苗藥地錦草對肝纖維化模型大鼠的改善作用及機制研究

關鍵詞地錦草；肝纖維化；TNF-α/NF-κB信號通路；苗藥

肝纖維化（hepaticfibrosis，HF）是指在各種致病因素的作用下使肝臟受到損傷，從而激活靜止狀態的肝星狀細胞（hepaticstellatecell，HSC），使HSC大量增殖、轉化以及細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）過度沉積和異常分布，最后形成纖維瘢痕的一種病理過程[1]。HF是眾多慢性重癥肝病的共同病理基礎，如果不加以防治會進一步發展為肝硬化，甚至肝癌[2―3]。研究指出，雖然HF是可逆的，但目前沒有批準的可用于抗HF的藥物[4]；另有研究指出，肝臟疾病相關的死亡率會隨著HF的加劇而呈指數增長[2]。因此，對HF進行有效干預顯得尤為重要。

地錦草為大戟科植物地錦EuphorbiahumifusaWilld.或斑地錦EuphorbiamaculataL.的干燥全草，歸肝、胃、大腸經，具有清熱解毒、涼血止血、活血化瘀、利濕退黃的功效[5]。地錦草始載于《嘉裕本草》，為我國貴州苗族常用藥[5]，又被稱為“地瓣草”（興義）、“斑鳩窩”（貴陽）”、“倒欠草”（銅仁）。在國醫大師周仲瑛的用藥案例中，地錦草常被用于治療HF和肝硬化[6]。地錦草的主要有效成分包括黃酮類、萜類、香豆素類等，具有抗腫瘤、降血脂、抗氧化、護肝等多種藥理作用[7]。有研究發現，地錦草及其提取物可明顯改善肝損傷小鼠的肝功能，初步證實了其對小鼠急性肝損傷的保護作用[8]，但其是否可以緩解HF尚不明確。腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）/核因子κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）信號通路的激活能誘導多種促炎介質的轉錄，刺激HSC轉化與ECM的過度沉積，從而促進HF的發生發展[9]。本研究擬從TNF-α/NF-κB信號通路出發，初步探討地錦草對HF大鼠的改善作用及機制，旨在為挖掘HF的潛在治療藥物奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括DYCZ-24DN型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）、SH-523型化學發光成像系統（杭州申花科技有限公司）、L00686CeBlot?L1型快速濕轉儀（金斯瑞生物科技股份有限公司）、H1-16KR型臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）、MultiskanFC型酶標儀（美國ThermoFisherScientific公司）、ND-100型超微量紫外-可見光分光光度計（杭州米歐儀器有限公司）、Chemray240型全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）、QuantStudio6型實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）、Fi3型生物顯微鏡（尼康株式會社）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑包括地錦草（地錦）配方顆粒（神威藥業集團有限公司，批號230325Q，規格為1g配方顆粒相當于中藥飲片3.5g），水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號35070805，規格35mg），小鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗、兔源NF-κBp65多抗、兔源核因子κB抑制蛋白α（inhibitor-κbindingproteinα，IκBα）多抗、兔源轉化生長因子β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）多抗（武漢三鷹生物技術有限公司，批號分別為10028230、00162675、10268-1-AP、21898-1-AP），α-兔源平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）單抗（英國Abcam公司，批號1000229-37），兔源TNF-α多抗（上海碧云天生物技術股份有限公司，批號AF8208），兔源磷酸化NF-κBp65（p-NF-κBp65）多抗（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號4c61978），反轉錄試劑盒、總RNA提取試劑、高靈敏性染料法定量PCR檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號分別為7E731J3、7E1141H4、7E0962H4），丙氨酸轉氨酶（alaninetransaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartatetransaminase，AST）測定試劑盒（深圳雷杜生命科學股份有限公司，批號分別為20221130、20221103），羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號20230218），TNF-α、白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）、IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，批號均為202407），兔源α-SMA多抗（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號AC240103198），Poly-HRP標記的羊抗鼠/兔二抗（廈門通靈生物醫藥科技股份有限公司，批號20709024D）。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF級健康SD大鼠，共38只，雄性，6～8周齡，體重（200±20）g，由貴州中醫藥大學動物研究所提供，動物生產許可證號為SCXK（黔）2021-0003。所有動物飼養于貴州中醫藥大學動物研究所，實驗期間大鼠自由進食與飲水。本研究嚴格遵循“3R”原則，動物處理嚴格按照《實驗動物管理條例》進行。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法將38只大鼠分為對照組（n＝7），模型組（n＝7），地錦草低、中、高劑量組（n＝6）和水飛薊賓組（陽性對照，n＝6）。除對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射3mL/kg的四氯化碳（CCl4）和橄欖油（2∶3，V/V）溶液以制備HF模型，每周注射2次（每周一、四上午分別注射1次），連續8周[10]；對照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水和橄欖油（2∶3，V/V）溶液。造模結束后，隨機處死對照組和模型組大鼠各1只，通過蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色觀察大鼠的肝組織病理變化。根據Metavir分期評分系統——HF分期評分標準，以HF分期≥2期表示HF模型制備成功[11]。

根據2020年版《中國藥典》（一版）中地錦草推薦劑量與國醫大師周仲瑛教授在治療HF及肝硬化中地錦草的使用劑量[6]，確定該藥的成人劑量為0.214g/kg，再通過體表面積法換算得到大鼠的臨床等效劑量為1.35g/kg，故地錦草低、中、高劑量組大鼠分別給予0.5、1、2倍臨床等效劑量地錦草，即0.675、1.35、2.70g/kg。水飛薊賓的成人劑量為3mg/kg，根據體表面積法換算后得到大鼠的臨床等效劑量為18.9mg/kg。造模成功后，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃體積均為10mL/kg，每天1次，連續30d。

2.2 動物取材與處理

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12h，稱重，然后腹腔注射鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮（50mg/kg）麻醉大鼠，再于腹主動脈取血，室溫靜置2h后，離心得血清，置于－80℃暫存。取血結束后，用頸椎脫臼法處死大鼠，取完整肝臟，稱重；另取大鼠新鮮的肝右葉組織，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，另一部分置于－80℃冰箱中保存，備用。

2.3 大鼠肝指數計算

根據大鼠取材前體重和取材后肝臟濕重計算肝指數：肝指數（%）＝取材后肝臟濕重（g）/大鼠取材前體重（g）×100%。

2.4 大鼠血清中炎癥因子指標水平測定

取“2.2”項下各組大鼠血清適量，常規解凍后，按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測大鼠血清中TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6水平。

2.5 大鼠血清中肝功能指標及HYP水平測定

取“2.2”項下各組大鼠血清適量，常規解凍后，按照試劑盒說明書操作，使用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中ALT、AST、HYP水平。

2.6 大鼠肝組織病理觀察

取“2.2”項下于4%多聚甲醛溶液中固定24h的大鼠肝組織，制備石蠟切片（厚度3μm），行HE和Masson染色后，封片，采用熒光顯微鏡于白光下觀察大鼠的肝組織病理變化。應用ImageProPlus6.0軟件對Masson染色照片進行陽性染色（呈藍色）面積測算，并計算陽性染色百分比[陽性染色百分比（%）＝陽性染色面積/總面積×100%]，以此為指標評價HF程度。

2.7 大鼠肝組織中TGF-β1、α-SMA表達測定

采用免疫組化法測定。取“2.2”項下凍存的大鼠肝組織（每組選4只大鼠的肝組織），經組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與烤片、脫蠟、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉等常規操作后，加入TGF-β1、α-SMA一抗（稀釋比例分別為1∶100、1∶200），于4℃濕盒孵育15h。沖洗后，加相應二抗，于37℃孵育30min，再次沖洗后，加入DBA顯色液，常規進行復染、脫水、封片，最后采用生物顯微鏡拍照。采用ImageProPlus6.0軟件對免疫組化照片進行陽性光密度分析（陽性染色呈棕黃色），以陽性光密度值大小來反映蛋白的表達水平。

2.8 大鼠肝組織中TNF-α、NF-κBp65mRNA表達檢測

采用qRT-PCR法檢測。取“2.2”項下凍存的大鼠肝組織（每只大鼠約100mg），采用Trizol法提取肝組織中總RNA，測定總RNA濃度后，將其逆轉錄成cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應程序如下：95℃預變性10min；95℃變性15s，60℃退火60s，95℃延伸15s，循環40次。擴增體系如下（20μL）：cDNA模板4μL，SYBRGreenMasterMix10μL，上、下游引物各0.4μL，50×ROXReferenceDye20.4μL，H2O4.8μL。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔCt法計算肝組織中TNF-α、NF-κBp65mRNA的相對表達量。引物由北京擎科生物科技股份有限公司設計并合成，引物序列及產物長度見表1。

2.9 大鼠肝組織中α-SMA及TNF-α/NF-κB信號通路相關蛋白表達測定

采用Westernblot法測定。取“2.2”項下凍存的大鼠肝組織（每組選3只大鼠的肝組織），提取組織中總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。將蛋白變性后，取蛋白40μg上樣進行電泳（恒壓180V，電泳時間40min），轉膜13min至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。電轉移后，用含5%脫脂奶粉的TBST（磷酸化蛋白用1%BSA）浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h；加入α-SMA、TNF-α、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IκBα、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶30000、1∶1000、1∶5000、1∶1000、1∶10000、1∶10000），于4℃孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶10000），室溫孵育2h。洗膜后進行曝光顯色，利用ImageProPlus6.0軟件分析條帶灰度值。以目標蛋白與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平，以p-NF-κBp65與NF-κBp65灰度值比值表示NF-κBp65蛋白的磷酸化水平。

2.10 統計學方法

使用SPSS29.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的定量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊性時組間兩兩比較采用Tamhane’sT2檢驗；不符合正態分布的定量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 地錦草對HF大鼠肝指數的影響

對照組、模型組、水飛薊賓組和地錦草低、中、高劑量組大鼠的肝指數分別為（3.18±0.20）%、（4.07±0.17）%、（3.47±0.14）%、（3.59±0.21）%、（3.36±0.06）%、（3.30±0.14）%。與對照組比較，模型組大鼠的肝指數顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠的肝指數均顯著降低（P＜0.01）。

3.2 地錦草對HF大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中上述指標水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見表2。

3.3 地錦草對HF大鼠血清中肝功能指標及HYP水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HYP水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中上述指標水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

3.4 地錦草對HF大鼠肝組織病理的影響

3.4.1 HE染色情況

對照組大鼠肝組織結構完整，肝細胞排列不規則，未見明顯結締組織增生，間質內可見零散炎癥細胞浸潤。與對照組比較，模型組大鼠肝細胞排列更不規則，肝細胞水腫伴明顯胞漿疏松化，肝細胞實質內有少量空泡樣變性，匯管區可見大量結締組織增生，間質內可見少量炎癥細胞浸潤。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織在炎癥細胞浸潤、肝細胞水腫等方面均有不同程度改善。結果見圖1。

3.4.2 Masson染色情況

對照組大鼠肝組織未見結締組織增生，可見少量藍色膠原纖維。模型組大鼠肝組織藍色膠原纖維明顯增多，纖維間隔變粗。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織藍色膠原纖維明顯變細，纖維間隔變窄。與對照組[（0.06±0.01）%]比較，模型組大鼠陽性染色百分比[（2.44±0.68）%]顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊賓組和地錦草高劑量組大鼠陽性染色百分比[分別為（0.65±0.17）%、（0.34±0.14）%]均顯著降低（P＜0.05），但地錦草低、中劑量組大鼠陽性染色百分比[分別為（2.37±1.97）%、（1.69±0.25）%]差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖2。

3.5 地錦草對HF大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1表達的影響

對照組大鼠肝組織中α-SMA檢測可見少量著色，主要分布在小動、靜脈血管壁，其余未見明顯廣泛表達；TGF-β1檢測可見少量表達，主要分布在肝細胞中。模型組大鼠肝組織中α-SMA檢測可見大片區高表達，主要分布在膠原纖維增生處及匯管區；TGF-β1檢測可見大片區高表達，顏色為深棕褐色，并出現顆粒狀改變。各給藥組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1表達有不同程度減輕。與對照組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1陽性光密度值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊賓組和地錦草中、高劑量組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1陽性光密度值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖3、圖4和表4。

3.6 地錦草對HF大鼠肝組織中TNF-α、NF-κBp65mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠肝組織中TNF-α、NF-κBp65mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，地錦草高劑量組大鼠肝組織中TNF-αmRNA相對表達量以及各給藥組大鼠肝組織中NF-κBp65mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.01）。結果見表5。

3.7 地錦草對HF大鼠肝組織中α-SMA及TNF-α/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TNF-α蛋白表達水平及NF-κBp65蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.01），IκBα蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標均顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖5、表6。

4 討論

中醫學認為，肝臟從正常到HF乃至肝硬化是漸進發展的，不同階段對應的中醫病證不盡相同。中醫古籍雖無HF記載，但考究文獻，HF符合“肝積”“脅痛”“積聚”等病證的特征[12]。《靈樞·百病始生篇》記載“腸外有寒，汁沫與血相搏，則并合凝聚不得散，而積成矣”，因寒氣、水飲、痰飲、瘀血共同凝聚，積最基本的病理因素為“濕”和“瘀”。肝藏血，主疏泄，若因濕熱或外邪阻滯氣機，濕困氣阻熱擾而釀毒，則肝絡瘀阻，積聚已成，血行不暢[13]。若濕、熱、瘀、毒相互作用，互相影響，滯留蘊結在肝，肝脈瘀滯則肝運轉失司，則可形成肝積。“濕-熱-毒-郁-瘀-虛”是慢性肝病到HF的病機演化過程，有研究認為，“濕、熱、瘀、毒”四者相互聯系，相互轉化與兼雜，并且提出“濕熱瘀毒是HF形成和加重的始動因素和關鍵環節”假說[13]，而地錦草的功效十分契合“濕熱瘀毒”理論的治療方向。

腹腔注射CCl4是構建HF大鼠模型的經典方法。CCl4可以激活庫普弗細胞，導致TNF-α、IL-1、IL-6等多種細胞因子和生長因子高表達，進而誘導肝損傷和HF[14]。本研究結果顯示，經地錦草干預后，HF大鼠血清中TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6水平顯著降低，表明地錦草具有抑制炎癥水平的作用。本研究病理結果顯示，經地錦草干預后，HF大鼠肝組織的炎癥細胞浸潤、肝細胞水腫情況均明顯好轉，且藍色膠原纖維明顯變少、變細，纖維間隔縮小，因此筆者推測地錦草具有恢復受損肝細胞、緩解HF進程的作用。HYP是膠原組織的主要成分之一，是反映膠原組織代謝和纖維化程度的重要指標[15]。本研究結果顯示，經地錦草干預后，HF大鼠血清中HPY水平降低，表明地錦草有減少膠原沉積的作用；此外，HF大鼠血清中ATL、AST水平降低，說明地錦草可恢復肝功能，緩解肝損傷。NF-κB是一種異二聚體，該家族有p50、p52、p65（RelA）、RelB和c-rel5種蛋白。NF-κB激活經典途徑是由TNF-α、IL-1等誘導的，該途徑依賴于NF-κB抑制因子激酶介導的IκBα磷酸化，導致其降解，從而使p50/p65NF-κB二聚體進入細胞核并激活基因轉錄[16]。炎癥常被認為是纖維化的重要環節，而NF-κB是炎癥反應的關鍵轉錄調節因子，可參與控制炎癥過程中許多基因的表達[16]。NF-κB通路可誘導多種促炎介質的轉錄、HSC的激活和增殖，阻斷細胞因子誘導的HSC凋亡效應[9]，激活多條信號通路來調控細胞生長，誘導組織纖維化[17]。通過抑制NF-κB信號通路的激活可以達到減輕HF和炎癥的目的[18―19]。本研究結果顯示，經地錦草干預后，模型大鼠肝組織中TNF-α、α-SMA、TGF-β1蛋白表達以及TNF-α、NF-κBp65mRNA表達和NF-κBp65蛋白磷酸化水平均不同程度下調/下降，而IκBα蛋白表達水平顯著上調。這表明地錦草可通過降低炎癥水平，抑制NF-κBp65磷酸化，來抑制NF-κB信號通路的激活。

綜上所述，地錦草可能通過抑制TNF-α/NF-κB信號通路激活來緩解大鼠HF，但其具體作用機制有待進一步研究。