整合指紋圖譜與多成分含量測定的益腎固精暖臍貼質量評價研究

〔摘要〕 目的 建立益腎固精暖臍貼高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，并測定不同批次益腎固精暖臍貼中6種成分（桂皮醛、丁香酚、羥基-ɑ-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素）的含量，為益腎固精暖臍貼質量控制提供參考。方法 采用高效液相色譜法建立15批益腎固精暖臍貼指紋圖譜，進行相似度評價和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）篩選差異性成分，并對6種指標成分進行含量測定。結果 建立益腎固精暖臍貼HPLC指紋圖譜及6種指標成分的含量測定方法，15個批次相似度范圍為0.874～0.999，標定共有峰21個，指認出6個色譜峰，篩選出12個差異性成分。15批益腎固精暖臍貼中6種成分含量穩定。結論 建立的益腎固精暖臍貼指紋圖譜及6種成分的含量測定方法準確、穩定、重復性好，可用于益腎固精暖臍貼的質量控制。

〔關鍵詞〕 益腎固精暖臍貼;指紋圖譜;含量測定;質量評價;相似度評價;正交偏最小二乘法-判別分析

〔中圖分類號〕R284.1" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.008

Quality evaluation of Yishen Gujing Nuanqi Patch through integration of fingerprinting and multi-component content determination

LIAO Zhuo1，2， BAO Qing1， GAO Yuanhang1， LI Haiying2， WANG Lu2， TANG Lin2， YANG Lei2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint for Yishen Gujing Nuanqi Patch （YSGJNQP） and to determine the content of six components （cinnamic aldehyde， eugenol， hydroxy-ɑ-sanshool， hydroxy-β-sanshool， parent eugenol， and osthole） in different batches， so as to provide the reference for the quality control of YSGJNQP. Methods Fingerprints of 15 batches of YSGJNQP were established by HPLC. The similarity evaluation and orthogonal partial least square method-discriminant analysis （OPLS-DA） were used to screen out the differential components， and the content of six index components was determined. Results The HPLC fingerprint of YSGJNQP and the content determination method of the six index components were established. The similarity among 15 batches of samples ranged from 0.874 to 0.999， twenty-one common peaks and six chromatographic peaks were identified， and 12 differential components were screened out. The content of the six index components was found to be stable across the 15 batches of YSGJNQP. Conclusion The established HPLC fingerprint of YSGJNQP and the content determination method of its six components are accurate， stable， and reproducible. Consequently， it can be effectively used for the quality control of YSGJNQP.

〔Keywords〕 Yishen Gujing Nuanqi Patch; fingerprint; content determination; quality evaluation; similarity evaluation; orthogonal partial least square method-discriminant analysis

本實驗方劑選自《攝生秘剖》卷四中的固精益腎暖臍膏，處方主要由肉桂、母丁香、蛇床子、花椒、韭菜子、附子、硫黃、麝香組成[1]。具有溫補脾腎、興陽起痿、固護腎精之功效，用于治療男子精寒、陽事痿弱、白濁遺精等癥。本課題組前期利用現代制劑技術對傳統制劑進行改良，創新性將藥物治療、穴位治療和灸法相結合，研制了一種新型穴位貼膏劑[2]。

益腎固精暖臍貼由多種中藥材組成中藥復方制劑，每一味中藥均含多種化學成分，各類成分之間相互作用從而形成了一個復雜的體系。單一或多指標性成分含量測定難以體現中藥多成分整體作用優勢。中藥指紋圖譜結合多指標成分定量可全面反映化學成分的信息，為中藥質量控制的有效分析方法[3-6]。化學模式識別技術可以對指紋圖譜中的差異標志峰進行篩選[7-8]。二者結合能更加系統、全面、準確地對益腎固精暖臍貼進行質量評價。

本研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）建立益腎固精暖臍貼指紋圖譜，并結合相似度評價、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least square method-discriminant analysis， OPLS-DA）對其進行整體性評價及差異標志物篩選，最后進行多指標性成分的含量測定，為益腎固精暖臍貼的質量標準提供試驗依據。

1 材料

1.1" 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀、Poroshell 120色譜柱（4 μm，4.6 mm×150 mm）、Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm），均購自美國安捷倫科技有限公司;SK5200H超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）;AUX-220型分析天平（日本SHIMADZU公司）。

1.2" 試劑與試藥

肉桂（批號：230402，產地：河北）、母丁香（批號：230403，產地：安徽）、麝香（批號：2022YR185，產地：四川）、花椒（批號：230702，產地：湖南）、附子（批號：230301，產地：甘肅）、蛇床子（批號：221201，產地：浙江）、硫黃（批號：230501，產地：云南）、韭菜子（批號：230603，產地：廣西）均購自湖南南國藥都飲片公司，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院楊磊主任藥師鑒定為正品。

益腎固精暖臍貼（批號：2023110201，2023110202，2023110301，2023110401，2023110801，2023110901，2023111101，2023111201，2023111301，2023111402，2023111403，2023111701，2023111702，2023111703，2023111801，湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心）。桂皮醛對照品（批號：110710-202223）、丁香酚對照品（批號：110725-201917）、母丁香酚對照品（批號：112065-202001）、蛇床子素對照品（批號：110822-202111）均購自中國食品藥品檢定研究院;羥基-α-山椒素對照品（批號：AFCD2611，成都埃法生物科技有限公司）;羥基-β-山椒素對照品（批號：J19GB155243，上海源葉生物科技有限公司）。

色譜乙腈（批號：W51A1H，霍尼韋爾貿易有限公司）;磷酸（批號：20211027，國藥集團化學試劑有限公司）;其余試劑均為分析純;水為超純水。

2 方法與結果

2.1" 指紋圖譜研究

2.1.1" 色譜條件" Poroshell 120色譜柱（4 μm，4.6 mm×150 mm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～20 min，10%～20%A;20～30 min，20%A;30～40 min，20%～30%A;40～50 min，30%～40%A;50～55 min，40%～50%A;55～65 min，50%A;65～71 min，50%～60%A;柱溫30 ℃;體積流量1 mL/min;檢測波長0～40 min為322 nm，40～60 min為280 nm，60～71 min為322 nm;進樣量20 μL。

2.1.2" 溶液制備" 混合對照品溶液的制備：精密稱定桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素對照品適量，用甲醇溶解配置成3.675 mg/mL桂皮醛、0.550 mg/mL丁香酚、0.190 mg/mL羥基-α-山椒素、0.387 mg/mL羥基-β-山椒素、0.021 mg/mL母丁香酚、0.018 mg/mL蛇床子素的混合對照溶液。

供試品溶液的制備：取10貼益腎固精暖臍貼，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL的甲醇，超聲提取15 min，靜置12 h，用甲醇補足減失的重量，混勻提取液，取其上清液，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3" 方法學考察" 精密度考察：選取益腎固精暖臍貼（批號：20231108），按“2.1.2”方法制備供試品溶液，連續進樣6次，以18號峰作為參照峰，計算相對保留時間的相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）為0.09%～1.43%，相對峰面積RSD為0.12%～6.61%，表明儀器精密度良好。

穩定性考察：選取益腎固精暖臍貼（批號：20231108），按“2.1.2”方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜方法分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，以18號峰作為參照峰，共有峰的相對保留時間RSD為0.03%～0.91%，相對峰面積RSD 0.20%～6.10%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性考察：選取益腎固精暖臍貼（批號：20231108），按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以18號峰作為基峰，各共有峰的相對保留時間RSD為0.07%～0.69%，相對峰面積RSD為1.51%～8.82%，表明該方法重復性良好。

2.1.4" 益腎固精暖臍貼HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價" 取15批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，得到15批樣品的HPLC色譜圖（圖1），導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）進行分析，采用中位數法，時間窗寬度設置為0.3 min，經多點校正后，進行Mark譜匹配，生成益腎固精暖臍貼共有模式的對照指紋圖譜（圖2），共標定益腎固精暖臍貼21個共有峰。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）進行分析，選定S5色譜圖為對照圖譜，計算相似度。15批樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度為0.874～0.999，表明各批次相似度較高，所建立的指紋圖譜可以較全面地反映益腎固精暖臍貼整體質量。

2.2" OPLS-DA

為進一步確認不同批次益腎固精暖臍貼之間的差異性化學成分，采用OPLS-DA擬合模型，以變量重要性投影（variable importance projected value， VIP）gt;1.0為標準，篩選出色譜峰12個（圖3）。通過對照品指認出峰14為桂皮醛、峰19為羥基-β-山椒素、峰20為丁香酚、峰18為羥基-α-山椒素（圖2）。

2.3" 益腎固精暖臍貼6種成分含量測定

2.3.1" 色譜條件nbsp; Agilent TC-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～20 min，10%～20%A;20～30 min，20%A;30～40 min，20%～30%A;40～50 min，30%～40%A;50～55 min，40%～50%A;55～65 min，50%A;65～71 min，50%～60%A;柱溫30 ℃;流速：1 mL/min;檢測波長0～59 min為280 nm;60 min之后322 nm;進樣量20 μL。

2.3.2" 溶液的制備" 混合對照品溶液和供試品溶液制備同“2.1.2”項方法。陰性樣品溶液制備：制備缺肉桂、缺母丁香、缺花椒、缺蛇床子的貼膏陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。空白樣品溶液制備：制備不含藥物成分的貼膏空白樣品，按照供試品溶液制備方法制得空白樣品溶液。

2.3.3" 方法學考察" 專屬性考察：取“2.3.2”項下制備的溶液，按“2.3.1”的色譜條件進樣，由結果可知，6種成分色譜峰保留時間一致，分離度良好，且無陰性干擾。詳見圖4。

線性關系考察：精密吸取“2.3.2”項下制備混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得到系列質量濃度的對照品溶液。按照“2.3.1”項下色譜條件進行進樣分析。以各成分進樣質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），得6種成分的線性回歸方程、R2值及線性范圍，結果見表1。由結果可知，在一定質量濃度范圍內，6種成分線性關系均良好。

精密度考察：取同一批次貼膏，按照“2.3.2”項下方法制備成供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6次，結果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素峰面積RSD分別為0.68%、0.96%、0.97%、0.86%、0.90%、0.82%。表明儀器精密度良好。

穩定性考察：取同一批次貼膏，按照“2.3.2”項下方法制備成供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件，分別于 0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素峰面積RSD分別為0.68%、1.31%、0.40%、0.35%、0.66%、0.44%。表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。

重復性考察：取同一批次的貼膏，按照“2.3.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進行進樣測定。結果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素含量RSD分別為2.37%、1.80%、0.15%、0.76%、0.65%、0.20%。表明該方法重復性良好。

加樣回收率考察：取同一批貼膏6份，精密稱定，按照質量濃度1∶1的比例加入6種對照品，依據“2.3.2”項下操作方法進行供試品溶液的制備，再依據“2.3.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素的平均加樣回收率分別為100.71%、94.73%、99.74%、103.80%、94.01%、97.24%;RSD分別為0.36%、0.24%、2.29%、2.69%、0.52%、0.52%。表明該方法準確可靠。

2.3.4" 樣品含量測定" 取15批樣品，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進行檢測，每批樣品平行測定3次，記錄峰面積，并計算每批貼膏中桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素的含量，結果見表2。每1 g本品桂皮醛、丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、母丁香酚、蛇床子素的平均含量分別為3.735、0.166、0.152、0.321、0.030、0.022 mg/g。

3 討論

中藥多指標成分整體質量控制已成為中藥質量控制的必然發展趨勢，中藥指紋圖譜能夠反應方劑所含成分，揭示成分的特征性、溯源性及可測性，具有整體性與動態性的特點，是一種有效的質量評價方法。本研究基于15批樣品建立了益腎固精暖臍貼的HPLC指紋圖譜及其6種指標成分的含量測定方法，通過相似度分析初步評價了15批樣品的相似性，標定共有峰21個，結合OPLS-DA進一步篩選出12個特征峰峰，指認其中6個共有成分。

方中蛇床子的主要有效成分蛇床子素能夠有效地補腎壯陽，改善腎陽虛證[9];肉桂的主要藥效物質為揮發油類，其中桂皮醛具有改善勃起功能的作用[10-11];母丁香廣泛應用于治療腎虛陽痿，2020版《中華人民共和國藥典》[12]對其進行質量控制的指標性成分主要是丁香酚和母丁香酚[13-14]。花椒的藥效成分山椒素具有溫中作用，且有較高的生物利用度[15]。因此，篩選出桂皮醛、丁香酚、母丁香酚、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、蛇床子素這6種成分可作為益腎固精暖臍質量控制的指標成分。

綜上，本研究建立的指紋圖譜和含量測定方法可對益腎固精暖臍貼的內在質量進行整體性評價，該方法重復性、穩定性好，可為益腎固精暖臍貼的質量分析、評價與控制提供科學依據。

參考文獻

[1] 攝生秘剖[M]//牛亞華. 棲芬室藏中醫典籍精選： 第二輯[M]. 北京： 北京科學技術出版社， 2017.

[2] 包" 晴， 高元航， 廖" 卓， 等. 益腎固精暖臍貼制備工藝的研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（6）： 1018-1026.

[3] 郭浩川， 王杰敏， 張玉玲， 等. 經典名方升陷湯配方顆粒與水煎液的HPLC指紋圖譜相關性研究[J]. 時珍國醫國藥， 2024， 35（3）： 633-637.

[4] 楊新雪， 梁進京， 董" 蕊. 柴胡-白芍藥對配方顆粒指紋圖譜的建立及多指標性成分含量測定[J]. 天然產物研究與開發， 2024， 36（4）： 572-580.

[5] 吳淑輝， 劉" 娟， 肖" 婷， 等. 丹潤方HPLC指紋圖譜及多成分含量測定研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2023， 43（10）： 1822-1829.

[6] 葉" 彬， 閆小巧， 雷" 婷， 等. 葛根藥材HPLC指紋圖譜與6種成分含量測定研究[J]. 中草藥， 2023， 54（24）： 8222-8227.

[7] 孫立麗， 王" 萌， 任曉亮. 化學模式識別方法在中藥質量控制研究中的應用進展[J]. 中草藥， 2017， 48（20）： 4339-4345.

[8] 閆" 艷， 葛雨竹， 張小倩， 等. 基于指紋圖譜的化學模式識別法和多指標測定評價枸杞不同部位的差異性[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2024， 44（7）： 1193-1202.

[9] 李軍山， 李雪利， 高" 杰， 等. 基于蛇床子配方顆粒的標準湯劑質量標準[J]. 世界中醫藥， 2020， 15（14）： 2043-2047， 2052.

10] 楊亞玲， 羅" 碧， 張" 紅， 等. 肉桂質量研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2020， 45（12）： 2792-2799.

[11] ONDER A， YILMAZ-ORAL D， JERKOVIC I， et al. Evaluation of relaxant responses properties of cinnamon essential oil and its major component， cinnamaldehyde on human and rat corpus cavernosum[J]. International Braz J Urol， 2019， 45（5）： 1033-1042.

[12] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 2020年版 四部[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 22.

[13] 周長征. 丁香柿蒂片的質量標準研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011， 17（15）： 80-83.

[14] 楊潔瑜. 母丁香質量標準研究[D]. 廣州： 廣州中醫藥大學， 2015.

[15] 張萌萌， 王" 丹， 魏大能， 等. 基于血清藥物化學的花椒溫中止痛的質量標志物研究[J]. 中草藥， 2022， 53（9）： 2731-2739.

〔收稿日期〕2024-09-26

〔基金項目〕湖南省自然科學基金項目（2022JJ80094，2024JJ6362）;湖南省衛生健康高層次人才項目（湘衛函〔2024〕43號）。

〔通信作者〕*楊" 磊，女，主任藥師，碩士研究生導師，E-mail：263649560@qq.com。