環境DNA揭示濱海電廠循環水通道中鯡科魚類帶來的潛在風險

摘 要 魚類堵塞濱海電廠循環水通道濾網或大規模進入循環水通道，將對濱海電廠的運行造成嚴重的影響，導致重大經濟損失. 為了解濱海電廠循環水通道中魚類群落的生物多樣性及其時空演變規律，發現循環水通道中的潛在致災物種，我們在夏季（6、7月）、秋季（9、10月）、冬季（1月）分別利用環境DNA（Environmental DNA，eDNA）宏條形碼技術對汕頭海門電廠循環水通道5個位點的魚類生物多樣性進行分析. 我們從69份eDNA樣品中一共檢測出32目，71科，138屬，149種魚類，其中鯡形目魚類豐度最高，占魚類read總數的24.85%. 此外，相對豐度較高的物種為花蓮沙丁魚、褐菖鲉、斯氏凡鯔、白點藍子魚、褐籃子魚、長頭小沙丁魚、裴濟小沙丁魚、平鯛、鯔魚、島側帶小公魚等. 各月份的魚類Alpha多樣性差異較大，9月份的Shannon指數、Simpson指數、物種數量和Chao1指數均是各個月份中最低的，前兩者從夏季到冬季大體呈現V型變化，先下降再提升；后兩者則在1月份再次下降. 每個月份的優勢物種組成呈現明顯變化，在夏季，多種鯡科魚類成為優勢物種，這是一種常見的濱海電廠致災魚類物種，應當引起關注. 本研究證明了eDNA技術用于監測濱海電廠魚類多樣性及其時空演變規律的可行性，揭示了濱海電廠冷卻循環水系統中鯡科魚類帶來的風險，為控制和管理海洋魚類對濱海電廠安全運行的影響提供基礎數據支持和科學依據.

關鍵詞 環境DNA；濱海電廠；魚類物種多樣性；致災物種

中圖分類號 X-835 文獻標識碼 A

大型火力發電廠需要使用大量的水對發電機組設備進行冷卻，對一臺60千瓦萬機組來說，循環冷卻水的需求量達到大約100 000 m3/h[1]. 因此，大多數沿海國家選擇將大型火力發電廠建在海邊，以便于直接取用海水作為冷卻媒介，但是這也對濱海電廠的安全運行和周邊海域的生態系統帶來新的挑戰.

目前，關于濱海電廠循環水通道海生物污染的研究大多集中在貝類、藤壺、藻類等，并已提出一系列有效的防治方案. 為了有效殺滅貝類生物，采用生物預防性控制方案，將非氯化性殺貝劑與次氯酸鈉結合[2]，有效控制了循環冷卻水系統的海生物污染. 針對藤壺以及水螅蟲污染，采用間隔交替加非氧化性殺生劑和氧化性殺生劑方案，同時采用連續加藥方式，有效解決海生物污染問題[3-5]. 電解海水制氯方案則通過電化學作用將海水分解成原子態氧，將海水中的微生物、菌類直接殺死，使海生物失去附著能力，起到防污、滅藻作用[6]. 上述研究和實踐表明，預防濱海電廠循環水通道海生物污染，要對所在海域生物的物種種類、繁殖生長規律進行監測，定期根據實際情況不斷調整藥劑投加量和投加周期，持續優化方案，保證電廠循環水系統清潔、高效運行[7]. 然而，關于濱海電廠循環水通道中的魚類研究并不多. 近岸海域魚群的大規模出現，經常給濱海電廠的運行造成重大的影響. 例如在法國和英國許多濱海電廠曾遭受鯡科魚類的影響[8-9]，導致機組功率降低. 因此，除了水母、扇貝、藤壺和藻類，魚類也是一類在濱海電廠循環水通道災害治理中需要關注的海生物，對循環水通道中的魚類群落進行分析鑒定顯得尤為重要.

如果在循環水通道中直接采集魚類和魚卵進行形態學鑒定，不止危害生產安全，也存在一系列技術上的困難，如物種鑒定需要形態學分類知識、部分物種無法捕捉、一些形態相似的物種無法分辨，對魚卵和幼體的鑒定尤為困難.

eDNA技術通過從水、土壤沉積物等中提取DNA，對基因組的特定DNA片段進行PCR（聚合酶鏈式反應）擴增和高通量測序，從而對環境樣品中多生物群落進行監測[10]. 該技術能夠快速檢測出水域環境中的稀有種、瀕危種及入侵種，應用于物種多樣性檢測、生物量評估、入侵物種和珍稀物種監測等方面，是一種新型的生物資源調查方法[11]. 與傳統的生物多樣性監測方法相比，eDNA技術方法具有非入侵性、成本效益高和節省時間等優點，可以補充現有的監測技術，并擴大評估能力，可以有效的考慮生物多樣性的全部范圍[12]. 程云山等[13]研究發現eDNA技術在浮游植物物種多樣性和群落組成檢測中具有更高的分辨率和精確性，可提供更加豐富的數據. 作為一種評價生物多樣性的新方法，eDNA技術在魚類的野外監測以及推斷其他脊椎動物、無脊椎動物和食物網中具有巨大的應用潛力[14]. eDNA技術還可以檢測在魚類物種發生的季節性變化，深入了解物種存在和群落組成的空間和時間[15].

為了分析濱海電廠循環水通道各區域魚類物種多樣性及其時空演變規律，鑒定致災物種，本研究在夏季（6、7月）、秋季（9、10月）、冬季（1月），利用eDNA技術對海門電廠入水口到出水口的五個位點的魚類多樣性進行調查，并分析魚類的物種組成及各季節魚類相對豐度的變化. 本研究旨在明確海門電廠各位點魚類多樣性特征，探討環境DNA技術在海門電廠監測魚類多樣性及分布的可行性，為濱海電廠安全運行和魚類資源可持續開發提供基礎數據支持和科學依據.

1 材料與方法

1.1 環境DNA樣品采集

本研究樣品分別于2023年6月、7月、9月、10月及2024年1月在位于廣東汕頭的海門電廠采集. 在海門電廠共設置5個位點（S1、S2、S3、S4、S5）. S1是引水渠的入水口，S2是1號和2號機組的前水池，S5是3號和4號機組的前水池，S3是1號和2號機組的虹吸井，S4是出水口. 使用采水器在不同位點采集表層水樣品，每個位點各取3個平行樣.

1.2 環境DNA提取、擴增及測序

使用環境DNA提取試劑盒（MT058，南京易基諾環保科技有限公司）提取濾膜上富集的eDNA，并利用QubitTM 4 Fluorometer（Q33226）和ND5000進行濃度定量和純度檢測.

對每一份eDNA分別利用TE2（F：5’-AAACTCGTGCCAGCCACCR-3’；R：5’-GGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’）進行PCR擴增. 用Premix EX Taq II進行PCR擴增，采用20 μL反應體系：10 μL Premix EX Taq II，0.4 μL ROX Reference Dye，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，1 μL DNA，7.8 μL ddH2O. 在基因擴增儀（TC-96/G/H（b）B）中進行擴增反應，條件如下：105 ℃熱蓋，95 ℃初始變性3 min；95 ℃變性30 s，56.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存.

為了減少單個的PCR誤差，對每個樣品進行3次PCR反應. PCR產物通過質量濃度為0.02 kg/L瓊脂糖凝膠電泳和Gel Doc EZ（735BR00194）儀器拍攝凝膠圖像檢查條帶大小和特異性，并使用全自動DNA移液工作站對PCR產物進行等摩爾混合，使用VAHTS DNA Clean Beads（N411-02）試劑盒對PCR混合產物進行純化. 使用QubitTM 4 Fluorometer（Q33226）對純化的混合產物進行定量. 將純化的PCR混合產物用于后續測序. 用VAHTS？誖Universal DNA Library Prep Kit for Ion Torrent V2（ND702）試劑盒進行文庫構建，該試劑盒可以將純化的混合PCR產物轉換成Ion Torrent高通量測序平臺專用文庫. 在二代測序之前，使用凝膠電泳和QubitTM 4 Fluorometer對所有DNA產品的長度和濃度進行檢測. 將樣品的最終濃度調整為1×10－10 mol/L. 用lon OneTouchTM 2和lon OneTouchTM ES制備和富集測序模板，通過lon PITM Chip Kit V3芯片在Proton Semiconductor Sequencer測序儀中測序.

1.3 生物信息學分析

測序產生的原始序列經過質控過濾、拼接后獲得優質序列. 高通量測序的數據分析全部基于ubuntu14.04版本下的EcoView3.0版本軟件. 通過唯一的樣本標簽（12 bp條形碼的最大不匹配數設置為2）進行裁剪、排序和區分[16]. 采用UPARSE[17]將所有序列聚類為操作分類單元ASVs），相似度閾值為97%. 注釋數據庫為中國魚類物種數據庫. 序列按照相似性≥97%進行ASV（Amplicon Sequence Variant）聚類分析，然后將ASV代表序列與自建的數據庫進行比對、分類注釋，并得到相應的ASV豐度表.

通過Alpha多樣性來反映研究區域的魚類物種多樣性，使用R軟件vegan分別計算了物種數量指數、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數和Good’s Coverage，對注釋結果進行群落豐富度、多樣性及覆蓋度分析.

2 結果

2.1 魚類物種組成

對海門電廠5個位點一共69個環境DNA樣品進行建庫、測序以及嚴格的質量過濾后一共獲得1 978 757條read，包括1 636 902條脊椎動物read（12S引物擴增），分配到了248個ASV. 每個ASV的平均深度為7 979.

具體地說，一共獲得了1 636 902條魚類read，9 739條哺乳動物read，12 011條鳥類read和614條爬行動物read，分別聚合成225、13、7、3個ASV（表1）. 五個類群的測序深度分別是7 275（魚類）、749（哺乳動物）、1 716（鳥類）和205（爬行動物）.

在海門電廠的5個位點里，我們一共鑒定了32個魚類譜系（目）、5個鳥類譜系（科）、2個哺乳動物譜系（科）和1個爬行動物譜系（科）. 在魚類中，鯡形目（Clupeiformes，24.85%

的read和14.77%的ASV）、鯔形目（Mugiliformes，17.09%的read和4.03%的ASV）和蝦虎魚目（Gobiiformes，16.95%的read和16.78%的ASV）在魚類中的豐度最高，其次是隆頭魚目（Labriformes，12.74%的read和2.68%的ASV）、鱸形目（Perciformes，11.12%的read和18.79%的ASV）和鯉形目（Cypriniformes，2.05%的read和39.60%的ASV）. 其中，鯉形目和鱸形目的種類最高.

在物種水平上，我們在海門電廠的5個位點一共鑒定了157個物種，其中包括了149種魚類、2種哺乳動物、5種鳥類和1種爬行動物（表1）. 基于各月份位點的相對序列豐度檢測到的優勢魚種見圖1，豐度排名前10的物種分別為花蓮沙丁魚（Sardinella hualiensis）、褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）、斯氏凡鯔（Valamugil speigleri）、白點藍子魚（Siganus sutor）、褐籃子魚（Siganus fuscescens）、長頭小沙丁魚（Sardinella longiceps）、裴濟小沙丁魚（Sardinella fijiensis）、平鯛（Rhabdosargus sarba）、鯔魚（Mugil cephalus）、島側帶小公魚（Stolephorus insularis）. 其中平鯛、裴濟小沙丁魚、花蓮沙丁魚、褐籃子魚在各月份位點中均被檢測到.

2.2 魚類多樣性分析

我們對各月份位點的生物群落Alpha多樣性指數進行分析（表2），豐富度方面，Chao1指數介于10.58～132.13之間，物種數量指數（Observed species指數）介于9.00～130.00之間，兩者的變化趨于一致；多樣性方面，Shannon指數范圍為0.78～3.88，Simpson指數范圍為0.17～0.87，兩者的變化趨勢也基本一致；同時各月份位點的Coverage值范圍為0.81～1.00，說明檢測結果基本上覆蓋到了全部魚種.

各月份位點之間的Alpha多樣性存在差異，6月份的S2位點和10月份的S3位點具有較高的物種數量指數和Chao1指數；Shannon指數最高的為10月份的S5位點（3.88），其次是7月份的S4位點（3.77），最低的為9月份的S3位點（0.78）；Simpson指數最高的為1月份的S3位點（0.87），其次是7月份的S4位點（0.83），最低的為9月份的S3位點（0.17）.

我們比較海門電廠循環水通道魚類物種多樣性的季節變化，S3位點是電廠1號和2號機組的虹吸井，虹吸井的作用是提取水源，是不適宜魚類生存的環境；S4位點是電廠的出水口，出水口通常會將冷卻水或循環水排放到水體中，影響水體的鹽度和溫度，水體呈現淡藍色. 這兩位點檢測到的魚類eDNA很可能是從上游位點帶過來. 因此，我們對S3和S4位點做單獨的分析，而將它們連同S1、S2以及三號四號機組的進水口S3監測到的eDNA信息一起，作為海門電廠魚類生物多樣性的代表. 我們對各月份的多樣性指數變化分析，結果發現（圖2），電廠各月份的多樣性指數均在9月份時最低，物種數量指數和Chao1指數變化趨勢相同，除9月至10月份存在上升趨勢外，其他月份均呈下降趨勢；Shannon指數和Simpson指數變化趨勢相同，除7月份至9月份呈下降趨勢，其余月份均呈上升趨勢，上升幅度較小. 各位點的Shannon指數和Simpson指數以及S1位點和S2位點的物種數量指數和Chao1指數，均在9月份時最低. S1位點和S2位點大致呈現出夏季高，秋季低，冬季低的情況，但在秋季10月時各位點多樣性指數有上升趨勢.

2.3 各月份位點物種組成及相對豐度變化

采用Origin軟件對各位點物種相對豐度進行Z分數歸一化處理，將處理過后的數據繪制成各位點物種相對豐度熱圖，以反映物種在各月份的相對豐度的變化.

從整個電廠來說，每個月份的優勢物種（相對豐度最高的6個物種）組成是明顯變化的. 在夏季（6-7月），優勢物種是斯氏凡鯔、長頭小沙丁魚、花蓮沙丁魚等；秋季（9-10月），上述物種的豐度顯著降低，而花身鯻（Terapon jarbua）、棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）、紫紅笛鯛（Lutjanus argentimaculatus）等成為優勢物種；在冬季，優勢物種進一步轉變為鯔魚、褐菖鲉、白點藍子魚等. 這提示了在每個季節需要進行風險管控的魚類是不一樣的.

同時，我們也注意到，與電廠整體情況相似的，入水口和前水池的優勢物種呈現顯著的季節變化. 且優勢物種與電廠總體的趨勢是相似的. 但是由于位點間的差異，入水口和前水池的優勢物種與整個電廠的優勢物種結構有一定的差異，例如，9月份，鳳鱭（Coilia mystus）在入水口和前水池均為優勢物種，但是在整個電廠中它的相對豐度較低等.

3 討 論

本研究使用eDNA技術分析了海門電廠5個位點的魚類多樣性，共檢測出32目、71科、138屬、149種魚類，其中鯡形目魚類豐度最高，占魚類read總數的24.85%. 結果表明，鯡科魚類對電廠循環水系統安全運行的影響可能是最高的，因此，我們需要重點關注鯡科魚類來采取防護措施.

海門電廠各月份Alpha多樣性及各站點的Alpha多樣性均存在季節差異性，各月份的多樣性指數均在9月份時最低，同時各位點的Shannon指數和Simpson指數在7月至9月期間呈現下降的趨勢，在9月時達到最低，這可能是由于夏季向秋季轉變，氣溫逐漸增高，而海洋魚類作為變溫動物，溫度的升高會影響魚類的生理代謝、繁殖、捕食與避敵行為，從而導致魚類的多樣性減少[18]. 各位點的物種數量指數和Chao1指數除S4位點外，均在9月時最低，這可能是由于S4位點是電廠的出水口，魚類從外海到電廠進水口再進入到出水口，電廠吸取海水產生的卷吸效應、溫排水和水中余氯的影響[19]，在出水口的魚類數量較少，同時隨著季節變化，溫度從高到低，進入到出水口的魚類減少，進而導致S4位點在1月時物種數量指數和Chao1指數最低. 而7月份的S4位點的Shannon指數和Simpson指數較高，原因可能是因為其余位點的物種具有較高的生物量，而生物量較高會導致多樣性指數整體較低[20]. 各位點的Alpha多樣性指數表明魚類在冷卻水系統中會受到影響，可以根據各位點的不同情況對防護方案進行調整，以確保電廠的安全運行.

影響取水安全的魚類主要包括小魚或優勢魚類的幼魚階段. 這些魚類數量豐富，其特點是沿海的季節性遷徙習性，逃逸能力較弱，由于水動力或水流，它們很容易被困在阻隔網或鼓網中[9]. 我們的研究結果發現，在濱海電廠冷卻水循環通道中，每個月份的優勢物種組成是明顯變化的，因此，為保障電廠安全運行，我們應該在每個季節對相應的優勢魚種進行重點的監測和防御. 例如，在夏季需要對幾種沙丁魚進行重點的關注，這是一類小型中上層鯡科魚類，而鯡科魚類是一類具有代表性的冷卻水進水堵塞魚類[9]，容易對循環水通道造成堵塞. 可采取水聲威懾系統，Maes等[21]發現在使用20-600 Hz的聲波將河口魚類從核電廠（NPP）的冷卻水入口處驅趕后，鯡科魚類的偏轉十分有效. 此外，我們還可以采取電柵、光柵的方式對其他魚類進行防控. 電柵可以轉移魚類[22]，但有效性取決于魚類的大小，而光柵會使魚類在火力發電廠的進水口偏轉[23].

當前，對濱海電廠災害物種的鑒定和監測，大多是基于捕撈和形態學鑒定方法. 這些方法所面臨的問題包括：昂貴的采樣費用、樣品獲取困難、高度依賴于分類學專業知識等[24]，特別是，使用傳統方式在濱海電廠循環水系統中捕撈魚類，容易對采樣人員的安全和電廠的平穩運行造成危險. 為了克服上述困難，本研究將環境DNA宏條形碼技術應用于濱海電廠循環水通道的魚類生物多樣性調查中，它具有以下特點：（1） 采樣與分析流程相對更為便捷迅速；（2） 物種辨別速率快，不需要依賴于專業的物種鑒定專家；（3） 準確性與重復性較好，跨實驗室間檢測實驗表明，魚類的物種重復率高達90%以上，魚類序列數相對豐度的一致性達到0.84；（4） 靈敏度和覆蓋度高，能檢測到一些傳統手段無法檢測到的物種；（5） 采樣過程對生物和環境友好[25-26]. 我們的結果表明，eDNA技術可適合用于對濱海電廠循環水通道這樣的復雜場景中的生物多樣性和致災物種進行監測.

在我們對濱海電廠冷卻水通道的eDNA監測數據中，我們發現了一些哺乳動物、鳥類、爬行動物和兩棲動物物種，它們的read數和ASV數所占的比例較低（表1），考慮到所研究的位點位于沿海岸邊附近，這些序列可能是來自沿岸的陸地生物，它們可能隨著河流進入近岸海域的.

本研究利用eDNA技術分析了海門電廠進水口（S1位點）、機組前水池（S2和S5位點）、機組虹吸井（S3位點）、出水口（S4位點）6月、7月、9月、10月和1月的魚類物種多樣性并研究其演變規律，通過采集各月份不同位點的水樣，共計69份eDNA樣品，隨后對這些樣品進行高通量測序及數據分析，獲得了豐富的魚類物種信息并研究其時空演變規律，表明該技術在研究濱海電廠內水域魚類物種多樣性研究中有較好的應用前景. 研究表明，電廠可以在春秋季物種豐富度較多時加大藥劑投加量和頻次，而在冬季物種豐富度較少時減少藥劑投加量頻次，不斷優化和完善方案，以有效控制和管理海洋魚類對濱海電廠安全運行的影響.

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Environmental DNA Reveals the Potential Risks

Posed by Clupeidae Fishes in Circulating

Water Channels of Coastal Power Plant

ZHENG Genghua1， YOU Liang1， FENG Tingyou1， ZHANG Feng1， XIAO Yongjun2， ZHAO Hancheng2， LI Kunhuan2， CAI Runlin2， LI Ping2， WANG Hui2， LIU Wenhua2， LIN Jianqing2

（1. China Huaneng Shantou Haimen Power Generation Co.， Ltd.， Shantou 515132， Guangdong， China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Disaster Warning and Protection， Shantou University， Shantou 515063， Guangdong， China）

Abstract" When fish get into the circulating water channel or clog the filter， it will seriously affect the functioning of coastal power plants and result in large financial losses. In order to understand the biodiversity of fish communities and their spatio-temporal variation in the circulating water system of coastal power plant and identify the species that cause disasters， the environmental DNA （eDNA） metabarcoding technique is used to investigate the fish biodiversity in summer （June and July）， autumn （September and October）， and winter （January） at five loci in the circulating water of the Haimen Power Plant in Shantou， China. The study identified a total of 32 orders， 71 families， 138 genera， and 149 species of fish from 69 eDNA samples. Among them， the Clupeidae fish exhibited the highest abundance， making up 24.85% of the total fish seen. In addition， the species with high relative abundance were Sardinella hualiensis、Sebastiscus marmoratus、Valamugil speigleri、Siganus sutor、Siganus fuscescens、Sardinella longiceps、Sardinella fijiensis、Rhabdosargus sarba、Mugil cephalus and Stolephorus insularis. The Alpha diversity exhibited significant variation over the months， with September displaying the lowest values for the Shannon index， Simpson index， Observed species index， and Chao1 index compared to all other months. The initial two indexes had a V-shaped fluctuation from summer to winter， initially declining and subsequently rising， but the last two experienced a subsequent decline in January. The composition of the dominating species exhibits significant variability among months. It is important to focus on the prevalence of herring fish throughout the summer， as they are typically species that cause disasters in coastal power plants. The study demonstrated the viability of using eDNA technology for monitoring fish diversity in the coastal power plant and analysing their temporal and spatial variations. It also identified the risks associated with Clupeidae fishes in the cooling circulating water system of the power plant. Furthermore， the study provided essential data and a scientific foundation for controlling and managing the impact of marine fishes on the safe operation of the coastal power plant.

Keywords" environmental DNA， coastal power plant， fish biodiversity， disaster-causing species

收稿日期：2024 －06 －09

作者簡介：鄭耿燁（1986—），男，廣東揭陽人，工程師，研究方向：發電企業安全生產管理.

E-mail：676212267@qq.com.

通信作者：林劍青（1986—），男，廣東揭陽人，男，博士，副教授，研究方向：海洋生物多樣性研究.

E-mail：linjianqing@stu.edu.cn

基金項目：華能集團科技項目（HNKJ22-H68）