基于NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路探討血府逐瘀湯促冠心病血瘀證模型大鼠心肌修復(fù)的作用機(jī)制

〔摘要〕 目的 基于腎連蛋白（NPNT）/Janus激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路探討血府逐瘀湯促冠心病血瘀證模型大鼠心肌修復(fù)的作用機(jī)制。方法 通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立冠心病血瘀證模型，造模成功后將大鼠隨機(jī)分為模型組（灌胃等量蒸餾水）、曲美他嗪組[灌胃5.4 mg/（kg·d）曲美他嗪溶液]和低、中、高劑量組[分別灌胃3.51、7.02、14.04 g/（kg·d）血府逐瘀湯藥液]。另設(shè)正常組（無任何干預(yù)措施）、假手術(shù)組（冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不結(jié)扎），均灌胃等量蒸餾水。每組5只，均連續(xù)灌胃給藥7 d后處死取材。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能指標(biāo);血液流變學(xué)檢測(cè)全血黏度、卡松黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)含量;HE染色法觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化;ELISA法檢測(cè)血清血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）和心肌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1（VEGFR-1）的表達(dá);Western blot法檢測(cè)心肌組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌組織NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心電圖ST段明顯抬高;左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室軸縮短率（LVFS）降低（Plt;0.01），左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）升高（Plt;0.01）;全血黏度（低、中、高切）、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均升高（Plt;0.01）;心肌細(xì)胞腫脹、斷裂、排列紊亂，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞;PDGF-BB、IGF-1、VEGF、VEGFR-1含量均升高（Plt;0.01）;p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)增加（Plt;0.01）;JAK2、STAT3、NPNT的mRNA表達(dá)水平均升高（Plt;0.01）。與模型組比較，各治療組的心電圖ST段出現(xiàn)不同程度下降;曲美他嗪組、中劑量組和高劑量組LVEF、LVFS升高（Plt;0.01），LVIDd、LVIDs降低（Plt;0.01），低劑量組LVIDd降低（Plt;0.05）;曲美他嗪組、中劑量組和高劑量組的全血黏度（低、中、高切）、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均降低（Plt;0.01，Plt;0.05），低劑量組全血黏度（低切）和卡松黏度降低（Plt;0.01，Plt;0.05）;各治療組的心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的改善;曲美他嗪組、中劑量組、高劑量組PDGF-BB、IGF-1、VEGF、VEGFR-1含量均升高（Plt;0.01，Plt;0.05），低劑量組IGF-1、VEGF含量升高（Plt;0.01，Plt;0.05）;各治療組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)均增加（Plt;0.01，Plt;0.05）;曲美他嗪組、中劑量組、高劑量組NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平均升高（Plt;0.01）。結(jié)論 血府逐瘀湯能顯著改善冠心病血瘀證模型大鼠的心肌損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)血管新生有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 冠心病;血瘀證;血府逐瘀湯;NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路;心肌修復(fù)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.002

Mechanism of action of Xuefu Zhuyu Decoction in promoting myocardial repair in a rat model of coronary heart disease with blood stasis pattern based on the NPNT/JAK2/STAT3 signaling pathway

WANG Mingyun， LIU Yi， YANG Yang， TIAN Peng， LI Jing， KUANG Huifang，

DONG Jing， ZHANG Qiuyan*

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of action of Xuefu Zhuyu Decoction （XFZYD） in promoting myocardial repair in a rat model of coronary heart disease with blood stasis pattern based on the NPNT/Janus kinase 2 （JAK2）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） signaling pathway. Methods A rat model of coronary heart disease with blood stasis pattern was established by ligating the left anterior descending branch of the coronary artery. After successful modeling， the rats were randomized into model group （intragastric administration of an equal volume of distilled water）， trimetazidine group [intragastric administration of 5.4 mg/（kg·d） trimetazidine solution]， and low-， medium-， and high-dose XFZYD groups （intragastric administration of 3.51， 7.02， and 14.04 g/（kg·d） of XFZYD solution， respectively）. Additionally， a normal group （no intervention measures） and a sham-operated group （the left anterior descending coronary artery was only threaded but not ligated） were established， and both groups were administered an equal volume of distilled water by gavage. Five rats were in each group， and all were euthanized for tissue collection after seven days of continuous gavage administration. Echocardiography was performed to measure the rat cardiac function indicators; Hemorheological tests were conducted to determine the whole blood viscosity， Casson viscosity， and red blood cell aggregation index; HE staining was used to observe the morphological changes in myocardial tissue; ELISA was employed to measure the expressions of serum platelet-derived growth factor-BB （PDGF-BB）， insulin-like growth factor-1 （IGF-1）， myocardial tissue vascular endothelial growth factor （VEGF）， and vascular endothelial cell growth factor receptor-1 （VEGFR-1）; Western blot was used to examine the protein expressions of JAK2， p-JAK2， STAT3， and p-STAT3 in myocardial tissue; real-time fluorescence quantitative PCR was performed to check the mRNA expressions of NPNT， JAK2， and STAT3 in myocardial tissue. Results Compared with the sham-operated group， the model group showed significant ST-segment elevation on electrocardiogram， lower left ventricular ejection fraction （LVEF） and left ventricular fractional shortening （LVFS） （Plt;0.01）， higher left ventricular end-diastolic diameter （LVIDd） and left ventricular end-systolic diameter （LVIDs） （Plt;0.01）， elevated whole blood viscosity （low， medium， and high shear rates）， Casson viscosity， and red blood cell aggregation index all （Plt;0.01）， swollen， fractured， and disordered myocardial cells with numerous inflammatory cells， higher levels of PDGF-BB， IGF-1， VEGF， and VEGFR-1 （Plt;0.01）， elevated protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 （Plt;0.01）， and higher mRNA expression levels of JAK2， STAT3， and NPNT （Plt;0.01）. Compared with the control group， the treatment groups showed varying degrees of ST-segment reduction on electrocardiogram. The trimetazidine group， medium-dose XFZYD group， and high-dose XFZYD group showed higher LVEF and LVFS （Plt;0.01）， and lower LVIDd and LVIDs （Plt;0.01）， while the low-dose XFZYD group showed reduced LVIDd （Plt;0.05）. The trimetazidine group， medium-dose XFZYD group， and high-dose XFZYD group showed lower whole blood viscosity （low， medium， and high shear rates） （Plt;0.01， Plt;0.05）， while the low-dose XFZYD group showed reduced whole blood viscosity （low shear） and Casson viscosity （Plt;0.01， Plt;0.05）. The myocardial cell morphology and structure were improved to varying degrees in all treatment groups. The trimetazidine group， medium-dose XFZYD group， and high-dose XFZYD group showed higher levels of PDGF-BB， IGF-1， VEGF， and VEGFR-1 （Plt;0.01， Plt;0.05）， while the low-dose XFZYD group showed higher levels of IGF-1 and VEGF （Plt;0.01， Plt;0.05）. All treatment groups showed elevated protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 （Plt;0.01， Plt;0.05）. The trimetazidine group， medium-dose XFZYD group， and high-dose XFZYD group showed higher mRNA expression levels of NPNT， JAK2， and STAT3 （Plt;0.01）. Conclusion XFZYD can significantly reduce myocardial injury in a rat model of coronary heart disease with blood stasis pattern. Its mechanism may be related to the regulation of the NPNT/JAK2/STAT3 signaling pathway and promotion of angiogenesis.

〔Keywords〕 coronary heart disease; blood stasis pattern; Xuefu Zhuyu Decoction; NPNT/JAK2/STAT3 signaling pathway; myocardial repair

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，簡(jiǎn)稱冠心病，是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變引起的血管管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死，是造成死亡或致殘的重要疾病之一[1]。研究顯示，血運(yùn)重建是治療冠心病的主要手段，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入作為血運(yùn)重建的主要方式，可明顯改善患者癥狀和預(yù)后[2]。然而，經(jīng)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)治療后可能出現(xiàn)進(jìn)行性動(dòng)脈粥樣硬化性閉塞[3];經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療一年后發(fā)生再狹窄的可能性極大[4]，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此，如何恢復(fù)冠心病患者的血液供應(yīng)，促進(jìn)心肌修復(fù)，從而提高患者的生存率，仍然是當(dāng)今的難題。

血瘀證是冠心病的關(guān)鍵證型，祛瘀生新是中醫(yī)治療冠心病的根本大法。血府逐瘀湯是活血化瘀的經(jīng)典名方，也是體現(xiàn)祛瘀生新法的代表方劑，臨床廣泛用于冠心病的治療，療效確切，大量臨床研究證實(shí)該方具有較好的保護(hù)冠心病心肌缺血的作用[5-9]。課題組前期研究表明，該方能夠促進(jìn)缺血心肌血管新生[10-11]、延緩內(nèi)皮組細(xì)胞衰老[12-14]等，有效保護(hù)心肌缺血損傷。課題組雖已開展了血府逐瘀湯促缺血心肌血管新生的部分研究，但其作用機(jī)制尚未完全明確。腎連蛋白（nephronectin， NPNT）是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子樣超家族[15]，也是旁分泌血管生成因子，參與血管新生過程[16]。Janus激酶2（Janus

kinase 2， JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖中起著重要的作用，參與多種生物學(xué)過程[17]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是JAK2/STAT3途徑的下游效應(yīng)因子，與JAK2/STAT3信號(hào)通路結(jié)合后可激活一系列病理生理反應(yīng)。

因此，本研究以NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)的血管新生為切入點(diǎn)，通過結(jié)扎大鼠冠脈構(gòu)建冠心病血瘀證模型，探討血府逐瘀湯通過調(diào)控NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)冠心病血瘀證模型大鼠心肌修復(fù)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（240±20） g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：430727231101449155，許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009，倫理編號(hào)：LL2023022202。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)，相對(duì)溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度55%～60%，自由攝食飲水。

1.2" 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑

血府逐瘀湯：當(dāng)歸三錢（9 g），生地黃三錢（9 g），桃仁四錢（12 g），紅花三錢（9 g），枳殼二錢（6 g），赤芍二錢（6 g），柴胡一錢（3 g），甘草二錢（6 g），桔梗一錢半（4.5 g），川芎一錢半（4.5 g），牛膝三錢（9 g）。飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。用10倍量蒸餾水將血府逐瘀湯飲片浸泡30 min，煎煮1 h，濾出藥液，再加8倍量蒸餾水煎煮1 h，濾出藥液，混合兩次藥液，制備為含生藥量0.702 g/mL的溶液。鹽酸曲美他嗪緩釋片（益爽美）[齊魯制藥有限公司，批號(hào)：14202871991，規(guī)格：35 mg×14片，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20193055]。

大鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（platelet-derived growth factor-BB， PDGF-BB）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor 1， IGF-1）、VEGF、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1（vascular endothelial growth factor receptor-1， VEGFR-1）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ml003279、ml059459、ml064294、ml002934）;JAK2、p-JAK2抗體（長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司，批號(hào)：AWA10178、AWA41311）;STAT3抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：10253-2-AP）;p-STAT3抗體（艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：T56566）。

1.3" 主要儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)：RWD407）;數(shù)字心電圖機(jī)（廣州市三銳電子科技有限公司，型號(hào)：VECG-2303B）;小動(dòng)物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)（蘇州市飛依諾科技有限公司，型號(hào)：D650 LAB）;全自動(dòng)血液流變測(cè)試儀（北京賽科希德科技股份有限公司，型號(hào)：SA-7000）;生物組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：KD-BM Ⅱ）;石蠟切片機(jī)（賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：HM 325）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）;全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PW-812、MB-530）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)：DHP-500）;電泳儀電源（北京龍方科技有限公司，型號(hào)：LF-600S）;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司，型號(hào)：SH-523）;熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司，型號(hào)：LightCycler 480Ⅱ）。

1.4" 大鼠冠心病血瘀證模型的制備

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。參考徐叔云等編著的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》（第2版）[18]中提出的心臟與冠狀血管實(shí)驗(yàn)法。將大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉，麻醉后固定大鼠，頸部和左側(cè)胸部備皮后行氣管插管術(shù)，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸比設(shè)置為2∶1，呼吸頻率為75次/min，潮氣量定為30 mL，連接數(shù)字心電圖機(jī)觀察大鼠心電圖變化。左側(cè)胸部消毒，沿左側(cè)第4～5肋間切開，切口長(zhǎng)度約為3 cm，對(duì)周圍組織進(jìn)行鈍性分離，打開胸腔，暴露心臟。用眼科鑷將心包膜前部撕開，隨后用6-0型號(hào)帶線縫合針結(jié)扎左心耳下方約2 mm處的左前降支冠狀動(dòng)脈。以左室前壁向外膨脹發(fā)白和心電圖ST段抬高為冠心病模型結(jié)扎成功的標(biāo)志，以后續(xù)血液流變學(xué)和心功能檢測(cè)作為評(píng)價(jià)血瘀證模型成功的指標(biāo)。將心臟歸于胸腔原位后迅速關(guān)閉胸腔，并逐層縫合傷口，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后撤離呼吸機(jī)插管，縫合頸部皮膚。術(shù)后采取肌內(nèi)注射青霉素8萬U/只，連續(xù)3 d預(yù)防感染。

1.5" 動(dòng)物分組與給藥

在冠心病血瘀證大鼠模型造模成功24 h后，將其隨機(jī)分為模型組、曲美他嗪組及低、中、高劑量組。另設(shè)正常組（不施加任何干預(yù)）、假手術(shù)組（冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不結(jié)扎）。正常組、假手術(shù)組、模型組均灌胃20 mL/（kg·d）蒸餾水，曲美他嗪組灌胃5.4 mg/（kg·d）曲美他嗪溶液，低、中、高劑量組分別灌胃3.51、7.02、14.04 g/（kg·d）血府逐瘀湯藥液。造模成功后第2天開始灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃7 d，并于第7天灌胃2 h后處死大鼠并取材。

1.6" 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1" 大鼠一般癥狀觀察" 每天于8：00測(cè)量大鼠的體質(zhì)量，并在安靜環(huán)境下觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛發(fā)、爪甲、舌色、口唇等一般情況，詳細(xì)記錄。

1.6.2" 心電圖檢測(cè)" 各組大鼠取仰臥位固定，進(jìn)行心電圖檢查，觀察ST段的變化。

1.6.3" 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能變化情況" 采用小動(dòng)物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)，將探頭固定在大鼠左心室長(zhǎng)軸切面，測(cè)定各組大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions， LVEF）、左室軸縮短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension， LVIDs）。每個(gè)指標(biāo)均連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，再取平均值。

1.6.4" 血液流變學(xué)檢測(cè)" 大鼠腹主動(dòng)脈采血3～4 mL，儲(chǔ)存于肝素鈉抗凝管中，充分搖勻，避免凝血，置于全自動(dòng)血液流變測(cè)試儀中檢測(cè)全血黏度[低（1 s）、中（50 s）、高（200 s）切]、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)。

1.6.5" HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化" 取完整心臟組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定，使用梯度乙醇脫水后，石蠟包埋切片，蘇木素染料進(jìn)行核染，伊紅染液使細(xì)胞質(zhì)著色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。

1.6.6" ELISA法檢測(cè)大鼠血清中PDGF-BB、IGF-1的含量" 各組大鼠腹主動(dòng)脈取血3～4 mL，靜置后在臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中以3 000 r/min離心15 min（離心半徑7 cm），取上清液置于-80 ℃冰箱保存。按照PDGF-BB檢測(cè)試劑盒、IGF-1檢測(cè)試劑盒的操作要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析。

1.6.7" ELISA法檢測(cè)大鼠心肌中VEGF、VEGFR-1的含量" 各組大鼠取20 mg心肌組織，研磨后加入PBS制成勻漿，于2～8 ℃臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)以5 000 r/min離心5 min（離心半徑7 cm）取上清液，按照VEGF檢測(cè)試劑盒、VEGFR-1檢測(cè)試劑盒的操作要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析。

1.6.8" Western blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)" 于冰上將心肌組織剪碎后按比例加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，勻漿機(jī)充分勻漿后冰上靜置20 min，4 ℃下12 000 r/min，離心5 min（離心半徑7 cm）后取上清液。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度后制備蛋白樣品。取各組適量樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉。將膜置入一抗（β-actin稀釋比例為1∶2 000，JAK2和p-JAK2稀釋比例為1∶1 000，STAT3和p-STAT3稀釋比例為1∶4 000），于4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次后加二抗（稀釋比例為1∶10 000），室溫孵育2 h。TBST漂洗3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。用ImageJ軟件分析灰度值。

1.6.9" 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)" 按照RNA試劑盒要求提取總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA作為模板，β-actin作為內(nèi)參再配制20 μL反應(yīng)體系（2 μL cDNA、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、7.2 μL無酶水、10 μL熒光DNA結(jié)合染料），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法檢測(cè)NPNT、JAK2、STAT3的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次。引物序列見表1。

1.7" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示。組間比較若滿足正態(tài)性與方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法;若不滿足方差齊性，采用Dunnett's T3法;若不符合正態(tài)性，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 各組大鼠一般癥狀

造模過程中大鼠死亡25只，存活35只，最終確定每組納入5只大鼠。正常組、假手術(shù)組大鼠正常攝食飲水，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)度強(qiáng)，體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，毛發(fā)順滑帶有光澤感，爪甲、唇舌紅潤(rùn)。模型組大鼠飲食量減少，精神狀態(tài)差，接觸時(shí)應(yīng)激性強(qiáng)，體質(zhì)量增加較慢，毛發(fā)干枯無光澤，爪甲紫暗，鼻尖偶有出血，舌面有瘀點(diǎn)，口唇發(fā)紫。低劑量組大鼠精神狀態(tài)不佳，活動(dòng)度差，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)干澀灰暗，爪甲、舌面色深。與模型組比較，曲美他嗪組、中劑量組、高劑量組大鼠精神狀態(tài)有所改善，活動(dòng)度增加，體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，毛色漸有光澤感，爪甲稍有血色，口唇、舌質(zhì)稍紅潤(rùn)。

2.2" 各組大鼠心電圖比較

正常組和假手術(shù)組心電圖波形相對(duì)規(guī)整。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心電圖Ⅱ?qū)?lián)可見ST段明顯抬高，初步提示大鼠冠心病模型制備成功。與模型組比較，曲美他嗪組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的心電圖Ⅱ?qū)?lián)可見ST段不同程度降低。詳見圖1。

2.3" 各組大鼠心功能比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的LVEF、LVFS降低（Plt;0.01），LVIDd、LVIDs升高（Plt;0.01）。與模型組比較，曲美他嗪組、中劑量組、高劑量組LVEF、LVFS升高（Plt;0.01），LVIDd、LVIDs降低（Plt;0.01）;低劑量組LVIDd降低（Plt;0.05）。與曲美他嗪組比較，低劑量組LVEF、LVFS降低（Plt;0.01），LVIDd、LVIDs升高（Plt;0.01）。與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組的LVEF、LVFS升高（Plt;0.01），LVIDd、LVIDs降低（Plt;0.01）。與中劑量組比較，高劑量組LVFS降低（Plt;0.01）。詳見表2。

2.4" 各組大鼠血液流變學(xué)比較

與假手術(shù)組比較，模型組的全血黏度（低、中、高切）、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均升高（Plt;0.01）。與模型組比較，曲美他嗪組、中劑量組和高劑量組的全血黏度（低、中、高切）、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均降低（Plt;0.01，Plt;0.05）;低劑量組全血黏度（低切）和卡松黏度降低（Plt;0.01，Plt;0.05）。與曲美他嗪組比較，低劑量組全血黏度（低、中、高切）、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均升高（Plt;0.01，Plt;0.05）;中劑量組全血黏度（低、中切）和紅細(xì)胞聚集指數(shù)降低（Plt;0.01，Plt;0.05）;高劑量組全血黏度（低、中、高切）降低（Plt;0.01，Plt;0.05）。與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組全血黏度（低、中、高切）、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均降低（Plt;0.01）。詳見表3。

2.5" 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核呈橢圓形，可見橫紋，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠心肌組織明顯受損，心肌細(xì)胞腫脹、斷裂、排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯可見。曲美他嗪組細(xì)胞間質(zhì)分布較均勻，心肌細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。低劑量組可見心肌細(xì)胞排列較為紊亂疏松，橫紋較模糊，仍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中劑量組心肌細(xì)胞變性程度減輕，心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，心肌間隙減小，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組心肌細(xì)胞變性程度減輕，心肌細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)整，細(xì)胞間質(zhì)間可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見圖2。

2.6" 各組大鼠血清PDGF-BB、IGF-1含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組PDGF-BB、IGF-1含量升高（Plt;0.01）。與模型組比較，曲美他嗪組、中劑量組、高劑量組PDGF-BB、IGF-1含量升高（Plt;0.01，Plt;0.05）;低劑量組IGF-1含量升高（Plt;0.01）。與曲美他嗪組比較，低劑量組PDGF-BB、IGF-1含量降低（Plt;0.01）;中劑量組和高劑量組PDGF-BB、IGF-1含量升高（Plt;0.01）。與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組PDGF-BB、IGF-1含量升高（Plt;0.01）。與中劑量組比較，高劑量組PDGF-BB、IGF-1含量降低（Plt;0.01）。詳見表4。

2.7" 各組大鼠心肌VEGF、VEGFR-1含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組VEGF、VEGFR-1含量升高（Plt;0.01）。與模型組比較，曲美他嗪組、中劑量組、高劑量組VEGF、VEGFR-1含量升高（Plt;0.01）;低劑量組VEGF含量升高（Plt;0.05）。與曲美他嗪組比較，低劑量組VEGF、VEGFR-1含量降低（Plt;0.01）;中劑量組VEGF含量升高（Plt;0.01）;高劑量組VEGF、VEGFR-1含量降低（Plt;0.01）。與中劑量組比較，高劑量組VEGF、VEGFR-1含量降低（Plt;0.01）。詳見表5。

2.8" 各組大鼠心肌組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較

各組間JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)增加（Plt;0.01）。與模型組比較，曲美他嗪組、低劑量組、中劑量組和高劑量組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)增加（Plt;0.01，Plt;0.05）。與曲美他嗪組比較，低劑量組p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)減少（Plt;0.01，Plt;0.05）。與低劑量組比較，中劑量組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)增加（Plt;0.01）;高劑量組p-JAK2蛋白表達(dá)增加（Plt;0.05）。與中劑量組比較，高劑量組p-STAT3蛋白表達(dá)減少（Plt;0.05）。詳見圖3、表6。

2.9" 各組大鼠心肌組織NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平均升高（Plt;0.01）。與模型組比較，曲美他嗪組、中劑量組、高劑量組NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平均升高（Plt;0.01）。與曲美他嗪組比較，低劑量組NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平均降低（Plt;0.01）;中劑量組NPNT、JAK2的mRNA表達(dá)水平均升高（Plt;0.01，Plt;0.05）。與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平均升高（Plt;0.01）。與中劑量組比較，高劑量組NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平均降低（Plt;0.01）。詳見表7。

3 討論

冠心病是心血管疾病中導(dǎo)致死亡或病殘的最主要疾病之一，我國(guó)冠心病中醫(yī)證型的流行病學(xué)研究顯示，心血瘀阻證是出現(xiàn)頻率最高的證型[19]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血行瘀滯，心脈痹阻，經(jīng)絡(luò)不通是該證型的病機(jī)[20]，因此強(qiáng)調(diào)用活血化瘀法以助行血消瘀滯，達(dá)到祛瘀生新之效。血府逐瘀湯是臨床治療冠心病的常用活血化瘀類代表方，該方在桃紅四物湯和四逆散的基礎(chǔ)上化裁，佐以桔梗和牛膝，具有祛瘀、活血、行氣之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)[21]，血府逐瘀湯能改善血液凝固性、血液流變性和毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)微循環(huán)，抑制血小板功能，防止血栓形成，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制心肌細(xì)胞壞死及凋亡，促進(jìn)缺血心肌血管新生[21]。本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，制備冠心病血瘀證模型，采用活血化瘀經(jīng)典方血府逐瘀湯作為干預(yù)藥物，通過觀察大鼠的心電圖、心功能變化、血液流變學(xué)、心肌組織形態(tài)學(xué)、血清PDGF-BB和IGF-1的含量、心肌VEGF和VEGFR-1的含量以及NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)，多方面驗(yàn)證血府逐瘀湯對(duì)心肌修復(fù)的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)血府逐瘀湯中劑量和高劑量干預(yù)后，大鼠心電圖ST段抬高幅度下降，LVEF、LVFS顯著升高，LVIDd、LVIDs顯著降低，大鼠心功能受損得到改善;代表血瘀證客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)[22-23]的全血黏度（低、中、高切）、卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著降低，提示血府逐瘀湯可有效改善血瘀證血液“黏、稠、凝、聚”的特征[24]，使血行通暢，減輕瘀阻。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過促進(jìn)血管新生可以增加缺血、缺氧心肌細(xì)胞的血氧供應(yīng)，提高細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生成，從而有助于心肌的修復(fù)，減少心肌壞死的可能性[25]。PDGF-BB能夠有效促進(jìn)缺血心肌區(qū)域的血管新生;IGF-1分布于心血管系統(tǒng)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)心肌纖維生長(zhǎng)[26]。VEGF和VEGF受體是血管生成的中間產(chǎn)物，常在心血管疾病相關(guān)的血管生成調(diào)控中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯中劑量和高劑量均能提高PDGF-BB、IGF-1、VEGF、VEGFR-1的表達(dá)，表明血府逐瘀湯可能通過促進(jìn)心肌缺血區(qū)域血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)血管新生，修復(fù)受損心肌。NPNT在心臟發(fā)育早期起到至關(guān)重要的作用，作為表皮生長(zhǎng)因子受體（epider?mal growth factor receptor， EGFR）的配體之一，可通過自身表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)序列與EGFR結(jié)合后激活下游的JAK2/STAT3關(guān)鍵信號(hào)蛋白，并與JAK2/STAT3信號(hào)通路結(jié)合，激活一系列病理生理反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[17]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其中，JAK2在造血和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)紅細(xì)胞生成及免疫細(xì)胞的活化具有重要作用[28];STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，活化后能誘導(dǎo)多種與細(xì)胞分化、凋亡及血管生成等生物學(xué)行為相關(guān)的下游靶基因的表達(dá)，而阻斷STAT3的活化，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和微血管的形成[29]。本研究結(jié)果顯示，血府逐瘀湯可上調(diào)NPNT、JAK2、STAT3的mRNA表達(dá)水平并促進(jìn)p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)，提示血府逐瘀湯可能通過激活NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)下游VEGF的表達(dá)，從而調(diào)控血管新生，修復(fù)心肌缺血損傷。

本研究以血府逐瘀湯為被試因素，綜合運(yùn)用生物化學(xué)、組織病理學(xué)、ELISA法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blot法等現(xiàn)代技術(shù)，觀察血府逐瘀湯對(duì)冠心病血瘀證模型大鼠宏觀指標(biāo)與微觀指標(biāo)的影響，闡明血府逐瘀湯通過調(diào)控血管新生修復(fù)心肌缺血損傷的重要作用。但本研究采用7 d觀察期，用時(shí)較短，后續(xù)研究可以適當(dāng)延長(zhǎng)治療期，并增加NPNT的受體EGFR和JAK2/STAT3通路抑制劑等相關(guān)蛋白的檢測(cè)，以進(jìn)一步闡明血府逐瘀湯促進(jìn)冠心病血瘀證模型大鼠的心肌修復(fù)與NPNT/JAK2/STAT3信號(hào)通路的相關(guān)性。

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〔收稿日期〕2024-07-01

〔基金項(xiàng)目〕湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2024JJ8167）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)2022年度學(xué)科建設(shè)揭榜掛帥項(xiàng)目（22JBZ005）;2023年湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20230796）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)2023年“一方”研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2023YF07）。

〔通信作者〕*張秋雁，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：1746821852@qq.com。