Gli基因及蛋白在肝細胞癌組織中的表達及與預后的關系

摘要：目的 探討Gli1、Gli2和Gli3基因及蛋白在肝細胞癌（HCC）組織中的表達特征及其與預后的關系。方法 利用cBioportal數據庫分析315例HCC樣本中Gli基因的表達情況，并通過免疫組織化學方法檢測40例HCC及其他肝臟組織中Gli蛋白的表達水平。結果 315例HCC樣本中57例（18.1%）出現Gli基因改變，Gli1、Gli2和Gli3的改變頻率分別為19例（6.0%）、13例（4.1%）和25例（7.9%）。Gli1與Gli2，Gli1與Gli3呈現顯著共存性（P＜0.05），而Gli2與Gli3表現出互斥趨勢。Gli1基因表達增加的患者無病生存率明顯降低（P＜0.01）。免疫組織化學結果顯示，Gli1蛋白在HCC組織中的表達顯著高于正常肝臟、癌旁組織、病毒性肝炎和肝硬化/肝纖維化組織（P＜0.05）。在HCC組織中，Gli蛋白間呈現出較強的正相關性（Gli1 vs. Gli2：rs=0.796；Gli1 vs. Gli3：r s=0.759；Gli2 vs. Gli3 rs=0.891，均P＜0.01）。53.3%（8/15）的HCC樣本同時呈現3種Gli蛋白的高表達，而在非癌肝組織中僅為11.8%（2/17）。結論 Gli1、Gli2和Gli3蛋白在HCC組織中普遍呈現協同高表達和顯著正相關，Gli1出現獨立高表達的特殊表達模式。

關鍵詞：肝腫瘤；轉錄因子；基因表達；Gli；cBioportal基因數據庫

中圖分類號：R735.7 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240977

Abstract： Objective To investigate the expression patterns of Gli1， Gli2 and Gli3 genes and proteins in hepatocellular carcinoma （HCC） tissue and their correlation with prognosis. Methods" Gli gene expression in 315 HCC samples were analyzed using the cBioportal database， and Gli protein expression was examined in 40 HCC and other liver tissue samples through immunohistochemistry. Results Gli gene alterations were found in 57 cases （18.1%） of HCC samples， with alteration frequencies of 19 cases （6.0%）， 13 cases （4.1%） and 25 cases （7.9%） for Gli1， Gli2 and Gli3， respectively. Gli1 showed significant co-occurrence with both Gli2 and Gli3 （P＜0.05）， while Gli2 and Gli3 exhibited a tendency toward mutual exclusivity. Increased Gli1 gene expression significantly correlated with decreased disease-free survival （P＜0.01）. Immunohistochemical analysis demonstrated that Gli1 protein expression was significantly higher in HCC tissue than that in normal liver tissue， adjacent tissue， hepatitis and cirrhotic tissue （P＜0.05）. In HCC tissue， strong positive correlation was observed between the three Gli proteins （Gli1 vs. Gli2： rs=0.796; Gli1 vs. Gli3： rs=0.759; Gli2 vs. Gli3：rs=0.891， all P＜0.01）. High expression levels of all three Gli proteins were detected in 53.3% （8/15） of HCC samples， compared to only 11.8% （2/17） in non-cancerous liver tissue. Conclusion Gli1， Gli2 and Gli3 proteins commonly exhibit synergistic high expression and significant positive correlation in HCC tissue， with Gli1 showing a special expression pattern of independent high expression.

Key words：liver neoplasms; transcription factors; gene expression; Gli; cBioportal gene database

肝細胞癌（HCC）是常見的原發性肝癌，近年來死亡率增長迅速，是癌癥相關死亡的第二大原因。由于缺乏有效的早期診斷方法，大多數HCC患者在確診時已屬晚期，且對系統性化療反應較差，5年生存率僅為19.5%［1］。研究表明，Hedgehog-Gli（Hh-Gli）信號通路的異常激活與肝臟疾病的發生發展密切相關，尤其在肝硬化過程中的祖細胞擴增、炎癥細胞募集及肝損傷修復中發揮關鍵作用［2］。Gli家族包括Gli1、Gli2和Gli3［3］，Hh-Gli信號通路主要通過這3種轉錄因子的活性平衡來調控其最終效應。其中，Gli1主要作為轉錄激活因子，而Gli2和Gli3則可在不同條件下發揮激活或抑制作用［4-5］。研究表明，Gli2和Gli3蛋白的功能轉換受到多種因素調控，包括翻譯后修飾和蛋白水平的調控［6］。在HCC中，Gli2的激活功能與腫瘤干細胞特性密切相關，而Gli3則通過其抑制功能參與腫瘤進展的調控［7］。然而，目前尚缺乏HCC中Gli家族因子表達水平的系統性比較的研究。為此，本研究擬通過利用cBioportal肝癌數據庫對HCC患者中Gli1、Gli2、Gli3的基因變化進行可視化分析，探討其在肝癌及其鄰近組織中的表達模式和相互關系，以期為HCC的早期診斷和預后評估提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HCC樣本 本研究利用cBioportal數據庫（https：//www.cbioportal.org/）中的肝癌數據集進行分析。選擇TCGA PanCancer Atlas中的肝癌數據集，包含348例HCC患者的臨床和基因組學數據。患者年齡16～90歲，中位年齡61歲，其中男232例（66.7%），女116例（33.3%），臨床分期Ⅰ期171例（49.1%），Ⅱ期84例（24.1%），Ⅲ期83例（23.9%），Ⅳ期4例（1.1%），分期不明6例（1.8%）。

1.1.2 組織芯片樣本 人肝臟組織芯片BC03002購自美國US Biomax公司，包含40例80個組織點（每例2個點，直徑1.5 mm）。樣本構成包括15例HCC、8例肝硬化/肝纖維化、5例病毒性肝炎、2例癌灶臨近正常組織、2例正常肝臟和8例膽管癌組織（不作為本研究探討目標）。為降低癌灶位置差異造成的結果偏差，選用3張連續切片進行分析。所有臨床病理資料由US Biomax公司提供。組織芯片的使用符合《赫爾辛基宣言》的倫理學原則，US Biomax公司確保所有樣本的采集均獲得了患者的知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 抗體及試劑 兔抗人Gli1多克隆抗體購自Novus Biologicals公司（美國）；兔抗人Gli2和Gli3多克隆抗體購自英國Abcam公司。SP-9001即用型免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。PBS緩沖液、檸檬酸抗原修復液、過氧化氫溶液等常規試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。抗鼠或抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 主要儀器 BenchMark ULTRA全自動免疫組化染色儀（美國Ventana Medical Systems公司）； Aperio AT2型數字病理切片掃描儀（德國Leica公司）；BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 cBioportal數據庫分析 登錄cBioportal數據庫，進入Repository界面，選擇文檔類型為RNA-seq，選擇病例類型Liver Hepatocellular Carcinoma，共獲得348例HCC數據。排除數據庫中腫瘤純度低于0.7的標本、石蠟包埋組織和重復標本后，共收集HCC標本315例。利用R程序（https：//www.r-project.org/）分析HCC組織Gli1、Gli2和Gli3表達與患者總生存率和無病生存率的關系。

1.3.2 免疫組織化學染色 將石蠟包埋的組織芯片切片于65 ℃孵育2 h，二甲苯中脫蠟復水后枸櫞酸鹽進行抗原修復，3%H2O2溶液孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。進一步用Gli1、Gli2和Gli3多克隆抗體（1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫放置15 min，最后用蘇木素與二氨基聯苯胺作顯色劑進行復染。由3位病理科醫生獨立對組織芯片的免疫組化結果進行評分。綜合組織染色強度和染色比例進行半定量分析，染色強度評分：0分（無色，無表達）；1分（淺黃色，弱表達）；2分（深黃色，中度表達）；3分（棕褐色，高表達）。陽性腫瘤細胞百分率評分：1分（0～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。將染色強度評分與陽性細胞比例評分的乘積除以12（最高總分），得到0～1之間的最終評分。最終評分＜0.4定義為低表達，≥0.4定義為高表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統計圖表?；蚋淖冾l率以例（%）表示；基因間的共存性分析采用比值比（OR值）和P值評估；采用Kaplan-Meier法進行生存分析，組間比較采用Log-rank檢驗；Gli蛋白表達水平以中位數和四分位數［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，Gli蛋白表達相關性分析采用Spearman相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Gli1、Gli2和Gli3基因改變頻率 結果顯示，315例HCC樣本中57例（18.1%）樣本出現Gli基因改變，其中Gli1、Gli2和Gli3的改變頻率分別為19例（6.0%）、13例（4.1%）和25例（7.9%）。Gli2主要表現為基因突變，而Gli1和Gli3主要以mRNA表達上調及基因擴增兩種形式為主，見圖1。

2.2 Gli基因改變的共存性和互斥性分析 Gli1和Gli2，Gli1和Gli3的表達變化存在共存關系（P＜0.05）。Gli2和Gli3的變化呈現互斥趨勢，但差異無統計學意義。見表1。

2.3 Gli基因改變與患者生存率的關系 生存分析顯示，Gli1基因高表達患者的無病生存率較低表達患者升高（P＜0.05），而在總體生存率方面差異無統計學意義。Gli2和Gli3的表達變化對HCC患者的總生存率和無病生存率均無影響（P＞0.05），見圖2。

2.4 Gli蛋白在肝細胞癌及其他肝臟組織中的表達模式 免疫組織化學染色顯示，Gli1、Gli2和Gli3蛋白主要定位于細胞質和細胞核，以核內表達更為明顯，呈棕褐色陽性染色，見圖3。Gli1蛋白在HCC組織中的表達顯著高于正常肝臟、癌旁組織、肝炎和肝硬化組織（P＜0.05）。Gli2和Gli3蛋白在HCC組織中的表達也明顯高于正常肝臟組織（P＜0.05），見表2。

2.5 Gli蛋白表達的相關性 在非癌肝組織中，Gli1與Gli2以及Gli1與Gli3的表達呈現低度相關或無明顯相關性（Gli1 vs. Gli2：rs=0.349，P=0.049；Gli1 vs. Gli3：rs=0.187，P=0.305），而Gli2與Gli3的表達水平呈高度正相關（rs=0.866，P＜0.01）。在HCC組織中，Gli2與Gli3的表達保持高度正相關（rs=0.891，P＜0.01）；Gli1與Gli2以及Gli1與Gli3的表達也呈現中度正相關（Gli1 vs. Gli2：rs=0.796，P＜0.01；Gli1 vs. Gli3：rs=0.759，P＜0.01）。

2.6 Gli蛋白共表達模式在肝細胞癌中的特征 通過三維散點圖分析Gli1、Gli2和Gli3蛋白的共表達模式，結果顯示HCC組織中，53.3%的（8/15）樣本同時呈現3種Gli蛋白高表達，而在正常肝臟、肝炎、肝硬化等非癌肝組織中，這一比例僅為11.8%（2/17）。在HCC組織中，Gli1的表達增幅最為顯著，Gli2和Gli3的表達增幅相對較小，但仍高于非癌組織。同時，13.3%（2/15）的HCC樣本僅表現出Gli1的高表達。非癌肝組織中Gli蛋白的表達水平普遍較低，且相對均衡，僅在部分肝炎和肝硬化樣本中Gli2和Gli3表達略有升高，見圖4。

3 討論

Gli轉錄因子調控的靶基因參與了細胞增殖、凋亡、干細胞再生、上皮間質轉化和血管生成［8］。Gli轉錄因子的過度活化與肝炎、肝硬化、肝細胞癌等疾病的發生發展密切相關［9］。本研究發現，18.1%的HCC樣本出現Gli基因改變，其中Gli1表達升高的患者無病生存率顯著下降，這表明Gli1可能在HCC的進展和復發中發揮重要作用。這一發現與Clara等［10］的報道一致，該研究認為HCC患者中Gli1的高表達與較短的無病生存期相關，Gli1可作為預后生物標志物。然而本研究未觀察到Gli1表達差異對總生存率的影響。Massah等［11］通過對HCC患者5年隨訪發現，Gli1高表達患者的總生存率下降。這一差異可能源于樣本量、隨訪時間或檢測方法的不同，提示需要進行更大規模、更長期的前瞻性研究來進一步驗證。

本研究發現Gli2和Gli3的表達水平對HCC患者的總生存率和無病生存率均不產生影響，這與Rodrigues等［12］的研究部分一致，該研究發現雖然Gli3與腫瘤大小呈現相關性，但同樣未證實兩者表達對預后有影響。值得注意的是，本研究首次發現Gli1與Gli3、Gli1與Gli2在基因水平上呈現共存性，而Gli2與Gli3則表現出互斥的趨勢。Gli蛋白在HCC的發生發展中表現出多重功能，作為轉錄調控因子，Gli1主要發揮轉錄激活作用，而Gli2和Gli3則可根據細胞微環境表現出雙向調控特性［13］。這些蛋白通過調控細胞周期相關基因（如Cyclin D1、p21和p27）影響HCC細胞的增殖與生長，同時在維持肝癌干細胞的特性和分化過程中發揮關鍵作用。此外，Gli蛋白還參與調控HCC細胞的遷移和侵襲能力，構成了肝癌進展的重要調控網絡。Matissek等［14］研究表明，Gli3作為Hedgehog信號通路的轉錄因子，存在全長活化型（GLI3-FL）和抑制型（GLI3-R）兩種形式。在不同分化程度的HCC中，這2種形式可能被差異性激活，從而通過調控Hedgehog基因及其下游靶點影響腫瘤的發展進程。此外，Gli基因表達的改變不僅影響HCC的發生發展，還可能與治療耐藥性相關。Wang等［15］報道，Hedgehog信號通路的激活可促進HCC對索拉非尼的耐藥。

本研究通過三維散點圖分析揭示了Gli蛋白在HCC中的獨特共表達模式。53.3%的HCC樣本同時呈現3種Gli蛋白高表達，而在非癌肝組織中僅為11.8%。這種協同高表達模式反映了Hedgehog信號通路在HCC中的全面激活。Hu等［16］研究表明，Hedgehog信號通路的持續激活可導致肝臟慢性損傷和纖維化。Ding等［17］進一步發現，在HCC樣本中Hedgehog信號通路的關鍵分子（包括SHh、Gli1和Gli2）均顯著上調，其中Gli2主要通過轉化生長因子β1（TGF-β1）/Smad 家族成員3（Smad3）介導的非經典途徑被激活。這提示Gli1可能主要作為轉錄激活因子促進腫瘤生長，而Gli2和Gli3則可能在調節腫瘤微環境和維持腫瘤干細胞特性等方面發揮作用［18］。值得注意的是，本研究中芯片檢測結果顯示，約13.3%的HCC樣本僅表現出Gli1的高表達，這一比例與Wu等［19］在HCC樣本中觀察到的Gli單獨高表達的比例相符，他們認為Gli1通過非經典途徑被激活，這可能解釋了部分樣本中Gli1獨立表達的現象。Gli蛋白共表達模式的形成機制可能涉及多個層面的調控。在轉錄水平，Niewiadomski等［20］研究表明，Gli蛋白之間存在復雜的正負反饋調節。在蛋白水平，Gli蛋白的穩定性和活性受到多種翻譯后修飾的影響［21］。

綜上所述，Gli1、Gli2和Gli3蛋白在HCC組織中普遍呈現協同高表達和顯著正相關，Gli1出現獨立高表達的特殊表達模式。然而，研究未能直接評估Gli蛋白的轉錄活性；其次，樣本量相對有限，可能影響了某些亞組分析的統計效能。未來將擴大樣本量，結合轉錄組學和蛋白質組學方法，深入探討Gli蛋白共表達的調控機制及其在HCC進展中的作用。

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（2024-07-21收稿 2024-12-12修回）

（本文編輯 胡小寧）