高效液相色譜-電感耦合等離子體串聯質譜法測定大米5種硒形態

摘 要：建立了一種采用高效液相色譜-電感耦合等離子體串聯質譜聯用儀測定大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亞硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）]

5種硒形態的分析方法。利用小麥粉質控樣（ERM-BC210a）中硒代蛋氨酸的測定回收率分析優化硒形態的提取效果；以O2作為反應池氣體，在硒元素質量轉移Se（m/z 80＞96）模式下，以Hamilton PRP-X100為分析柱，以5 mmol·L-1的檸檬酸溶液（pH=5.0）為流動相，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體串聯質譜聯用法檢測。結果表明，在0.5～200.0 μg·L-1，各硒形態線性關系良好，相關系數均大于0.999 5；SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）檢出限分別為0.002、0.004、0.005、0.002 mg·kg-1和0.001 mg·kg-1；在0.025、0.100、0.250 mg·kg-1 3個加標水平下，各硒形態的平均加標回收率為79.9%～106.3%。10批海南地區大米中主要檢出的硒形態為SeMet，其他硒形態均未檢出。該方法準確、靈敏，可滿足大米中硒形態的

定量分析。

關鍵詞：硒形態；大米；高效液相色譜-電感耦合等離子串聯質譜聯用儀

Determination of Five Selenium Species in Rice by High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Tandem Mass Spectrometry

FU Yufu， WEI Ying， LIU Dongni， KANG Rui， LIN Zhifan， GU Mantun*

（Institute of Food Testing， Hainan Academy of Inspection and Testing， Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety， State Administration for Market Regulation， Haikou 570314， China）

Abstract： A method was developed for the determination of five selenium forms in rice， including selenocystine （SeCys2）， methyl-selenocysteine （MeSeCys）， selenite [Se（Ⅳ）]， selenomethionine （SeMet） and selenate [Se（Ⅵ）]， by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The recovery rate of selenomethionine in wheat flour quality control sample （ERM-BC210a） was used to analyze and optimize the extraction effect of selenium morphology. O2 was used as the reaction cell gas， selenium mass transfer Se （m/z 80＞

96） mode， Hamilton PRP-X100 was used as the analytical column， and 5 mmol·L-1 citric acid solution （pH=5.0） was used as mobile phase and was detected by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The results showed that in 0.5 to 200.0 μg·L-1， the linear relationship between selenium morphology was good， and the correlation coefficients were greater than 0.999 5， and the detection limits of SeCys2， MeSeCys， Se（Ⅳ）， SeMet and Se（Ⅵ） were 0.002 mg·kg-1， 0.004 mg·kg-1， 0.005 mg·kg-1， 0.002 mg·kg-1 and

0.001 mg·kg-1， respectively. The average recoveries of selenium forms were from 79.9% to 106.3% at the three spike levels of 0.025 mg·kg-1， 0.100 mg·kg-1 and 0.250 mg·kg-1. SeMet was the main selenium form detected in 10 batches of rice from Hainan， while no other selenium forms were detected. This method is accurate and sensitive， which can meet the quantitative analysis of selenium form in rice.

Keywords： selenium species; rice; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry

硒元素是人體必需的一種微量元素，其通過抗氧防御機制參與人體免疫系統防御，增強抗病毒能力、排毒與抗氧化功能等[1]。飲食攝取是人體補硒最主要的途徑，但是我國是較嚴重的缺硒國家之一。據統計，我國有72%的地區缺硒，其中29%為嚴重缺硒地區[2]；2006年海南省地質調查院首次宣布在海南島發現富硒土壤占全島總面積的28.14%，主要分布在海南島中東部地區[3]。海南硒資源位居全國前列，同時是糧食作物水稻的主要種植地區，但針對海南地區大米中的硒含量及硒形態的研究報道較少。

目前，測定大米中硒元素的方法較多，主要包括氫化物發生-原子熒光光譜法（Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）、電感耦合等離子體質譜法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS）、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用儀法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）等。其中，HG-AFS法操作簡便，但靈敏度較低；ICP-MS法靈敏度高[4]，但其采用氦氣碰撞模式，由于氬原子離子、稀土雙電荷等對豐度最高的80Se有干擾[5]，常選用豐度較低的78Se作為硒元素的檢測質量數，信號響應較低。本研究采用的電感耦合等離子體串聯質譜（Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，ICP-MS/MS）技術具備兩組四極桿質量過濾器，在O2反應模式下，硒元素檢測質量數可由80Se+轉換成80Se16O+，由此可消除多原子離子等干擾[6]，可使檢測結果更準確、更靈敏；同時利用液相色譜技術與ICP-MS/MS相結合，在O2模式下，可使硒形態檢測結果更加準確。

本研究建立同時測定海南大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亞硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）] 5種硒形態的高效液相色譜-電感耦合等離子串聯質譜聯用（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS/MS）分析方法，以獲得更準確的檢測結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米，產自海南海口、瓊海、五指山等市縣，共計10批次。

SeCys2溶液標準物質[GBW 10087，（44.2±

1.0）μg·g-1，以Se計]、MeSeCys溶液標準物質[GBW 10088，（34.8±1.0）μg·g-1，以Se計]、Se（Ⅳ）溶液標準物質[GBW 10032，（42.9±0.9）μg·g-1，

以Se計]、SeMet溶液標準物質[GBW 10034，（39.4±1.0）μg·g-1，以Se計]、Se（Ⅵ）溶液標準物質[GBW 10033，（41.5±1.3）μg·g-1，以Se計]，中國計量科學研究院；小麥粉質控樣[批號ERM-BC210a，硒代蛋氨酸標示值（27.4±2.6）mg·kg-1]，英國LGC公司；胰蛋白酶γ（CAS：9002-07-7），國藥集團；蛋白酶K（CAS：39450-01-6），麥克林；鏈蛋白酶E（CAS：9036-06-0），上海源葉生物；硝酸（優級純），德國默克；三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TRIS-HCl，純度99%），阿法埃莎化學；氨水（色譜純），德國默克；Milli-Q超純水，德國默克。

1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀，美國Agilent；8900型感耦合等離子體串聯質譜儀，美國Agilent；陰離子交換色譜柱Hamilton PRP-X100（150 mm×

4.6 mm，5 μm）；Thermo IonPac AS19（250 mm×

4 mm）；Thermo IonPac AS7（250 mm×4 mm）；MARS型微波消解儀，美國培安；XS204型電子分析天平，瑞士梅特勒；SHZ-C型恒溫振蕩水浴，上海龍躍；SK7200B 超聲波清洗器，上海科導；Multi reax（EX）渦旋混合器，德國海道夫；Million Q型超純水器，德國默克。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

精密稱取2 g大米粉于15 mL離心管中，加入鏈霉蛋白酶E 20 mg與樣品混勻，加入10 mL

75 mmol·L-1 Tris-HCl提取液，渦旋振蕩混勻

1 min，超聲30 min后，于37 ℃恒溫水浴振蕩4 h，10 000 r·min-1離心3 min，上清液過0.22 μm水系濾膜，濾液為待測液。

小麥粉質控樣ERM-BC210a根據證書含量計算，準確稱取0.3 g樣品于50 mL離心管中，后續操作同樣品一致。

1.3.2 溶液配制

混合標準儲備液：用電子分析天平分別稱取一定量的MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、SeCys2和Se（Ⅵ）標準物質，用水稀釋并定容，分別得到質量濃度為10 μg·mL-1的標準儲備液。

混合標準中間液Ⅰ：各取1 mL的MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、SeCys2、Se（Ⅵ）標準儲備液，用水定容至10 mL的容量瓶中，得到1 μg·mL-1的5種混合標準中間液Ⅰ。

混合標準中間液Ⅱ：取1 mL的混合標準中間液Ⅰ，用水定容至10 mL的容量瓶中，得到

100 μg·L-1的3種混合標準中間液Ⅱ。

用移液槍分別吸取一定體積的混合標準中間液Ⅰ、Ⅱ，經空白基質溶液定容至1 mL，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1的基質混合標準系列工作溶液。

1.3.3 儀器條件參數

（1）ICP-MS/MS。射頻功率：1 550 W；掃描類型：串接；工作氣：Ar；霧化氣流速：

1.09 L·min-1；補償氣流速：0 L·min-1；輔助氣流速：

0.90 L·min-1；采樣深度：10.0 mm；反應氣：O2；O2流速：30%；提取透鏡1：0 V；提取透鏡2：250 V；采集質量數：80＞96（m/z）；積分時間：0.3 s。

（2）HPLC。色譜柱：Hamilton PRP-X100柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：5 mmol·L-1檸檬酸溶液，pH=5.0（氨水調pH值）；流速：

1 mL·min-1；進樣體積：50 μL。

1.4 數據處理

每個樣品做3次平行實驗，利用Origin 2021軟件和Excel 2013進行數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

色譜分離提取樣品中的不同硒形態化合物，需要破壞大米中蛋白質的肽鍵，使其處于游離態，并保證化合物的完整性，因此確保提取效果的關鍵在于提取方法的選擇[7]。經查閱相關文獻，大米中硒形態的提取方法有水提法、酸提法以及酶提法等[8]。本研究對比各方法的提取效果，結果發現使用以

75 mmol·L-1 Tris-HCl緩沖液作為提取溶液的酶提法提取的硒形態化合物相對較穩定，回收率較高。

研究表明，大米中硒的存在形態以SeMet為主，因此本研究選取小麥粉質控樣中SeMet的回收率作為考察指標進行提取條件的優化。由圖1（a）可知，當超聲時間為30 min時，質控樣回收率處于較高水平；之后隨著超聲時間的延長，質控樣回收率變化不大，因此選擇超聲時間為30 min。

超聲后樣品在37 ℃下進行水浴振蕩，不同振蕩時間下的回收率變化趨勢見圖1（b）。當振蕩時間為4 h時，質控樣回收率處于較高水平；之后隨著振蕩時間的延長，質控樣回收率變化不大，因此選擇振蕩時間為4 h。

2.2 提取酶種類及加入量的優化

本研究在10 mL 75 mmol·L-1 Tris-HCl提取溶液中加入蛋白酶K（記為K）、鏈霉蛋白酶E（記為E）、胰蛋白酶γ（記為γ）以及不同酶組合，考察不同酶組合提取條件下小麥粉質控樣的回收率。結果發現，在含有鏈霉蛋白酶E的組合提取條件下，小麥粉質控樣的回收率在92%～98%；對比單一酶提取質控樣回收率，發現胰蛋白酶γ＜蛋白酶K＜鏈霉蛋白酶E[如圖2（a）]。基于此，本文進一步考察鏈霉蛋白酶E加入量（10、15、20、25、

30 mg和35 mg）對質控樣回收率的影響，結果表明當鏈霉蛋白酶E加入量為20 mg時，質控樣回收率可達到98%，繼續增加鏈霉蛋白酶E用量，質控樣回收率變化不大[如圖2（b）]。考慮測試成本的因素，本研究選用加入20 mg鏈霉蛋白酶E作為提取酶。

2.3 流動相和色譜柱優化

采用HPLC進行硒形態分離過程中，發現不同的硒形態在不同的pH值條件下的分離效果和保留時間有所差別，當提高流動相濃度或流動相pH值時，可明顯縮短5種硒形態出峰時間，但前3個峰[SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）]的分離度會變差；相反，在合適條件下延長5種形態出峰時間，分離度則變好。本研究考察了不同pH值（4、5、6、7）、不同濃度（2、5、10 mmol·L-1）的檸檬酸溶液對5種

硒形態的分離情況。結果表明，選擇pH=5、濃度為5 mmol·L-1的檸檬酸作為流動相，既具有良好的分離度，又能有較為適宜的出峰時間。

實驗還對比了3種陰離子交換色譜柱Hamilton PRP-X100、Thermo IonPac AS19和Thermo IonPac AS7對分離效果的影響。結果表明，Thermo IonPac AS19色譜柱無法實現5種硒形態化合物的有效分離，Thermo IonPac AS7色譜柱測試分離時間太長，Hamilton PRP-X100則能在較短的時間內完成5種硒形態的分離。

2.4 線性關系、檢出限

由圖3可知，本方法能夠在15 min內完成5種

硒形態的完全分離，出峰順序依次為SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）。由表1可知，濃度為0.5～200.0 μg·L-1時，5種硒形態化合物的線性關系良好，相關系數r在0.999 6～

1.000 0。SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）檢出限分別為0.002、0.004、0.005、0.002、

0.001 mg·kg-1。

2.5 精密度與回收率

采用空白海南地區大米樣品進行3個不同濃度水平（0.025、0.100、0.250 mg·kg-1）的加標回收實驗，每個濃度進行3次重復，結果見表2。5種硒形態的平均加標回收率在79.9%～106.3%，相對標準偏差為1.7%～5.7%，滿足實際樣品分析要求，可實現SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）等

5種硒形態的準確測定。

2.6 樣品測定

將海南地區所采集的10批大米樣品經前處理研磨成粉，采用本文建立的方法對其中的硒形態進行分析研究，結果表明，有9批大米樣品中只檢出SeMet，SeMet含量為0.007 7～0.025 8 mg·kg-1，未檢出其他硒形態，與相關文獻報道相符[9]。相較于其他硒形態，人體對食物中SeMet的生物利用效率較高[10]，后期可重點對富硒大米中SeMet的含量和功能進行深入研究。

3 結論

本研究采用HPLC-ICP-MS/MS技術以O2作為反應池氣體，在硒元素質量轉移Se（m/z 80＞96）模式下，以Hamilton PRP-X100分析柱，以5 mmol·L-1的檸檬酸溶液（pH=5.0）作為流動相，能夠在一次進樣中實現5種硒形態SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）完全分離和在線測定。5種硒形態在0.5～200.0 μg·L-1線性關系良好，相關系數r＞0.999 5，檢出限分別為0.002、0.004、0.005、0.002、0.001 mg·kg-1；在0.025、0.100、

0.250 mg·kg-1 3個加標水平下，各硒形態的加標回收率為79.9%～106.3%，相對標準偏差在1.7%～

5.7%。該方法適用于大米中SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）含量的測定。

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基金項目：海南省自然科學基金青年基金項目（320QN375）；國家市場監督管理總局重點實驗室（熱帶果蔬質量與安全）課題資助項目（ZZ-2022002）。

作者簡介：符郁馥（1985—），女，海南文昌人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全檢測。

通信作者：谷滿屯（1991—），男，河南信陽人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測。E-mail： 375552783@qq.com。