落新婦苷對慢性腎功能衰竭大鼠腎損傷的影響及機制

關鍵詞落新婦苷；慢性腎功能衰竭；腎損傷；腎纖維化；Jagged-1/Notch-1信號通路

慢性腎功能衰竭（chronicrenalfailure，CRF）是由多種原因造成的慢性進行性腎實質損害，可造成患者腎臟萎縮和腎小球濾過率降低，以代謝物潴留、腎纖維化和水、電解質、酸堿失衡為主要臨床表現，同時還伴有高血壓、胃腸道疾病等多種并發癥[1]。CRF早期癥狀不明顯，容易被臨床忽視，加之患者對該病的認識程度較低，導致很多患者確診時已進入中晚期。目前，對于早中期CRF患者，臨床多進行對癥治療；對于終末期CRF患者，臨床則主要采用透析和腎移植，但治療費用較高，患者預后不佳[2]。因此，開發安全、有效的新藥對CRF的臨床治療具有重要意義。

中藥因毒副作用低而在CRF治療領域具有較大優勢。落新婦苷（astilbin，AST）是首次從落新婦根莖中提取到的天然化合物，同時也存在于土茯苓、菝葜等多種藥用植物中。該成分具有抗炎、抗氧化等諸多藥理作用，可減少高糖誘導的腎小管上皮細胞自噬和凋亡，可通過抑制內質網應激來減少腎組織細胞凋亡，從而改善腎損傷[3―4]，但具體作用機制尚不明確。Jagged-1/Notch-1信號通路可參與調控細胞生長、分化、凋亡等多種生物學過程[5]。研究顯示，抑制Jagged-1/Notch-1信號通路可抑制腎小管上皮細胞上皮間質轉化，減少其膠原沉積，從而減輕腎損傷和腎纖維化[5―6]。由此本課題組推測，Jagged-1/Notch-1信號通路可能是藥物治療CRF的潛在靶點。研究顯示，土茯苓、烏梅配伍可通過抑制Notch信號通路來改善銀屑病小鼠的皮損癥狀，且效果優于土茯苓單用，這可能與烏梅能增加土茯苓有效成分AST的溶出有關[7]。基于上述研究，本研究從Jagged-1/Notch-1信號通路出發，擬初步探討AST對CRF大鼠腎損傷的改善作用及潛在機制，以期為CRF相關藥物研發及臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

ReadMax1900型光吸收全波長酶標儀購自上海閃譜生物科技有限公司；VMM4200R型顯微鏡購自邁格儀器（蘇州）有限公司；LD-3060V型組織切片機購自山東安嶼生物科技有限公司；120VP型全自動生化分析儀購自成都斯馬特科技股份有限公司；WD-9413D型凝膠成像系統購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

AST對照品（批號29838-67-3，純度≥98%）購自西安匯林生物科技有限公司；Notch-1通路激活劑Jagged-1/FC嵌合蛋白（簡稱“JFC”；批號HY-P1846A，純度99.89%）購自美國MCE公司；乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為P54382、M74281、P54603、P54314）均購自上海傳秋生物科技有限公司；腺苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）、鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶試劑盒（批號分別為ABP55523、KTB1800-1、KTB1810-1）均購自亞科因（武漢）生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色試劑盒（批號分別為S3507、S4162）均購自上海富衡生物科技有限公司；兔源轉化生長因子β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）抗體（批號為3711）購自美國CST公司；兔源低氧誘導因子1α（hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）抗體、兔源α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）抗體、兔源切割型胱天蛋白酶3（cleavedcaspase-3）抗體、兔源Jagged-1抗體、鼠源Notch-1抗體、兔源β-肌動蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化酶標記的山羊抗兔、抗鼠免疫球蛋白G二抗（批號分別為ab179483、ab124964、ab32042、ab109536、ab280898、ab8227、ab6721、ab205719）均購自英國Abcam公司；血尿素氮（bloodureanitrogen，BUN）、血清肌酐（serumcreatinine，SCr）、尿蛋白（urinaryprotein，UP）生化試劑盒（批號分別為C013-2-1、C011-2-1、C035-2-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠60只，體重190～210g，購自山東艾茂達康生命科學有限公司，動物生產許可證號為SCXK（魯）20230010。所有動物均飼養于溫度（22±2）℃、相對濕度（60±5）%、光照12h/黑暗12h循環的環境中，自由攝食、飲水。本實驗在煙臺藍納成生物技術有限公司進行，實驗方案經該公司實驗動物倫理委員會審批，審批號為2024-03-232。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取50只大鼠，采用5/6腎切除術建立CRF模型：將大鼠麻醉后以俯臥位固定，背部剃毛后消毒，于肋脊角左下約1cm處切一小口，暴露左腎，結扎腎蒂，分別切除左腎上、下1/3，止血后復位，縫合并消毒；7d后，同法完全摘除右腎。若大鼠BUN、SCr水平較對照組（CK組）大鼠高1倍以上，則表明CRF模型構建成功[8]。另取10只大鼠，打開腹腔，暴露腎臟，剔除腎筋膜但不進行切除操作，作為CK組。本研究共有42只大鼠造模成功，隨機選取其中40只，分為模型組（Model組）、AST低劑量組（AST-L組）、AST高劑量組（AST-H組）、AST高劑量+Notch-1通路激活劑組（AST-H+JFC組），每組10只。AST-L組和AST-H組大鼠分別灌胃40、80mg/kg的AST（以二甲基亞砜為溶劑）[9]，AST-H+JFC組大鼠同時灌胃80mg/kg的AST（以二甲基亞砜為溶劑）[9]和0.5mg/kg的JFC（以水為溶劑）[10]，CK組和Model組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續4周。

2.2 大鼠血清BUN、SCr及尿液UP水平檢測

末次給藥后，各組大鼠禁食、不禁水12h，收集其24h尿液，并于腹主動脈取血3mL（血樣離心10min，收集上層血清），使用全自動生化分析儀檢測其血清BUN、SCr水平和24h尿液UP水平。

2.3 大鼠血清LDH、TNF-α、IL-6、IL-10水平檢測

取“2.2”項下各組大鼠血清適量，按相應ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測其血清LDH、TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.4 大鼠腎組織形態觀察

取血后，以頸椎脫臼法將各組大鼠處死，剖取腎臟。隨機選擇每組5只大鼠的左腎組織，以4%多聚甲醛溶液固定后脫水，以石蠟包埋并切片，根據HE染色試劑盒說明書方法操作，依次進行蘇木精、伊紅染色后，使用顯微鏡觀察其腎組織形態。

2.5 大鼠腎組織纖維化觀察

取“2.4”項下各組大鼠腎組織切片，脫蠟、清洗后，以蘇木精染色10min；清洗，以磷鉬酸浸染3min后，用苯胺藍染液染色5min；以1%冰醋酸浸泡后，用無水乙醇脫水，用二甲苯透明，封片，使用顯微鏡觀察其腎組織纖維化情況。

2.6 大鼠腎組織線粒體中ATP含量和鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶活性檢測

取各組剩余5只大鼠的腎組織適量，加入裂解液研磨勻漿，于4℃下離心5min×2次；取上清液，再于4℃下離心10min，取沉淀（即線粒體），以緩沖液0.3mL重懸，并于4℃下離心5min；取上清液，按相應試劑盒說明書方法操作，采用微量法以酶標儀檢測其腎組織線粒體中ATP含量和鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶活性。

2.7 大鼠腎組織中相關蛋白表達檢測

取“2.6”項下各組大鼠的腎組織適量，提取總蛋白并定量檢測，隨后于熱水浴中變性。取變性蛋白適量，經電泳分離、轉膜后封閉2h；洗膜后，加入TGF-β、HIF-1α、α-SMA、cleaved-caspase-3、Jagged-1、Notch-1、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1500），于4℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶5000），于室溫下孵育2h；洗膜后，以ECL顯色，置于凝膠成像系統下成像。以β-actin為內參，使用Image-ProPlus軟件對各目的蛋白的條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目的蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用GraphPadPrism8.0.1軟件對數據進行統計分析。實驗數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 AST對大鼠血清BUN、SCr和尿液UP水平的影響

與CK組比較，Model組大鼠血清BUN、SCr水平和尿液UP水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組比較，AST-L、AST-H組大鼠血清BUN、SCr水平和尿液UP水平均顯著降低，且AST-H組顯著低于AST-L組（P＜0.05）；與AST-H比較，AST-H+JFC組大鼠血清BUN、SCr水平和尿液UP水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

3.2 AST對大鼠血清LDH、TNF-α、IL-6、IL-10水平的影響

與CK組比較，Model組大鼠血清LDH、TNF-α、IL-6水平均顯著升高，IL-10水平顯著降低（P＜0.05）；與Model組比較，AST-L、AST-H組大鼠血清LDH、TNF-α、IL-6水平均顯著降低，IL-10水平均顯著升高，且AST-H組上述指標的變化較AST-L組明顯（P＜0.05）；與ASTH組比較，AST-H+JFC組大鼠血清LDH、TNF-α、IL-6水平均顯著升高，IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

3.3 AST對大鼠腎組織形態的影響

CK組大鼠腎小管和腎小球形態較為完整，沒有明顯病變；Model組大鼠腎小球基底膜明顯增生、系膜擴張，小管空泡化且上皮細胞腫脹壞死明顯，間質有明顯炎癥，被膜和周圍皮質區有纖維組織增生；AST-L、ASTH組大鼠腎組織上述損傷有所減輕，且AST-H組優于AST-L組；與AST-H組相比，AST-H+JFC組大鼠腎組織上述損傷明顯加重。結果見圖1。

3.4 AST對大鼠腎組織纖維化的影響

CK組大鼠腎組織無明顯纖維化；Model組大鼠腎組織纖維化較為明顯；AST-L、AST-H組大鼠腎組織纖維化明顯減輕，且AST-H組優于AST-L組；與AST-H組相比，AST-H+JFC組大鼠腎組織纖維化明顯加重。結果見圖2。

3.5 AST對大鼠腎組織線粒體能量代謝的影響

與CK組比較，Model組大鼠腎組織線粒體中ATP含量和鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶活性均顯著降低（P＜0.05）；與Model組比較，AST-L、AST-H組大鼠腎組織線粒體中ATP含量和鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶活性均顯著升高，且AST-H組顯著高于AST-L組（P＜0.05）；與ASTH組比較，AST-H+JFC組大鼠腎組織線粒體中ATP含量和鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶活性均顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

3.6 AST對大鼠腎組織中相關蛋白表達的影響

與CK組比較，Model組大鼠腎組織中TGF-β、HIF-1α、α-SMA、cleaved-caspase-3、Jagged-1、Notch-1蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與Model組比較，ASTL、AST-H組大鼠腎組織中上述蛋白的表達水平均顯著降低，且AST-H組顯著低于AST-L組（P＜0.05）；與ASTH組比較，AST-H+JFC組大鼠腎組織中上述蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3、表4。

4 討論

CRF是由各種慢性腎臟疾病引起的進行性疾病，可導致腎組織結構和功能異常，直至最終衰竭，進而發展為終末期腎病。據統計，全球每年新增慢性腎臟疾病患者約2000萬例，是全球發病率和死亡率均較高的疾病之一，對人類健康構成嚴重威脅[11]。腎間質纖維化是CRF的組織學特征，是患者腎功能喪失的重要因素，因此如何改善腎間質纖維化、延緩CRF疾病進程、改善患者生活質量是防治慢性腎臟疾病和終末期腎病的關鍵[12]。目前，臨床尚無針對CRF的特效藥物，常規治療措施只能減緩患者病情惡化，因此開發新的治療藥物具有現實意義。

AST是一種天然黃酮類化合物，可減輕慢性腎損傷大鼠的腎組織纖維化，改善腎臟形態，對腎臟具有一定保護作用[4]。Zhang等[13]研究顯示，AST可抑制鎘誘導的鯉魚腎淋巴細胞的氧化應激和凋亡，減輕腎損傷。CRF是一種腎功能障礙疾病，可導致腎萎縮和腎小球濾過率降低，造成蛋白滲出，當滲出量超出腎小管重吸收極限后，將會形成蛋白尿；另外，腎臟受損后，血液中BUN、SCr排出受阻，使得體內BUN、SCr水平明顯增高[3]。本研究結果顯示，Model組大鼠血清BUN、SCr和尿液UP水平均較CK組顯著升高，提示其腎功能明顯下降，模型構建成功；經AST干預后，大鼠血清BUN、SCr和尿液UP水平均較Model組顯著降低，提示其腎功能有所改善。

研究顯示，持續的微炎癥是引發CRF的重要原因，大量炎癥介質（TNF-α、IL-6等）分泌、滲出可激活氧自由基，產生大量的細胞外基質，從而促進腎組織纖維化，加速CRF進展[14]。本研究結果顯示，Model組大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6水平均較CK組顯著升高，抗炎因子IL-10水平較CK組顯著降低；經AST干預后，大鼠上述促炎因子水平均較Model組顯著降低，抗炎因子水平均較Model組顯著升高，提示大鼠腎組織炎癥性損傷有所改善。

腎間質纖維化是CRF的組織學特征，在此過程中，大量成纖維細胞及肌成纖維細胞增生，細胞外基質堆積，從而導致腎小球硬化，促進腎間質纖維化，加速CRF的發生發展[15]。TGF-β、α-SMA、HIF-1α是評估纖維化程度的標志蛋白[8]。本研究結果顯示，Model組大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α蛋白的表達水平均較CK組顯著升高，且Masson染色顯示其腎組織纖維化較CK組嚴重；經AST干預后，大鼠腎組織中TGF-β、α-SMA、HIF-1α蛋白的表達水平均較Model組顯著降低，且Masson染色顯示其腎組織纖維化較Model組有所減輕，提示AST可改善CRF大鼠的腎組織纖維化。

腎臟是代謝高度活躍的器官，其正常運行需要消耗大量能量，而線粒體是細胞的動力源泉，能通過氧化磷酸化系統合成ATP，從而產生能量[16]。研究指出，線粒體功能障礙可引起組織損傷和器官功能受損，與腎組織纖維化的發生發展密切相關[17]。鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶可維持細胞內環境穩態，可通過影響線粒體對細胞質鈣離子的攝取來減緩呼吸鏈速率，從而減少ATP的合成[17]。本研究結果顯示，AST可顯著提高CRF大鼠腎組織線粒體中ATP含量和鈉鉀ATP、鈣鎂ATP酶活性，提示AST可改善其腎組織線粒體功能。

CRF可引起腎組織細胞凋亡，造成腎功能障礙[18]。cleaved-caspase-3為凋亡蛋白，可誘導細胞凋亡[19]。LDH主要參與細胞代謝，當細胞損傷或死亡時，LDH從細胞中流出進入血液，是細胞損傷的標志物[20]。本研究結果顯示，AST可顯著降低大鼠血清LDH水平，并通過降低腎組織中cleavedcaspase-3蛋白的表達水平來減少細胞凋亡，提示AST可減輕CRF大鼠腎組織細胞損傷。

Notch信號通路參與調控細胞的生理代謝過程。Jagged-1是Notch-1的配體，兩者結合后可轉移至細胞核，發揮相應調控作用，與腎間質纖維化的發生發展有關[6]。金麗霞等[21]研究表明，抑制Jagged-1/Notch-1信號通路可延緩CRF大鼠腎間質纖維化，改善腎功能。Ma等[22]研究表明，Jagged-1/Notch-1信號通路過度激活可引起腎臟炎癥、纖維化和細胞凋亡，促進腎損傷和腎功能障礙。本研究結果顯示，Model組大鼠腎組織中Jagged-1、Notch-1蛋白的表達均較CK組顯著上調；經AST干預后，大鼠腎組織中Jagged-1和Notch-1蛋白的表達均較Model組顯著下調，提示Jagged-1/Notch-1信號通路受到抑制。為進一步確認AST的這一作用靶點，本研究在AST的基礎上聯用Notch-1信號通路激活劑JFC進行干預，結果顯示，JFC可顯著逆轉AST對CRF大鼠腎損傷的改善作用，提示AST的腎保護作用可能是通過抑制Jagged-1/Notch-1信號通路來實現的。

綜上所述，AST可減輕CRF大鼠炎癥、腎組織損傷和纖維化，改善腎組織線粒體能量代謝，上述作用可能與抑制Jagged-1/Notch-1信號通路有關。但CRF發病機制復雜，AST對CRF大鼠的具體作用機制還需進一步探索。