基于NOD樣受體3炎性小體通路對利拉魯肽在氧化低密度脂蛋白誘導內皮細胞損傷的作用機制研究

【摘要】 背景 動脈粥樣硬化是世界范圍內引起心腦血管疾病最主要的原因，炎癥是目前研究熱點，其中NOD樣受體3（NLRP3）是研究最為深入的炎癥小體。胰高糖素樣肽1（GLP-1）受體激動劑有抗動脈粥樣硬化作用，具體機制尚不明確。目的 研究利拉魯肽通過拮抗氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的內皮細胞損傷的作用機制。方法 2022-03-25—05-19培養人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），取HUVEC加空白血清作為對照組，100 μg/mL的ox-LDL干預HUVEC 48 h作為模型組，100 μg/mL的ox-LDL干預HUVEC 24 h后分別加入100、200、400 nmol/L利拉魯肽處理24 h作為利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組。CCK-8法計算細胞增殖率。通過掃描電鏡觀察焦亡細胞形態。檢測乳酸脫氫酶（LDH）活力。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測白介素（IL）-1β、IL-18表達水平。蛋白質免疫印跡試驗（Western blot）檢測NLRP3、接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）、焦亡執行蛋白（GSDMD）、N端結構域的焦亡執行蛋白（N-GSDMD）表達水平。結果 模型組、利拉魯肽低濃度組和利拉魯肽中濃度組細胞增殖率低于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組細胞增殖率高于模型組（Plt;0.05）。細胞掃描電鏡結果示模型組細胞焦亡明顯，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組細胞焦亡情況明顯改善。模型組、利拉魯肽低濃度組LDH活力高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組低于模型組（Plt;0.05）。模型組、利拉魯肽低濃度組IL-1β表達水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-1β表達水平低于模型組（Plt;0.05）；模型組IL-18表達水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-18表達水平低于模型組（Plt;0.05）。模型組NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表達水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組ASC、Caspase-1表達水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組NLRP3、ASC表達水平低于模型組，利拉魯肽高濃度組NLRP3、ASC、Caspase-1表達水平低于模型組（Plt;0.05）。結論 利拉魯肽顯著抑制ox-LDL誘導的內皮細胞NLRP3炎性小體活化，并且能夠抑制內皮細胞的焦亡，具有抗動脈粥樣硬化作用。

【關鍵詞】 動脈粥樣硬化；利拉魯肽；內皮細胞；氧化低密度脂蛋白；NOD樣受體3

【中圖分類號】 R 543.5 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0531

Mechanism of Liraglutide in Oxidized Low-density Lipoprotein Induced Endothelial Cell Injury Based on NOD-like Receptor 3 Inflammasome Pathway

【Abstract】 Background Atherosclerosis is the primary cause of cardiovascular and cerebrovascular diseases worldwide，and inflammation is a current research focus，with NOD-like receptor 3（NLRP3）being the most intensively studied inflammasome. GLP-1 receptor agonists have shown anti-atherosclerotic effects，but the underlying mechanisms remain unclear. Objective To investigates the mechanism of liraglutide in antagonizing oxidized low-density lipoprotein（ox-LDL） induced endothelial cell injury. Methods From March 25 to May 19，2022，Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were cultured，and HUVEC with blank serum was served as the control group，100 μg/mL ox-LDL treated HUVEC for 48 hours was served as the model group. Liraglutide was added in concentrations of 100 nmol/L，200 nmol/L，and 400 nmol/L to the HUVECs treated with ox-LDL for 24 hours，forming low，medium，and high concentration liraglutide groups，respectively. Cell proliferation rates were calculated using the CCK-8 method. Pyroptotic cell morphology was observed by using scanning electron microscopy. Lactate dehydrogenase（LDH）activity was measured. The expression levels of interleukin （IL）-1β and IL-18 were detected using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Western blot was used to assess the expression levels of NLRP3，apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD（ASC），caspase-1，gasdermin D（GSDMD），and N-terminal GSDMD（N-GSDMD）. Results Cell proliferation rate in the model group and both low and medium concentration liraglutide groups were lower than the control group，while the rate in all liraglutide-treated groups were higher than the model group（Plt;0.05）. Scanning electron microscopy showed obvious pyroptosis in the model group cells，which was significantly reduced in all liraglutide-treated groups. LDH activity in the model group and the low concentration liraglutide group was higher than the control group，while it was lower in all liraglutide-treated groups compared to the model group（Plt;0.05）. IL-1β level in the model group and the low concentration liraglutide group was higher than the control group，whereas IL-1β levels in the medium and high concentration liraglutide groups was lower than the model group（Plt;0.05）. IL-18 level in the model group was higher than the control group，while level in all liraglutide-treated groups was lower than the model group（Plt;0.05）. The expression levels of NLRP3，ASC，Caspase-1，GSDMD，and N-GSDMD in the model group were higher than the control group. In the low concentration liraglutide group，ASC and Caspase-1 levels were higher than the control group，whereas in the medium concentration group，NLRP3 and ASC levels were lower than the model group. In the high concentration group，NLRP3，ASC，and Caspase-1 levels were lower than the model group（Plt;0.05）. Conclusion Liraglutide significantly inhibits NLRP3 inflammasome activation in endothelial cells induced by ox-LDL，and can inhibit endothelial cell pyroptosis，with anti-atherosclerotic effects.

【Key words】 Atherosclerosis；Liraglutide；Endothelial cells；Oxidized low-density lipoprotein；NOD-like receptor 3

動脈粥樣硬化（AS）的發病率逐年上升，是世界范圍內引起心腦血管疾病的最主要原因，給患者、社會帶來了沉重的負擔。故尋找新的預防和治療方法，是當今醫學界亟待解決的問題。AS的發病機制涉及免疫炎癥反應、脂代謝紊亂、氧化應激、血管內皮損傷及血流動力學的改變等，是一個極其復雜的病理過程。脂代謝紊亂和炎癥是目前研究的熱點內容，具體機制尚不明確，目前針對NOD樣受體3（NLRP3）的研究主要集中在單核巨噬細胞內，對其他細胞內有關NLRP3炎癥小體的研究較少。最近的研究發現NLRP3炎性小體促使炎癥反應的發生，介導了內皮細胞的焦亡，參與了AS的進程［1］。近年來有研究發現，利拉魯肽可以通過抑制血管內皮損傷，預防AS，降低體質量，減輕機體慢性炎癥等方式來減少心血管疾病的發病風險［2］。近期有研究報道利拉魯肽抑制了游離脂肪酸誘導的NLRP3炎癥小體的活化，減少了白介素（IL）-1β和天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）的分泌，降低了肝臟中接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）的產生［3］。也有研究表明，利拉魯肽通過激活磷酸腺苷來減弱氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的小鼠巨噬細胞脂質積聚，從而抑制AS［4］。基于此，本研究團隊提出如下假說：利拉魯肽可能通過抑制內皮細胞的NLRP3炎癥小體活化和細胞焦亡，發揮對AS的抑制作用。本研究基于NLRP3炎性小體通路，進一步探討利拉魯肽通過拮抗氧化ox-LDL誘導的內皮細胞損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗時間

2022-03-25—05-19。

1.2 細胞與主要試劑

利拉魯肽注射液購自諾和諾德，貨號：8074252；人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自普諾賽，貨號：CL-0122；HUVEC細胞專用培養基；乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒（Solarbio，貨號：BC0685）；肌動蛋白（β-actin）抗體（內參抗體，兔抗）（Bioss，貨號：bs-0061R）、抗NLRP3抗體（Bioss，貨號：bs-10021R）、抗ASC抗體（Bioss，貨號：bs-34024R）、抗Caspase-1抗體（Bioss，貨號：bs-10743R）；抗焦亡執行蛋白（GSDMD）抗體（Abcam，貨號：ab209845）、抗N端結構域的焦亡執行蛋白（N-GSDMD）抗體（Abcam，貨號：ab215203）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（solarbio PC0020）、高效RIPA組織/細胞快速裂解液（solarbio R0010）。

1.3 主要儀器設備

氣套式觸屏CO2恒溫培養箱（CI-191X）；低速臺式離心機（L600-A）；渦旋儀（GL-88D）；生物安全柜（BSC-1304ⅡA2）；倒置生物顯微鏡系統（ICX41）；數顯恒溫水浴鍋（HH-1）；酶標儀（K6600-B）；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器；流式細胞儀（LSRII）；電子顯微鏡（Hitachi Regulus 8100）；Bio小型垂直電泳及轉印（1645050）；低溫冷凍離心機（H2050R）。

1.4 細胞處理與分組

1.4.1 細胞處理方法：HUVEC接種于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，放置在5% CO2、37 ℃ CO2恒溫培養箱中進行培養。顯微鏡下觀察貼壁細胞HUVEC密度，當生長至細胞培養皿面積的90%左右即可傳代。棄去培養基，用PBS洗滌2次，加入EDTA-胰蛋白酶分離細胞。將分離后的細胞置入15 mL的離心管中，室溫1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入新鮮完全培養基重懸細胞，置于細胞培養箱中繼續培養，第3～7代傳代細胞用于下一步實驗。

1.4.2 實驗分組及給藥：培養HUVEC，分為對照組、模型組、利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組。取HUVEC加空白血清作為對照組，100 μg/mL的ox-LDL干預HUVEC 48 h作為模型組，100 μg/mL的ox-LDL干預HUVEC 24 h后分別加入100、200、400 nmol/L利拉魯肽處理24 h作為利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組。參考高奮等［5］的研究選擇ox-LDL的濃度；參考高海娜［6］描述的方法選擇的利拉魯肽干預HUVEC濃度。

1.5 實驗方法

1.5.1 CCK-8法計算細胞增殖率：將各組細胞接種于96孔板中培養24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處各組樣本的吸光度（OD）。細胞增殖率（%）=［（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）］×100%。

1.5.2 通過掃描電鏡觀察焦亡細胞形態。

1.5.3 乳酸脫氫酶（LDH）活力：用移液槍吸取各組細胞培養液，12 000×g，4 ℃離心20 min，取上清液。按照檢測試劑盒說明書操作步驟，用酶標儀測定在450 nm處各組樣本的OD，計算各組LDH的活力。

1.5.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測炎癥因子IL-1β、IL-18表達水平：用移液槍吸取各組細胞培養液，1 000×g離心20 min，取上清液。參照試劑盒說明書操作，檢測細胞外液IL-1β、IL-18表達水平。

1.5.5 蛋白質免疫印跡試驗（Western blot）檢測NLRP3炎性小體活化相關蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）與焦亡相關蛋白（GSDMD、N-GSDMD）蛋白表達水平：提取細胞總蛋白，嚴格按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白定量后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后室溫下封閉，用特異性抗體進行免疫雜交檢測，β-actin作為內參，化學發光劑顯色，最后對目的條帶進行掃描密度分析，通過ImageJ 1.0處理分析得出各條帶灰度值，得到目的條帶與內參蛋白灰度值的比值。每組重復3次。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組HUVEC細胞增殖率比較

5組HUVEC細胞增殖率比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；其中模型組、利拉魯肽低濃度組和利拉魯肽中濃度組細胞增殖率低于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組細胞增殖率高于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 細胞掃描電鏡結果

電鏡觀察各組細胞形態學變化，各組細胞存在明顯差異，對照組細胞形態較好，未見明顯損傷，整體結構尚可，與對照組比較，模型組細胞焦亡特征較明顯，細胞膜鼓包、隆起、破損，出現窗孔，部分細胞內容物釋放至胞外；與模型組比較，利拉魯肽干預后細胞焦亡有不同程度的減輕，其中利拉魯肽高濃度組細胞焦亡程度相對最輕，細胞膜局部隆起、偽足可見；利拉魯肽中濃度組細胞焦亡程度相對較輕，膜破損或隆起、窗孔略少、偏小；利拉魯肽低濃度組細胞焦亡程度較重，細胞膜大面積隆起、破損。各組細胞電鏡掃描結果見圖1。

2.3 5組HUVEC細胞LDH活力比較

5組HUVEC細胞LDH活力比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；其中模型組、利拉魯肽低濃度組高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組低于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.4 5組HUVEC細胞IL-1β、IL-18表達水平比較

5組HUVEC細胞IL-1β、IL-18表達水平比較，差異有統計學意義（Plt;0.05），其中模型組、利拉魯肽低濃度組IL-1β表達水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-1β表達水平低于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型組IL-18表達水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組、利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組IL-18表達水平低于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

2.5 5組HUVEC細胞NLRP3炎性小體活化相關蛋白與焦亡相關蛋白表達水平比較

5組HUVEC細胞NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表達水平比較，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。組間比較結果顯示，模型組NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表達水平高于對照組，利拉魯肽低濃度組ASC、Caspase-1表達水平高于對照組，利拉魯肽中濃度組NLRP3、ASC表達水平低于模型組，利拉魯肽高濃度組NLRP3、ASC、Caspase-1表達水平低于模型組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表4、圖2。

3 討論

研究表明，先天免疫模式識別受體的作用不僅局限于AS的形成，而且還可以作為一種連接機制，將其與其他免疫反應相聯系，從而影響到整個動脈硬化的進程［7-8］。先天免疫模式識別受體主要包含兩類：一類是胞漿內的NOD樣受體（NLRs），另一類則是細胞膜上的Toll樣受體（TLRs）。NLRP3炎癥小體為細胞內模式識別受體，也是目前研究最為深入、最為廣泛的炎性小體。

NLRP3炎癥小體由受體蛋白NLRP3、ASC和效應蛋白半胱氨酸天冬酶原-1（pro-Caspase-1）組成［9］。NLRP3炎癥小體受各種信號刺激，當受體蛋白NLRP3被激活后表達水平顯著提升，招募ASC并互相作用，從而將原本無活性的pro-Caspase-1活化為Caspase-1，以此發揮效應蛋白的功效［10］，活化后的Caspase-1對pro-IL-1等底物進行切割，最后促進炎癥介質IL-1β、IL-18的成熟和分泌［11］。在AS發生、發展的全過程中，作為先天免疫反應中重要介質IL-1β和IL-18是炎癥反應的總閥門，不僅自身參與炎癥反應，其還作為上游因子導致下游其他炎癥因子的級聯樣釋放［12］。CCK-8實驗模型組細胞增殖率降低，模型組LDH活力增加，說明造模成功；利拉魯肽可拮抗ox-LDL造成的內皮細胞增殖率降低及細胞膜結構的破壞，說明利拉魯肽可以抑制ox-LDL誘導的內皮細胞損傷。本實驗結果顯示，與模型組相比，IL-1β、IL-18含量在利拉魯肽中濃度組、利拉魯肽高濃度組中明顯下降，說明一定濃度的利拉魯肽可以抑制炎癥反應。

炎性小體可以促進Caspase-1活化，進一步引起細胞程序性死亡，也就是細胞焦亡［13］，其特征包括細胞膜破裂和細胞內炎性內容物釋出［14］。在經典焦亡途徑中不同的NLRs對相應的刺激信號產生選擇性應答，隨后pro-Caspase-1通過ASC與NLR受體蛋白連接形成高分子復合物，自身剪切成有酶學活性的Caspase-1，切割GSDMD，釋放N-GSDMD與細胞膜脂類相結合，多聚化并在細胞膜形成孔洞，導致細胞腫脹而焦亡［15-17］。由于細胞膜孔的形成，IL-1β和IL-18等促炎癥因子釋放至細胞外，放大炎癥反應［18-19］。研究發現，在AS破裂的斑塊中檢測到大量的Caspase-1，進一步證明NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡參與AS的發展［20］。與對照組相比，炎癥小體相關蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、焦亡相關蛋白GSDMD和N-GSDMD在模型組中表達量升高，說明炎癥反應及細胞焦亡參與AS，進一步說明造模成功。與模型組相比，NLRP3、ASC和Caspase-1在利拉魯肽高濃度組中表達量降低，ASC在利拉魯肽中濃度組中表達量降低，說明高劑量的利拉魯肽可以抑制炎癥小體的表達。

隨著對AS的研究日益深入，科研工作者開始探索其發病機制。過量的脂質沉積導致了AS斑塊的形成，而炎癥反應會使促炎細胞因子釋放，介導細胞焦亡，從而加速AS的發展［21］。本研究表明利拉魯肽顯著抑制ox-LDL誘導的內皮細胞NLRP3炎性小體活化，減少內皮細胞的焦亡，從而發揮抗動脈硬化作用，有望為臨床AS的治療研究提供新的思路和新靶點。由于經費的限制，本實驗未設計動物實驗，以及NLRP3炎癥小體的具體激活機制，這也是本研究未來研究發展方向。

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