12]。‘玲之妖精’是微型月季的典型代表之一，具有植株矮小、花朵大、重瓣和抗病等特點，花朵具有玫瑰香氣，深受人們喜愛。瞿素萍等[13]、彭奎莉等[14]研究表明，不同品種微型月季對培養條件的響應既有同一性，又有一定的特異性，因此對其進行離體培養具有重要意義，可為‘玲之妖精’種質資源的進一步開發和品系改良提供參考。

本文以‘玲之妖精’幼嫩葉片為外植體，進行愈傷組織誘導和增殖研究，同時利用帶芽莖段進行了腋芽萌發、增殖及生根誘導成苗的研究，完善了微型月季‘玲之妖精’的離體培養體系，為其品系改良和遺傳轉化提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為微型月季‘玲之妖精’植株，外植體選擇無病蟲害且生長狀態良好的當年生半木質化中段枝條。將當天采摘枝條剪成帶1～2個芽的莖段，將從枝條上剝離的葉片作為葉片外植體，去掉葉片后暴露腋芽的枝條作為莖段外植體，流水沖洗去除其表面污漬，吸去表面殘留水分后，分別置于培養瓶中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌條件篩選將清洗好的葉片外植體直接用升汞（0.1% HgCl2水溶液）浸泡滅菌（浸泡時間梯度設置為3、5、8和12 min），無菌水沖洗6次，得到滅菌后的葉片外植體（編號A1～A4）；將清洗好的葉片外植體采用75%乙醇浸泡30 s消毒，后用無菌水沖洗3次，再用升汞浸泡滅菌（浸泡時間梯度設置為3、5、8和12 min），最后用無菌水沖洗6次，以洗凈殘留的升汞為準，得到無菌葉片外植體（編號A5～A8）。莖段外植體采用與葉片外植體相同的滅菌方式，編號B1～B8。滅菌后的外植體接種至培養基[MS+6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8]中培養觀察。14 d后統計污染率和褐化率，并記錄污染和生長情況，計算如式（1）～（2）。

污染率（%）=出現污染的組織塊數/接種的外植體總數×100 （1）

褐化率（%）=出現褐化的組織塊數/接種的外植體總數×100 （2）

1.2.2 葉片愈傷組織誘導利用1.2.1中篩選得到的合適滅菌條件進行葉片滅菌，用無菌濾紙將葉片表面水分吸干后，將其剪成1 cm×1 cm的碎片，而后將碎葉片接種至含有不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和6-BA的MS培養基中，進行愈傷組織誘導試驗（培養基為MS+激素組合+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為C1：2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；C2：2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C3：2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L；C4：2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；C5：2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C6：2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L；C7：2，4-D 5.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C8：2，4-D 5.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C9：2，4-D 5.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L。接種30 d后統計愈傷組織誘導率、褐化率，并觀察愈傷狀態，計算如式（3）。

愈傷組織誘導率（%）=愈傷組織的誘導個數/葉柄外植體總數×100 （3）

1.2.3 愈傷組織增殖及再分化誘導將1.2.2誘導的愈傷組織與葉片分離，切割后轉入愈傷增殖及再分化培養基中進行愈傷組織增殖及再分化誘導（培養基為MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為D1：NAA 0.01 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+噻苯達唑（TDZ）0.02 mg/L；D2：NAA 0.01 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D3：MS+NAA 0.01 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D4：NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D5：NAA 0.2 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D6：NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L。接種30 d后統計再分化誘導率、褐化率，并觀察愈傷增殖情況，計算如式（4）。

再分化誘導率（%）=誘導出芽的組織塊數/接種的愈傷組織塊數×100 （4）

1.2.4 腋芽萌發誘導利用1.2.1中篩選得到的合適滅菌條件進行莖段滅菌，用無菌濾紙將莖段表面水分吸干后，將形態學上端向上接種至含有不同濃度6-BA和NAA的MS培養基中，進行腋芽萌發誘導試驗（培養基設定為MS+激素組合+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為E1：6-BA 0.5 mg/L；E2：6-BA 1.0 mg/L；E3：6-BA 2.0 mg/L；E4：6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；E5：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；E6：6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。接種21 d后統計腋芽萌發率，并觀察生長情況，計算如式（5）。

腋芽萌發率（%）=萌發出腋芽的外植體數/接種的外植體總數×100 （5）

1.2.5 腋芽繼代增殖誘導將萌發的腋芽與莖段切開，取腋芽接種于叢生芽繼代增殖培養基中進行腋芽繼代增殖誘導（培養基設定為MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為F1：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；F2：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；F3：6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；F4：6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；F5：6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；F6：6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；F7：6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；F8：6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；F9：6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。接種30 d后統計增殖倍數，并觀察生長情況，計算如式（6）。

增殖倍數（倍）=增殖后的叢生芽數/接種的組織塊數（6）

1.2.6 生根誘導待苗長到2 cm左右，將其切割接種到不同生根培養基上進行生根誘導（培養基設定為基本培養基+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。基本培養基+激素組合編號為G1：MS+NAA 0.1 mg/L；G2：MS+NAA 1.0 mg/L；G3：1/2MS+NAA 0.1 mg/L；G4：1/2MS+NAA 1.0 mg/L；G5：1/4MS+NAA 0.1 mg/L；G6：1/4MS+NAA 1.0 mg/L。接種30 d后統計生根誘導率，并觀察種苗生長狀態，計算如式（7）。

生根誘導率（%）=誘導出根叢生芽個數/接種叢生芽總數×100 （7）

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次，所得數據用Excel及SPSS軟件進行統計分析，數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 葉片外植體離體培養

2.1.1 滅菌條件篩選由表1可知，隨著升汞滅菌時間的延長，葉片外植體污染率逐漸降低，但升汞滅菌8 min及以上的外植體褐化率有所升高。與A1～A4相比，在使用升汞滅菌的基礎上添加75%乙醇浸泡30 s后，污染率整體降低。A6的污染率略高于A7和A8（Pgt;0.05），但其褐化率明顯低于A8（Plt;0.05）。綜合來看，最佳的消毒滅菌處理為A6，即75%乙醇30 s+0.1%升汞5 min。

2.1.2 葉片愈傷組織誘導由表2可知，6-BA濃度對葉片愈傷組織誘導率和褐化率的影響均較小，以6-BA濃度為0.5 mg/L時，葉片褐化率較低。當2，4-D濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織誘導率較低；隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織的誘導率呈上升趨勢。2，4-D濃度為2.0 mg/L和5.0 mg/L情況下，葉片愈傷組織褐化率差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。從愈傷組織狀態來看，當2，4-D濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織較小且致密，為黃綠色，褐化率較高；當2，4-D濃度為2.0 mg/L時，愈傷組織變大，致密程度降低，褐化率也降低；當2，4-D濃度為5.0 mg/L時，愈傷組織為黃白色或白色，狀態較疏松，褐化率較低。遵循當誘導效果無顯著差異時，選取激素濃度低的組合原則，選取C5（MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）為合適的葉片愈傷組織誘導培養基組合。

2.1.3 愈傷組織增殖及再分化誘導由表3可知，本試驗原計劃促成愈傷組織的再分化，但在實際誘導時各培養基均未誘導出芽或根等器官，再分化誘導率均為0。對褐化率和愈傷組織生長狀況進行綜合評判，發現NAA濃度為0.20 mg/L時，褐化率均較低，同時6-BA濃度為2.0 mg/L時，愈傷組織生長旺盛。綜合來看，愈傷組織增殖的合適培養基為D6（MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

2.2 莖段外植體離體培養

2.2.1 滅菌條件篩選由表4可知，不同消毒滅菌處理莖段外植體的污染率和褐化率趨勢與葉片外植體相似。B7、B8的污染率基本相同，但B7的褐化率明顯低于B8，差異具有統計學意義（Plt;0.05）。綜合來看，莖段外植體的最佳消毒滅菌處理為B7，即75%乙醇30 s+0.1%升汞8 min。

2.2.2 腋芽萌發誘導由表5可知，各種激素組合下腋芽萌發率均較高，可見月季莖段進行腋芽萌發誘導較容易，以E5的腋芽萌發率較高，為90.00%，與除E2、E6外的其余組合差異均具有統計學意義（Plt;0.05）。生長狀況方面，E2和E5腋芽萌發成苗生長健壯。綜合萌發率和生長狀況，腋芽萌發誘導的合適培養基為E5（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

2.2.3 腋芽繼代增殖由表6可知，NAA濃度對腋芽增殖倍數的影響較小，主要取決于6-BA濃度。當6-BA濃度為1.0 mg/L時，增殖倍數低于其他處理，差異具有統計學意義（Plt;0.05）；當6-BA濃度為2.0 mg/L時，增殖倍數較F1～F3顯著提高（Plt;0.05），但當6-BA濃度繼續提高時增殖倍數未出現明顯增長。結合生長狀態可看出，各組合除芽數量差異外，均生長健壯，選取合適的腋芽繼代增殖培養基為F4（MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

2.2.4 生根誘導培養由表7可知，當基本培養基為1/2MS時，生根誘導率優于其他組合，差異具有統計學意義（Plt;0.05）。NAA濃度較低時，種苗生長狀態較好。當基本培養基為1/2MS、NAA濃度為1.0 mg/L時，生根誘導率較高，但種苗狀態較差。總體而言，適合生根誘導的培養基為G3（1/2MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

3 結論與討論

本文研究了滅菌條件對微型月季外植體污染率和褐化率的影響，確定葉片外植體采用75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌5 min、莖段外植體采用75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌8 min滅菌效果較好。相關研究表明，不同來源的外植體由于污染情況不一，所用的滅菌時間存在差異，如呂金浮[15]研究表明，利用升汞對微型月季莖段外植體滅菌3 min效果較好；謝曉靜等[16]研究發現，月季莖段消毒以0.1%升汞溶液消毒10 min較為適宜。

‘玲之妖精’葉片愈傷組織誘導最適培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，愈傷組織增殖最適培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L。在以上培養條件下可進行葉片愈傷組織的增殖，但進行再分化誘導時，發現并無芽或根等器官產生，與馮歡等[17]、苗衛東等[18]研究結果不一致，可能與植物基因型、生理狀態和培養基成分等不同有關[19]。

胡軍榮[20]研究表明，低溫處理有利于月季腋芽萌發誘導；劉洋等[21]研究發現，6-BA、NAA和赤霉素（GA3）的組合對于促進月季腋芽萌發有良好的效果。本試驗為常溫狀態下對腋芽萌發進行研究，確定適合腋芽萌發的培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，其中未添加GA3，后續可利用低溫以及GA3對于微型月季‘玲之妖精’的腋芽萌發誘導進行進一步研究。

腋芽繼代增殖的培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，在此條件下叢生芽增殖5倍以上，具有較好的誘導效果。彭奎莉等[22]添加IBA作為生根激素得到的生根率為83.33％；馮歡等[17]研究表明，在1/4MS+NAA 0.1 mg/L激素條件下可獲得100%的生根率，但相同的條件下，本試驗僅得到5.16%的生根率。本試驗生根誘導效果較好的培養基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，生根誘導率總體較低，且在莖段基部容易產生愈傷組織，影響生根效果，后續研究可選擇合適的基本培養基以及激素配比條件等進行生根誘導。

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