基于微衛星分析黑龍江省南部小飛鼠種群的遺傳多樣性

關鍵詞：小飛鼠；微衛星；遺傳多樣性Keywords：Siberian flying squirrel（Pteromys volans）；Microsatellite；Genetic diversity

小飛鼠（Pteromys volans）隸屬哺乳綱（Mammalia）嚙齒目（Rodentia）松鼠科（Sciuridae）飛鼠屬（Pteromys），為樹棲夜行滑行類物種，在國外主要分布于歐亞大陸北部，國內主要分布在東北、華北和西北等北方林區［1?3］。不合理的森林采伐，棲息地的喪失與破碎化，已導致全球許多地區的小飛鼠種群處于瀕危狀態［4?5］。小飛鼠作為森林可持續經營的重要指示和傘護物種［6］，我國將其列為“易?！迸c“三有”物種［7?8］。目前國外在小飛鼠形態、家域、巢址利用、棲息地選擇與管理、遺傳多樣性與分化和分子系統進化等領域已開展系列研究［9?15］，國內僅在籠養活動節律、分子標記篩選、分類地位和樹洞保溫機制等方面進行了初步研究［16?19］。

遺傳多樣性為生物多樣性保護的基礎，是衡量物種生存與利用的重要指標［20］。遺傳多樣性的降低與近交衰退會導致物種滅絕，因此，遺傳信息評價結果可為物種實施科學地保護與管理提供參考［21］。我國東北地區曾受森林采伐、盜獵和氣候變化等因素影響，使許多物種面臨生存威脅，導致物種近交、遺傳多樣性喪失和種群遺傳分化等遺傳信息發生改變［18，22］。小飛鼠作為主要以樹洞營巢的典型樹棲森林型物種，其種群更易受到棲息地變化的影響［12］。當前，對小飛鼠種群遺傳多樣性及相關因素的狀態、種群未來對環境變化的適應性等問題，亟待開展進一步研究。本研究基于微衛星分子標記，全面評估黑龍江省南部林區小飛鼠種群的遺傳多樣性，為該物種的科學保護與管理提供參考。

1 材料與方法

1. 1 研究地區與樣本采集

2018年秋、冬季和2019年秋、冬季，在張廣才嶺西北部的賓縣，以及2022年秋、冬季和2023年秋、冬季，在張廣才嶺東北部的方正縣、南部的葦河林業局，老爺嶺南部的穆棱林業局4個黑龍江省南部地區（圖1）采集小飛鼠毛發樣本，共91份（表1）。樣本采集時，首先在野外尋找小飛鼠的樹洞巢，敲擊樹干發現個體后，采用網捕法在洞口處捕獲個體。在個體尾部取20根帶有毛囊的毛發樣本，收集于封口袋內，標號并GPS定位。在捕獲個體尾端剪掉部分毛發標記，避免個體重復采樣，最后將個體放歸野外，?20 ℃保存樣本備用。本研究已通過牡丹江師范學院實驗動物倫理委員會審查（IACUC-MNU-0-901）。

1. 2 DNA 提取

將20根帶有毛囊的毛發樣本（長約0. 5 cm）用75%乙醇清洗2次除菌，再用蒸餾水清洗1次，棄廢液后于鼓風干燥箱內55 ℃干燥。按TIANamp MicroDNA Kit試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）使用說明書提取處理后的毛囊樣本DNA。用ND-1000紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc. ，America）測定DNA質量濃度，稀釋至10 ng/μL，4 ℃存放備用。為進一步驗證所用樣本來自不同個體，基于后續微衛星分型數據，利用軟件Excel microsatellitetool kit［23］尋找數據中相匹配的基因型。若不同樣本所有位點的基因型相同或只有1個位點的1個等位基因存在差異，則可判定為同一個體［24］。

1. 3 PCR 擴增

使用8 對微衛星引物［17?18］對小飛鼠DNA 進行PCR擴增，上游引物5′端進行熒光標記（表2）。擴增體系20. 0 μL，包括5 U/μL Ex Taq DNA聚合酶（寶生物工程（大連）有限公司）0. 1 μL，10 × Buffer 2. 0 μL，2. 5 mmol/L dNTPs 1. 6 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0. 5 μL，模板DNA 1. 5 μL，超純水13. 8 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。擴增產物經2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中熒光標記引物成功擴增的PCR 產物用ABI3730XL測序儀（Applied Biosystems Inc. ，America）進行毛細管電泳檢測，判讀等位基因大小。PCR擴增選擇3 次重復，其中2 次及以上重復均只獲得1 條PCR產物帶的判定為純合子，3次重復均為2條產物帶的判定為雜合子［18］。為了監測污染，在擴增的同時均附加一個不含DNA的陰性對照。所有引物合成和基因分型均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1. 4 數據處理

首先，利用Micro-Checker 2. 2. 3［25］檢測各位點是否存在無效等位基因（1 allele），判斷位點是否存在嚴重的分型錯誤及能夠滿足遺傳學分析要求；然后，利用Excel microsatellite tool kit［23］計算各位點和種群的多態信息含量（PIC），GENALEX 6. 0［26］計算種群的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和近交系數（FIS），AllelicDiversity Analyzer（ADZE）1. 0［27］計算種群的等位基因豐富度（AR），再利用Genepop 4. 0［28］檢測種群是否符合Hardy-Weinberg平衡，以及位點間的連鎖不平衡，概率檢驗采用馬可夫鏈法（Markov chainmethod），參數為10 000 dememorization、20 batch 和5 000 iteration；最后，利用Bottleneck 1. 2［29］檢測小飛鼠種群是否經歷過瓶頸效應，選擇兩階變異模型（two-phase model，TPM）和逐步突變模型（stepwisemutation model，SMM）進行Wilcoxon檢驗，重復1 000次，其中，TPM 被認為是微衛星分析的最適合模型［30］，TPM選擇95%變異遵從SMM，變異系數為12［29］。采用配對樣本t 檢驗對種群Na與Ne、Ho與He進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

基于微衛星分型數據證實，91份毛發樣本DNA均來自不同個體。8個微衛星位點經過Micro-Checker檢測，未發現有無效等位基因，位點間均不存在連鎖不平衡，說明基因分型的微衛星數據可靠，可用于種群遺傳學分析。91只個體的微衛星數據檢測發現，8 個微衛星位點的多態信息含量（PIC）為0. 862 ～0. 945，皆為高多態性位點（PIC值 gt; 0. 500）；各種群的PIC 為0. 853 ～ 0. 864，整體種群的PIC 為0. 891。種群的Na為12. 0 ～ 14. 4個，平均12. 9個；Ne為8. 1 ～8. 8個，平均8. 6個；等位基因豐富度（AR）為8. 0 ～8. 8，平均8. 4，各種群均呈現平均有效等位基因數顯著少于實際等位基因數（P lt; 0. 01）。種群的Ho 為0. 832 ～ 0. 925，平均0. 887；He 為0. 865 ～ 0. 876，平均0. 872，二者之間無顯著差異（P gt; 0. 05）。以上參數顯示，小飛鼠種群遺傳多樣性豐富，其中，葦河種群遺傳多樣性最高，穆棱種群次之，方正和賓縣種群較低（表3）。

微衛星數據顯示，方正與賓縣種群顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，呈現一定程度的雜合度不足，FIS為顯著偏離零的正值（P lt; 0. 05）（表3），表明方正與賓縣種群存在一定程度的近親繁殖情況。種群瓶頸效應檢測顯示，方正種群的TPM模型Wilcoxon檢驗呈現顯著水平（P lt; 0. 05），賓縣種群為臨界顯著水平（P = 0. 057），表明方正與賓縣種群經歷了近期不同程度的遺傳瓶頸效應。

3 討論

雜合度能反映種群在多位點上的遺傳變異，是衡量種群遺傳多樣性的最適參數。本研究微衛星數據顯示，小飛鼠種群Ho 和He 分別為0. 887（0. 832 ～0. 925）和0. 872（0. 865 ～ 0. 876），均高于芬蘭（Ho =0. 410 ～ 0. 772，He = 0. 430 ～ 0. 748）［5，14，31］和愛沙尼亞（Ho = 0. 608，He = 0. 764）［5］的小飛鼠種群；黑龍江省南部林區4個局域種群小飛鼠種群遺傳多樣性豐富，其中葦河種群遺傳多樣性最高，穆棱種群次之，方正和賓縣種群較低。微衛星的等位基因數為位點在進化過程中所積累的遺傳變異，可評估種群對環境適應的潛力。其中，有效等位基因數是種群內個體隨機交配在后代能夠固定的等位基因數，其與實際等位基因數之間的差異可以粗略地顯示種群未來等位基因丟失的風險［32］。本研究各局域種群均呈現平均有效等位基因數極顯著少于實際等位基因數，提示小飛鼠種群的等位基因頻率分布處于一個不穩定狀態，受遺傳漂變等因素的影響，未來種群發展中存在等位基因丟失的風險。因此，應進一步加強黑龍江省南部小飛鼠種群的保護與管理，防止種群遺傳多樣性的急劇下降。

在Hardy-Weinberg 平衡檢驗中發現，本研究方正、賓縣種群偏離平衡。Hardy-Weinberg 平衡是建立在自然種群隨機交配假設的基礎上，認為在瀕危物種種群中出現不符合平衡的現象，主要原因有無效等位基因、種群亞結構和近親繁殖導致的雜合度不足［18，33?34］。本研究未檢測到無效等位基因和各局域種群內的亞結構，因此排除這2個因素導致其偏離Hardy-Weinberg平衡的可能。FIS是評價種群是否存在近親繁殖的一個重要參數，當FIS為正值時表示群體內存在近交［34?35］。方正、賓縣種群的FIS均呈現顯著偏離零的正值，因此認為2個種群內的近親繁殖是導致微衛星位點偏離Hardy-Weinberg平衡的主要原因。種群數量的下降，各局域種群之間的隔離可能是影響種群內個體近親繁殖的重要因素。同樣在愛沙尼亞，因小飛鼠種群的棲息地破碎化和種群數量急劇下降也表現出了近親繁殖［5］。

本研究同樣檢測到方正、賓縣過去種群數量的持續下降，已導致其種群不同程度的遺傳瓶頸效應。與種群數量下降一樣，種群的隔離與破碎化、基因流喪失會給瀕危物種遺傳多樣性帶來不利影響［36］。本研究較高的種群遺傳多樣性表明，小飛鼠在其近期歷史中可能具有較大的有效種群規模［37］，而種群間的多樣性水平差異，可能是受各局域種群歷史數量下降程度與隔離的雙重影響。過去大量的森林采伐使小飛鼠偏好的成熟林、過熟林營巢棲息地減少，導致其種群數量下降；相對于葦河、穆棱種群所在的國有林區，方正、賓縣種群所在區域為地方政府管轄林區，其所處的張廣才嶺北部棲息地破碎化更為嚴重［38］，可能阻礙小飛鼠種群間的擴散與基因交流較為明顯［18，32］，因此，呈現出方正、賓縣種群遺傳瓶頸效應、近親繁殖和遺傳多樣性水平相對較低的格局。同時，研究結果也提示，有必要進一步開展小飛鼠種群遺傳結構和基因交流的研究，以及棲息地修復和生態廊道的構建，從而實現該物種的種群增長與擴散。