基于微衛(wèi)星分析黑龍江省南部小飛鼠種群的遺傳多樣性

關(guān)鍵詞：小飛鼠；微衛(wèi)星；遺傳多樣性Keywords：Siberian flying squirrel（Pteromys volans）；Microsatellite；Genetic diversity

小飛鼠（Pteromys volans）隸屬哺乳綱（Mammalia）嚙齒目（Rodentia）松鼠科（Sciuridae）飛鼠屬（Pteromys），為樹棲夜行滑行類物種，在國外主要分布于歐亞大陸北部，國內(nèi)主要分布在東北、華北和西北等北方林區(qū)［1?3］。不合理的森林采伐，棲息地的喪失與破碎化，已導(dǎo)致全球許多地區(qū)的小飛鼠種群處于瀕危狀態(tài)［4?5］。小飛鼠作為森林可持續(xù)經(jīng)營的重要指示和傘護(hù)物種［6］，我國將其列為“易危”與“三有”物種［7?8］。目前國外在小飛鼠形態(tài)、家域、巢址利用、棲息地選擇與管理、遺傳多樣性與分化和分子系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域已開展系列研究［9?15］，國內(nèi)僅在籠養(yǎng)活動節(jié)律、分子標(biāo)記篩選、分類地位和樹洞保溫機(jī)制等方面進(jìn)行了初步研究［16?19］。

遺傳多樣性為生物多樣性保護(hù)的基礎(chǔ)，是衡量物種生存與利用的重要指標(biāo)［20］。遺傳多樣性的降低與近交衰退會導(dǎo)致物種滅絕，因此，遺傳信息評價(jià)結(jié)果可為物種實(shí)施科學(xué)地保護(hù)與管理提供參考［21］。我國東北地區(qū)曾受森林采伐、盜獵和氣候變化等因素影響，使許多物種面臨生存威脅，導(dǎo)致物種近交、遺傳多樣性喪失和種群遺傳分化等遺傳信息發(fā)生改變［18，22］。小飛鼠作為主要以樹洞營巢的典型樹棲森林型物種，其種群更易受到棲息地變化的影響［12］。當(dāng)前，對小飛鼠種群遺傳多樣性及相關(guān)因素的狀態(tài)、種群未來對環(huán)境變化的適應(yīng)性等問題，亟待開展進(jìn)一步研究。本研究基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記，全面評估黑龍江省南部林區(qū)小飛鼠種群的遺傳多樣性，為該物種的科學(xué)保護(hù)與管理提供參考。

1 材料與方法

1. 1 研究地區(qū)與樣本采集

2018年秋、冬季和2019年秋、冬季，在張廣才嶺西北部的賓縣，以及2022年秋、冬季和2023年秋、冬季，在張廣才嶺東北部的方正縣、南部的葦河林業(yè)局，老爺嶺南部的穆棱林業(yè)局4個(gè)黑龍江省南部地區(qū)（圖1）采集小飛鼠毛發(fā)樣本，共91份（表1）。樣本采集時(shí)，首先在野外尋找小飛鼠的樹洞巢，敲擊樹干發(fā)現(xiàn)個(gè)體后，采用網(wǎng)捕法在洞口處捕獲個(gè)體。在個(gè)體尾部取20根帶有毛囊的毛發(fā)樣本，收集于封口袋內(nèi)，標(biāo)號并GPS定位。在捕獲個(gè)體尾端剪掉部分毛發(fā)標(biāo)記，避免個(gè)體重復(fù)采樣，最后將個(gè)體放歸野外，?20 ℃保存樣本備用。本研究已通過牡丹江師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查（IACUC-MNU-0-901）。

1. 2 DNA 提取

將20根帶有毛囊的毛發(fā)樣本（長約0. 5 cm）用75%乙醇清洗2次除菌，再用蒸餾水清洗1次，棄廢液后于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)55 ℃干燥。按TIANamp MicroDNA Kit試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）使用說明書提取處理后的毛囊樣本DNA。用ND-1000紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Inc. ，America）測定DNA質(zhì)量濃度，稀釋至10 ng/μL，4 ℃存放備用。為進(jìn)一步驗(yàn)證所用樣本來自不同個(gè)體，基于后續(xù)微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)，利用軟件Excel microsatellitetool kit［23］尋找數(shù)據(jù)中相匹配的基因型。若不同樣本所有位點(diǎn)的基因型相同或只有1個(gè)位點(diǎn)的1個(gè)等位基因存在差異，則可判定為同一個(gè)體［24］。

1. 3 PCR 擴(kuò)增

使用8 對微衛(wèi)星引物［17?18］對小飛鼠DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5′端進(jìn)行熒光標(biāo)記（表2）。擴(kuò)增體系20. 0 μL，包括5 U/μL Ex Taq DNA聚合酶（寶生物工程（大連）有限公司）0. 1 μL，10 × Buffer 2. 0 μL，2. 5 mmol/L dNTPs 1. 6 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0. 5 μL，模板DNA 1. 5 μL，超純水13. 8 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中熒光標(biāo)記引物成功擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物用ABI3730XL測序儀（Applied Biosystems Inc. ，America）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，判讀等位基因大小。PCR擴(kuò)增選擇3 次重復(fù)，其中2 次及以上重復(fù)均只獲得1 條PCR產(chǎn)物帶的判定為純合子，3次重復(fù)均為2條產(chǎn)物帶的判定為雜合子［18］。為了監(jiān)測污染，在擴(kuò)增的同時(shí)均附加一個(gè)不含DNA的陰性對照。所有引物合成和基因分型均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

首先，利用Micro-Checker 2. 2. 3［25］檢測各位點(diǎn)是否存在無效等位基因（1 allele），判斷位點(diǎn)是否存在嚴(yán)重的分型錯(cuò)誤及能夠滿足遺傳學(xué)分析要求；然后，利用Excel microsatellite tool kit［23］計(jì)算各位點(diǎn)和種群的多態(tài)信息含量（PIC），GENALEX 6. 0［26］計(jì)算種群的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和近交系數(shù)（FIS），AllelicDiversity Analyzer（ADZE）1. 0［27］計(jì)算種群的等位基因豐富度（AR），再利用Genepop 4. 0［28］檢測種群是否符合Hardy-Weinberg平衡，以及位點(diǎn)間的連鎖不平衡，概率檢驗(yàn)采用馬可夫鏈法（Markov chainmethod），參數(shù)為10 000 dememorization、20 batch 和5 000 iteration；最后，利用Bottleneck 1. 2［29］檢測小飛鼠種群是否經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)，選擇兩階變異模型（two-phase model，TPM）和逐步突變模型（stepwisemutation model，SMM）進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次，其中，TPM 被認(rèn)為是微衛(wèi)星分析的最適合模型［30］，TPM選擇95%變異遵從SMM，變異系數(shù)為12［29］。采用配對樣本t 檢驗(yàn)對種群Na與Ne、Ho與He進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

基于微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)證實(shí)，91份毛發(fā)樣本DNA均來自不同個(gè)體。8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)經(jīng)過Micro-Checker檢測，未發(fā)現(xiàn)有無效等位基因，位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡，說明基因分型的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)可靠，可用于種群遺傳學(xué)分析。91只個(gè)體的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)檢測發(fā)現(xiàn)，8 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）為0. 862 ～0. 945，皆為高多態(tài)性位點(diǎn)（PIC值 gt; 0. 500）；各種群的PIC 為0. 853 ～ 0. 864，整體種群的PIC 為0. 891。種群的Na為12. 0 ～ 14. 4個(gè)，平均12. 9個(gè)；Ne為8. 1 ～8. 8個(gè)，平均8. 6個(gè)；等位基因豐富度（AR）為8. 0 ～8. 8，平均8. 4，各種群均呈現(xiàn)平均有效等位基因數(shù)顯著少于實(shí)際等位基因數(shù)（P lt; 0. 01）。種群的Ho 為0. 832 ～ 0. 925，平均0. 887；He 為0. 865 ～ 0. 876，平均0. 872，二者之間無顯著差異（P gt; 0. 05）。以上參數(shù)顯示，小飛鼠種群遺傳多樣性豐富，其中，葦河種群遺傳多樣性最高，穆棱種群次之，方正和賓縣種群較低（表3）。

微衛(wèi)星數(shù)據(jù)顯示，方正與賓縣種群顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，呈現(xiàn)一定程度的雜合度不足，F(xiàn)IS為顯著偏離零的正值（P lt; 0. 05）（表3），表明方正與賓縣種群存在一定程度的近親繁殖情況。種群瓶頸效應(yīng)檢測顯示，方正種群的TPM模型Wilcoxon檢驗(yàn)呈現(xiàn)顯著水平（P lt; 0. 05），賓縣種群為臨界顯著水平（P = 0. 057），表明方正與賓縣種群經(jīng)歷了近期不同程度的遺傳瓶頸效應(yīng)。

3 討論

雜合度能反映種群在多位點(diǎn)上的遺傳變異，是衡量種群遺傳多樣性的最適參數(shù)。本研究微衛(wèi)星數(shù)據(jù)顯示，小飛鼠種群Ho 和He 分別為0. 887（0. 832 ～0. 925）和0. 872（0. 865 ～ 0. 876），均高于芬蘭（Ho =0. 410 ～ 0. 772，He = 0. 430 ～ 0. 748）［5，14，31］和愛沙尼亞（Ho = 0. 608，He = 0. 764）［5］的小飛鼠種群；黑龍江省南部林區(qū)4個(gè)局域種群小飛鼠種群遺傳多樣性豐富，其中葦河種群遺傳多樣性最高，穆棱種群次之，方正和賓縣種群較低。微衛(wèi)星的等位基因數(shù)為位點(diǎn)在進(jìn)化過程中所積累的遺傳變異，可評估種群對環(huán)境適應(yīng)的潛力。其中，有效等位基因數(shù)是種群內(nèi)個(gè)體隨機(jī)交配在后代能夠固定的等位基因數(shù)，其與實(shí)際等位基因數(shù)之間的差異可以粗略地顯示種群未來等位基因丟失的風(fēng)險(xiǎn)［32］。本研究各局域種群均呈現(xiàn)平均有效等位基因數(shù)極顯著少于實(shí)際等位基因數(shù)，提示小飛鼠種群的等位基因頻率分布處于一個(gè)不穩(wěn)定狀態(tài)，受遺傳漂變等因素的影響，未來種群發(fā)展中存在等位基因丟失的風(fēng)險(xiǎn)。因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)黑龍江省南部小飛鼠種群的保護(hù)與管理，防止種群遺傳多樣性的急劇下降。

在Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，本研究方正、賓縣種群偏離平衡。Hardy-Weinberg 平衡是建立在自然種群隨機(jī)交配假設(shè)的基礎(chǔ)上，認(rèn)為在瀕危物種種群中出現(xiàn)不符合平衡的現(xiàn)象，主要原因有無效等位基因、種群亞結(jié)構(gòu)和近親繁殖導(dǎo)致的雜合度不足［18，33?34］。本研究未檢測到無效等位基因和各局域種群內(nèi)的亞結(jié)構(gòu)，因此排除這2個(gè)因素導(dǎo)致其偏離Hardy-Weinberg平衡的可能。FIS是評價(jià)種群是否存在近親繁殖的一個(gè)重要參數(shù)，當(dāng)FIS為正值時(shí)表示群體內(nèi)存在近交［34?35］。方正、賓縣種群的FIS均呈現(xiàn)顯著偏離零的正值，因此認(rèn)為2個(gè)種群內(nèi)的近親繁殖是導(dǎo)致微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡的主要原因。種群數(shù)量的下降，各局域種群之間的隔離可能是影響種群內(nèi)個(gè)體近親繁殖的重要因素。同樣在愛沙尼亞，因小飛鼠種群的棲息地破碎化和種群數(shù)量急劇下降也表現(xiàn)出了近親繁殖［5］。

本研究同樣檢測到方正、賓縣過去種群數(shù)量的持續(xù)下降，已導(dǎo)致其種群不同程度的遺傳瓶頸效應(yīng)。與種群數(shù)量下降一樣，種群的隔離與破碎化、基因流喪失會給瀕危物種遺傳多樣性帶來不利影響［36］。本研究較高的種群遺傳多樣性表明，小飛鼠在其近期歷史中可能具有較大的有效種群規(guī)模［37］，而種群間的多樣性水平差異，可能是受各局域種群歷史數(shù)量下降程度與隔離的雙重影響。過去大量的森林采伐使小飛鼠偏好的成熟林、過熟林營巢棲息地減少，導(dǎo)致其種群數(shù)量下降；相對于葦河、穆棱種群所在的國有林區(qū)，方正、賓縣種群所在區(qū)域?yàn)榈胤秸茌犃謪^(qū)，其所處的張廣才嶺北部棲息地破碎化更為嚴(yán)重［38］，可能阻礙小飛鼠種群間的擴(kuò)散與基因交流較為明顯［18，32］，因此，呈現(xiàn)出方正、賓縣種群遺傳瓶頸效應(yīng)、近親繁殖和遺傳多樣性水平相對較低的格局。同時(shí)，研究結(jié)果也提示，有必要進(jìn)一步開展小飛鼠種群遺傳結(jié)構(gòu)和基因交流的研究，以及棲息地修復(fù)和生態(tài)廊道的構(gòu)建，從而實(shí)現(xiàn)該物種的種群增長與擴(kuò)散。