乙型肝炎病毒基因整合對功能性治愈的影響

摘要： 功能性治愈是目前國內外慢性乙型肝炎防治指南推薦的理想治療目標，被定義為完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到、HBeAg陰轉、伴或不伴HBsAg血清學轉換、肝臟炎癥緩解和組織病理學改善、終末期肝病發生率顯著降低。HBV可以整合到宿主基因組中持續表達HBsAg，且可發生在慢性HBV感染的早期階段，因此除了肝組織內難以清除的共價閉合環狀DNA外，獨立于病毒復制的HBV整合來源的HBsAg可能是慢性乙型肝炎患者在抗病毒治療后難以實現功能性治愈的重要因素。本文圍繞近年來HBV整合方面的研究進展，著重探討其對功能性治愈的影響。

關鍵詞： 乙型肝炎病毒； 基因； 功能性治愈； 抗病毒治療

基金項目： 國家自然科學基金青年項目（82402601）； 上海市自然科學基金面上項目（24ZR1448400）

Effect of hepatitis B virus integration on functional cure

YU Xiaoqi， ZHANG Xinxin

Research Laboratory of Clinical Virology， Department of Infectious Diseases， Ruijin Hospital， Shanghai Jiao Tong University Schoolof Medicine， Shanghai 200025， China

Corresponding author： ZHANG Xinxin， zhangx@shsmu.edu.cn （ORCID： 0000-0002-0598-6425）

Abstract： Functional cure is currently recommended by guidelines as the ideal treatment goal for the prevention and treatment ofchronic hepatitis B （CHB） in China and globally， and it is defined as sustained and undetectable serum HBsAg and HBV DNA，HBeAg clearance， and presence or absence of HBsAg seroconversion， accompanied by resolution of liver inflammation，histopathological improvements， and a significant reduction in the incidence rate of end-stage liver disease. HBV can integrate intothe host genome and contribute to the continuous production of HBsAg， which can occur in the early stage of chronic HBVinfection. In addition to the covalently closed circular DNA that is hard to be eliminated in liver tissue， HBsAg derived from HBVintegration independent of viral replication may be the most important factor for the difficulty in achieving functional cure afterantiviral therapy in patients with hepatitis B. This article reviews the research advances in HBV integration in recent years anddiscusses its impact on functional cure.

Key words： Hepatitis B Virus； Genes； Functional Cure； Antiviral Therapy

Research funding： National Natural Science Foundation of China Young Scientist Fund （82402601）； General Project of NaturalScience Foundation of Shanghai （24ZR1448400）

HBV感染是一個重要的公共衛生問題，可以導致肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌（HCC）等相關疾病。慢性乙型肝炎（CHB）的治療目標是延緩或較少終末期肝病的發生，從而提高患者的生活質量并延長生存時間。因HBsAg陰轉可顯著改善CHB患者發生肝癌、失代償肝硬化等不良結局的發生風險，以血清HBsAg消失為基本要素的乙型肝炎功能性治愈是目前國內外公認的抗病毒治療的理想終點。功能性治愈是指完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到、HBeAg陰轉、伴或不伴HBsAg血清學轉換、殘留cccDNA可持續存在，肝臟炎癥緩解和組織病理學改善、終末期肝病發生率顯著降低［1］ 。當前批準用于治療CHB的藥物包括α-干擾素和核苷（酸）類似物［nucleos （t）ide analogues，NAs］，盡管可以有效抑制病毒復制，但在長期抗病毒治療下，只有極少數CHB患者能實現功能性治愈［2］ ，這除了與肝內難以清除的以微染色體形式存在的共價閉合環狀 DNA（cccDNA）有關外，還與HBV整合有關。整合到宿主基因組中的HBV片段可以獨立于病毒的復制過程持續表達HBsAg，因此成為功能性治愈的重要障礙。本文將對近年來HBV整合方面的研究進展及其對功能性治愈的影響進行綜述。

1 HBV整合的機制及編碼產生的病毒蛋白

HBV復制有著獨特的逆轉錄過程，而整合則是病毒復制過程中的副產品，并非生命周期所必須。HBV逆轉錄過程中若引物模板轉位失敗，在原位啟動正鏈合成就會導致病毒負鏈和新合成的正鏈形成雙鏈線性 DNA（double-strand linear DNA， dslDNA）， dslDNA 為整合提供了帶有兩個游離末端的HBV DNA片段［3］ ，而肝臟炎癥引起的氧化損傷等造成的宿主基因組DNA雙鏈斷裂則為病毒整合提供了所需的斷點。dslDNA入核后可通過非同源末端連接或微同源介導的末端連接插入宿主細胞染色體中［4］ 。早期研究通過體外模型發現，1165A/DR1-13突變株質粒的正鏈引物易位有缺陷，導致線性與環狀DNA的比例從1∶1升高至10∶1，在細胞中轉染含有該突變的表達質粒可導致整合率的上升［5］。外源性HBV片段在人類基因組中的整合可能會影響下游宿主基因的表達及功能，此外，整合的不斷積累還會引發宿主DNA的錯配修復反應，誘導基因組重排，導致細胞惡性轉化過程中染色體穩定性的改變［6-7］ ，因此HBV整合可能還具有促進肝癌發生發展的作用。

HBV dslDNA往往通過基因組上的DR1區域與宿主基因組融合，但在整合過程中可能會發生截斷，所以整合可能從1 820 nt或更下游開始［8］ 。目前大部分研究認為HBV整合在宿主染色體中呈現隨機分布的趨勢［9］，但也有觀點認為基因組上轉錄活躍的區域因解旋失去了核小體的保護而更容易損傷斷裂，病毒整合可能更傾向于發生在基因富集的區域，包括CpG島、基因編碼區及啟動子區［10］ ，而并非真正意義上的“隨機”。此外，由于HBV整合優先發生在細胞基因組雙鏈斷裂處，而 DNA的損傷修復通常發生在細胞G0/G1期，因此，細胞所處的周期可能也一定程度上影響HBV整合的頻率。

HBV 基因組上的多個順式作用元件，包括啟動子SP1、SP2 和 XP 及增強子 ENⅠ和 ENⅡ在整合的前體dslDNA上均被完整保留，因而整合的HBV序列可以支持大/中/?。↙/M/S）包膜蛋白及 C 端截短的 HBx蛋白的表達，還可延伸至宿主的多聚腺苷酸信號（PAS）處終止轉錄進而產生具有反式激活作用的病毒-宿主嵌合蛋白［11］ 。HBV整合產生的病毒蛋白可能與cccDNA來源的蛋白在功能上有所不同。HBV整合產生的截短HBx則缺乏具有促細胞凋亡特性的C端結構域，其過度表達可以抑制細胞凋亡［12］ 。整合產生的截短的HBsAg不能正確分泌，積累在內質網膜中引起內質網應激和細胞氧化應激，增加DNA損傷和雙鏈斷裂，一定程度上也增加dslDNA在宿主基因組中整合的可能［4］ 。魯鳳民教授團隊最近的研究發現，整合HBV DNA表達的HBsAg分泌效率顯著低于cccDNA，通過構建p-dslDNA體外模型，發現由整合DNA整合轉錄的2. 4 kb RNA占比以及隨之而來的 L-HBsAg蛋白占比均高于 cccDNA，這可能是導致HBsAg分泌效率下降和肝細胞內潴留的主要原因［13］。

從理論上而言，dslDNA上CP/BCP與編碼區分離，由于缺少核心啟動子序列，整合HBV DNA與cccDNA不同，存在復制缺陷，不能產生具有感染性的病毒顆粒，不能轉錄出前基因組 RNA（pre-genomic RNA， pgRNA），也不能表達病毒聚合酶、HBeAg和HBcAg［14］ 。但近期有研究通過第三代測序技術發現了一條長度大于3. 2 kb的整合HBV序列［15］ ，這顛覆了以往認為整合來源的HBV DNA不能產生pgRNA的認知。同時，研究者還在整合序列中發現了多種spliced RNA，預示著同一HBV整合事件具有產生多種不同形式轉錄本的潛能。這些不同的觀點和研究結果也強調了今后在更多臨床隊列中解析HBV整合分子特征的必要性。

肝癌細胞系PLC/PRF/5的基因組中存在HBV DNA整合片段，能穩定產生HBsAg［16］ ，是研究整合HBV DNA的有效體外細胞模型，魯鳳民教授團隊利用多組學技術全面解析了PLC/PRF/5細胞系HBV整合的特征、轉錄水平及轉錄調控機制，為靶向清除和靜默整合來源HBsAg提供了重要思路［17］。

2 HBV整合是阻礙CHB功能性治愈的重要因素

慢性HBV感染自然史復雜，疾病進展不同階段病毒的復制和轉錄水平及宿主的免疫應答狀態都存在顯著差異，HBV的整合頻率也可能有所不同。HBeAg血清學轉換和向HBeAg陰性慢性感染轉變是CHB自然史中的一個關鍵事件，標志著免疫介導的肝損傷的結束，并與HBV DNA水平顯著下降相關。研究表明，相較于HBeAg陽性CHB患者，HBeAg陰性患者肝組織內cccDNA水平顯著更低，同時血清HBsAg水平和肝內cccDNA水平開始缺乏顯著相關性［18］ 。ARC-520 是一款 RNA 干擾藥物，特異性靶向cccDNA來源的轉錄本，臨床研究結果顯示其無法有效抑制HBeAg陰性患者HBsAg的產生和分泌［19］ ，也意味著攜帶HBV整合事件的肝細胞克隆性擴增形成的細胞集落可能是HBeAg陰性患者HBsAg表達的主要來源［19-20］ ，這使得獨立于HBV復制過程的整合成為阻礙慢性HBV感染功能性治愈的主要障礙。

HBV整合不僅可以發生在高HBV DNA水平的患者中，在低病毒載量的HBeAg陰性患者中也有較高的發生率［21］ 。最近一項研究通過 RNA-seq 在 HBeAg 陰性、低病毒載量的 CHB 患者肝組織中檢測到了轉錄活躍的HBV整合事件，并發現低載量的cccDNA作為模板不足以支持肝內廣泛的HBV RNA及HBsAg的表達，由此推測肝組織中普遍存在的HBV整合可能是HBsAg表達的主要來源［22］。隨著長期抗病毒治療阻斷cccDNA池的補充，HBV整合轉錄本的讀數與HBsAg陽性肝細胞比率及血清HBsAg水平出現正相關，也提示整合來源的HBsAg開始占據主要地位［23］ 。筆者前期研究在已獲得功能性治愈的患者肝組織中也觀察到了轉錄活躍的HBV整合，表明HBV整合現象可能比預先認為的更為普遍［24］ ，那些通過長期抗病毒治療病毒復制得到抑制但始終無法實現HBsAg陰轉的患者肝組織內可能存在廣泛的HBV整合事件。

3 HBV整合檢測技術的發展及相關無創標志物

HBV DNA整合現象在1980年首次被報道，在之后40余年的研究進程中，檢測方法不斷發展。Southern Blot是當年第一個用于揭示患者腫瘤組織和HCC細胞系中存在HBV整合的技術［25-27］ ，但該方法無法提供整合位點的相關信息。Alu-PCR 被廣泛用于檢測 HBV 相關HCC［28］ 及慢性HBV感染患者 ［29］ 的病毒DNA整合，但只有當整合位點位于人類基因組Alu元件附近時才可被該方法檢出。通過反向PCR（Inverse PCR）鑒定HBV整合事件的靈敏度較高，但上下游缺乏限制性內切酶消化位點的整合序列也無法通過該方法檢出［30］ 。隨著二代測序技術的快速發展，現階段研究多通過轉錄組測序（RNA-seq）［22］ 、全基因組測序 ［31］ 、全外顯子測序 ［21］ 等方法結合生物信息學分析鑒定宿主基因組中的HBV整合事件，這些技術能靈敏地捕捉到整合序列的斷點信息，但相對較短的讀長難以揭示整合序列的全貌。第三代測序具有對單分子進行長片段測序的技術優勢，能在全基因組范圍內檢測HBV整合序列的特征及染色體易位、基因融合等結構變異［15， 32］ ，是目前研究宿主基因組中HBV整合全貌的有利工具。在應用上述檢測方法鑒定HBV整合序列時，核酸在提取過程中不可避免地丟失了原本在肝組織中的位置信息，如需探明慢性HBV感染者肝組織中有多少受感染的細胞攜帶病毒整合事件及其分布特征，則需要尋找一種非傳統的研究手段。近年來迅速發展的空間轉錄組測序技術可以還原序列在組織中的定位，彌補了傳統高通量測序的缺陷［33］ ，筆者團隊在之前的研究中首次應用該技術揭示了轉錄活躍的HBV整合事件在慢性HBV感染不同階段肝組織中廣泛分布［24］ ，與免疫組化、原位雜交等技術聯用或許可以幫助還原更多HBV整合在肝組織原位的相關信息。

如上所述，轉錄活躍的HBV整合可以導致CHB患者，尤其是 HBeAg陰性 CHB患者的 HBsAg表達獨立于cccDNA和HBV復制，因此絕大多數患者在抗病毒治療后 HBsAg的清除率較低，而 HBsAg清除恰好是臨床功能性治愈的標準之一。在臨床實踐中，如何尋找合適的生物標志物來替代HBsAg，以更好地監測抗病毒治療后肝內病毒復制能力和轉錄活性仍是一項重大的挑戰。

近期，HBV RNA被發現可作為一種新的病毒學無創標志物來反映肝內cccDNA的轉錄活性，也可以用于預測療效。根據 HBV RNA 序列 3'末端加尾信號的堿基差異，可以辨別整合來源或cccDNA復制來源的HBV轉錄本［15，19］ ，HBV整合來源的轉錄本往往在HBV基因組上的隱性PAS處終止轉錄進而產生缺乏傳統的多聚腺苷酸信號的截短HBV RNA，而病毒復制則會產生具有保守3'末端的多聚腺苷酸化的HBV RNA。因此，通過設計特定的引物序列量化外周血中由cccDNA轉錄而來的HBV RNA［34］ ，可以很好地反映肝內 cccDNA 的轉錄活性［35］。

既往研究在HBV相關HCC患者外周血中抽提細胞游離DNA（cfDNA），通過富集后測序檢測到整合來源的HBV-宿主嵌合序列［36-37］ ，提示循環HBV-宿主嵌合DNA作為HBV相關HCC腫瘤標志物的可行性。對慢性HBV感染者外周血中的RNA進行測序也可觀察到HBV-宿主嵌合序列，但檢出陽性率較低［38］ ，僅占外周血HBV RNA的極少數［39］ ，因此，是否能將CHB患者循環血中檢出的HBV整合序列作為反映肝組織內病毒整合情況的標志物還需要更多研究來證實。

4 現有抗病毒治療對HBV整合的影響

慢性HBV感染的早期階段即可檢測到HBV整合事件的發生［40］ ，在體外細胞感染模型中也證實HBV整合發生在病毒感染后的幾天內 ［41］ ，且不依賴HBV的從頭復制［42］ ，由此引發了臨床實踐中對治療干預時機的思考。若要避免HBV整合帶來的諸如促進HBV相關肝癌發生等威脅，應當盡早進行抗病毒治療。研究發現，在治療基線肝組織內沒有檢測到HBV S基因整合的患者在接受抗病毒治療2～4年后HBsAg水平持續下降，而檢測到HBV S基因整合的患者治療2～4年后HBsAg水平基本不下降［43］ 。另有研究表明，基線HBV整合水平與血清HBV DNA和HBsAg水平相關，且可以很好地預測患者停藥5年內的HBsAg消失，也提示在臨床需要考慮到 HBV 整合水平對 CHB 患者抗病毒治療臨床結局的影響［44］。

在體外細胞感染模型中發現HBV整合可以被鈉離子-?；悄懰峁厕D運蛋白（NTCP）抑制劑 Bulevirtide 阻斷，但不能被替諾福韋、干擾素等抗病毒藥物及核衣殼裝配抑制劑GLS4阻斷［41］ ，在土撥鼠模型中也發現HBV感染后所有肝細胞都含有cccDNA和整合的DNA序列，在治療過程中cccDNA水平可能會出現下降，但整合的DNA序列數沒有發生明顯減少［45］ ，表明抗病毒治療對HBV整合并不是直接的抑制作用。然而，有臨床隊列研究結果顯示抗病毒治療能夠有效減少患者肝組織內HBV整合事件的數量。一項臨床研究對患者基線和富馬酸替諾福韋酯（TDF）治療3年后的配對肝活檢組織進行RNA-seq，結果顯示，抗病毒治療通過抑制病毒復制減少了轉錄活躍的HBV整合事件的數量［46］ 。另一項研究在患者的配對肝活檢組織中也發現，在抗病毒治療78周及260周后，HBV整合事件的水平出現顯著下降［33］ 。更有研究結果表明，即使在接受10年的抗病毒治療后，所有患者的肝組織中仍能檢測到病毒的整合，但接受長期NAs治療能減少HBV整合事件和肝細胞克隆的數量［47］。

筆者團隊的前期研究也發現，有既往抗病毒治療史的患者HBV整合序列數顯著較少，轉錄活躍的HBV整合事件在肝組織中的分布程度也顯著較低［29］。由此看來，抗病毒治療可能是通過有效地抑制病毒復制，減少包括dslDNA在內各種形式HBV DNA復制中間體的產生，從而阻止新一輪的HBV感染及HBV的從頭整合；同時，未感染的肝細胞克隆擴增，而含有HBV整合的肝細胞可能在肝臟的自我更新過程中丟失并被未感染的細胞取代，也在一定程度上稀釋了含有HBV整合的肝細胞數量，意味著盡早抗病毒治療可以最大限度地減少含有HBV整合的肝細胞的選擇性擴增。此外，抗病毒治療也可以通過抑制病毒復制來緩解肝組織局部炎癥反應，減少基因組DNA的氧化損傷，進而在一定程度上降低HBV整合至宿主基因組中的概率。

眾多研究表明，HBsAg的清除能顯著降低HCC的發生風險，CHB患者越早實現功能性治愈，其遠期獲益越大。而攜帶HBV DNA整合片段且能表達整合來源HBsAg的克隆性擴增肝細胞的數量隨著年齡增長呈增長趨勢，機體的HBV表面抗體特異性T淋巴細胞數量卻隨著年齡增長呈現降低的趨勢［40］ ?？紤]到HBV整合和肝細胞克隆性擴增與HCC風險增加的相關性，應該將抗病毒治療關口前移，使患者更大程度受益。

5 HBV整合對治療策略的影響

盡管降低HBsAg水平是目前評價抗HBV新藥和新策略的關鍵指標，但整合來源的HBsAg表達并不意味著病毒在肝內的活躍復制，這對于定義功能性治愈和考慮HBsAg陽性患者是否能安全停藥是一個重要問題。而為了實現以HBsAg消失為重要指標的功能性治愈，在通過抗病毒治療達到cccDNA的轉錄沉默或完全清除的基礎上，還需要清除具有轉錄活性的整合HBV DNA［48］ 。由于整合來源的HBsAg完全獨立于病毒的復制，導致目前臨床上最為廣泛應用的NAs對整合DNA轉錄和HBsAg的持續表達缺乏有效作用，不能提供理想的功能性治愈率。在當前缺乏能夠完全清除HBV的有效藥物的情況下，需要研發新的抗病毒藥物來清除或抑制病毒，降低抗原表達，或是聯合免疫治療策略，才能進一步提高HBsAg的清除率。

小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）和反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）在內的RNA干擾藥物可以通過以堿基互補的方式與HBV目標基因轉錄本結合，雖然不能直接靶向cccDNA與整合HBV DNA片段，但能阻礙兩者轉錄的mRNA，進一步阻止病毒蛋白的表達，但這種短時間內的血清病毒蛋白水平下降并不一定能使耗竭的細胞免疫功能恢復，cccDNA及整合來源的HBsAg的陰轉往往需要免疫調節的加持。通過提高宿主免疫應答，特別是恢復或增強功能耗損的HBsAg特異性T淋巴細胞活性，不僅能夠清除含有cccDNA的肝細胞，也能夠清除有整合片段表達HBsAg的肝細胞，更有助于實現以血清 HBsAg 清除為標志的功能性治愈?；贑RISPR/Cas9技術的基因編輯療法為多種遺傳病和感染性疾病提供了一種治療手段［49］ ，根據 cccDNA 和HBV整合序列的特征，可以特定靶向病毒序列，進而可能進一步改善CHB人群的功能性治愈率。

6 小結

綜上所述，獨立于病毒復制的 HBV 整合來源的HBsAg可能是阻止CHB患者抗病毒治療后實現功能性治愈的重要因素。雖然現階段對HBV整合的相關機制、慢性HBV感染者中的病毒整合情況及其影響因素以及HBV整合在HCC發生中的作用等都有一定認識，但仍然存在許多尚未解決的問題，特別是HBV整合對功能性治愈的影響值得進一步深入研究。只有找到有效消除HBV整合來源HBsAg的方法，或通過盡早抗病毒治療減少預存的HBV整合，才有可能讓更多CHB患者實現功能性治愈。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明： 俞曉琦負責查閱文獻和文章撰寫；張欣欣負責文章審核并最終定稿。

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收稿日期：2024-11-19；錄用日期：2024-12-17

本文編輯：劉曉紅