炎癥性腸病患兒血清AGR2、TMAO水平及與腸道菌群的相關(guān)性

摘要：目的 探討炎癥性腸病（IBD）患兒血清前梯度同源蛋白2（AGR2）、氧化三甲胺（TMAO）水平與腸道菌群的關(guān)系。方法 選取145例IBD患兒為觀察組，根據(jù)疾病類型分為潰瘍性結(jié)腸炎組64例和克羅恩病組81例，同時納入于本院進(jìn)行健康體檢的兒童140例作為對照組。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清AGR2、TMAO水平。分別采用改良梅奧（Mayo）評分和克羅恩病活動指數(shù)（CDAI）評分評估潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的疾病活動度，根據(jù)疾病活動度分為活動期組（75例）和緩解期組（70例）。采集患兒糞便樣本進(jìn)行腸道菌群培養(yǎng)鑒定和計數(shù)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析血清AGR2、TMAO水平對潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的診斷價值。Pearson檢驗分析血清AGR2、TMAO水平與腸道菌群的相關(guān)性。Logistic回歸分析血清AGR2、TMAO水平與IBD患兒疾病分期的關(guān)系。結(jié)果 潰瘍性結(jié)腸炎組、克羅恩病組血清AGR2水平低于對照組，TMAO水平高于對照組（P＜0.05）。血清AGR2、TMAO水平單獨(dú)和聯(lián)合診斷潰瘍性結(jié)腸炎的曲線下面積（AUC）為0.835、0.836、0.896，診斷克羅恩病的AUC為0.859、0.864、0.964。活動期組血清AGR2水平及乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量低于緩解期組，血清TMAO水平及大腸桿菌、腸球菌、幽門螺桿菌、鏈球菌數(shù)量高于緩解期組（P＜0.05）。IBD患兒血清AGR2水平與乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量呈正相關(guān)，與大腸桿菌、腸球菌、幽門螺桿菌、鏈球菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；血清TMAO水平與乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與大腸桿菌、腸球菌、幽門螺桿菌、鏈球菌數(shù)量呈正相關(guān)（P＜0.05）。血清AGR2水平降低、TMAO水平升高是IBD患兒疾病進(jìn)展為活動期的危險因素（P＜0.05）。結(jié)論 血清AGR2、TMAO聯(lián)合可有效診斷潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，且對克羅恩病診斷價值更高，二者表達(dá)異常可能通過影響腸道菌群結(jié)構(gòu)變化參與IBD疾病進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：炎性腸疾病；Crohn病；結(jié)腸炎，潰瘍性；兒童；前梯度同源蛋白2；氧化三甲胺；腸道菌群

中圖分類號：R725.74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20241934

Abstract： Objective To explore the relationship between serum levels of anterior gradient 2 （AGR2） and trimethylamine N-oxide （TMAO） and gut microbiota in children with inflammatory bowel disease （IBD）. Methods A total of 145 IBD children were selected as the observation group， and children were divided into the ulcerative colitis group （64 cases） and the Crohn's disease group （81 cases） according to the disease type. Meanwhile， 140 healthy children underwent physical examination in our hospital were included as the control group. Serum AGR2 and TMAO levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The disease activity of ulcerative colitis and Crohn's disease were evaluated using the modified Mayo score and the Crohn's Disease Activity Index （CDAI） score， and patients were divided into the active group （75 cases） and the remission group （70 cases） according to the disease activity. Fecal samples were collected for identification and count of intestinal flora. Receiver operating characteristic （ROC） curve was drawn to analyze the diagnostic value of serum AGR2 and TMAO levels in ulcerative colitis and Crohn's disease. The correlation between serum AGR2 and TMAO levels and intestinal flora was analyzed by Pearson test. Logistic regression was used to analyze the relationship between serum AGR2 and TMAO levels and the disease stage of children with IBD. Results The serum AGR2 level was lower in the ulcerative colitis group and the Crohn's disease group than that in the control group， and the serum TMAO level was higher than that in the control group （P＜0.05）. The areas under the curve （AUC） of serum AGR2 and TMAO levels were 0.835， 0.836 and 0.896 for diagnosis of ulcerative colitis alone and 0.859， 0.864 and 0.964 for diagnosis of Crohn's disease. The serum AGR2 level and numbers of lactobacillus and bifidobacterium were significantly lower in the active group than those in the remission group， and the serum TMAO level and numbers of Escherichia coli， enterococcus， Helicobacter pylori and streptococcus were significantly higher in the active group than those in the remission group （P＜0.05）. Serum AGR2 levels in IBD children were positively correlated with numbers of lactobacillus and bifidobacterium， and negatively correlated with numbers of Escherichia coli， Enterococcus， Helicobacter pylori and streptococcus （P＜0.05）. Serum TMAO level was negatively correlated with numbers of lactobacillus and bifidobacterium， and positively correlated with numbers of Escherichia coli， Enterococcus， Helicobacter pylori and streptococcus （P＜0.05）. The decreased serum AGR2 level and the increased TMAO level were risk factors for the disease progression to active stage in children with IBD （P＜0.05）. Conclusion The combination of serum AGR2 and TMAO can effectively diagnose ulcerative colitis and Crohn's disease， and it is more valuable in the diagnosis of Crohn's disease. Abnormal expression of both may participate in the progression of IBD disease by affecting changes in gut microbiota structure.

Key words： inflammatory bowel diseases; Crohn disease; colitis， ulcerative; child; anterior gradient 2; trimethylamine N-oxide; gut microbiota

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一組病因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎［1］。盡管目前已有較多研究針對IBD的診斷和治療進(jìn)行探討，但由于IBD的具體病因尚不清楚，導(dǎo)致該疾病的發(fā)病率仍較高，尤其在兒童群體中［2］。近年來，IBD與腸道微生物群及其代謝物之間的關(guān)系引起關(guān)注［3］。前梯度同源蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）是蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶家族成員，其表達(dá)常與結(jié)直腸癌等腫瘤增殖、遷移和侵襲相關(guān)［4］。既往研究表明，AGR2對黏液生成和黏膜穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，AGR2基因敲除小鼠表現(xiàn)出腸黏液損傷、結(jié)腸炎易感性增加［5］。氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）是一種腸道菌群衍生代謝產(chǎn)物，其高表達(dá)可促進(jìn)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病等炎癥性相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。全基因組關(guān)聯(lián)薈萃分析發(fā)現(xiàn)TMAO與IBD發(fā)病風(fēng)險相關(guān)［6-7］。AGR2、TMAO雖均與IBD炎癥損傷和易感性相關(guān)，但二者與IBD疾病進(jìn)展及腸道菌群的關(guān)系仍不明確。本研究通過探究血清AGR2、TMAO與IBD患兒腸道菌群及疾病活動度的關(guān)系，旨在為IBD的診斷和治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2022年9月—2024年4月西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院就診的145例IBD患兒為觀察組，其中男81例，女64例，年齡1～16歲，平均（7.25±2.18）歲。根據(jù)疾病類型分為潰瘍性結(jié)腸炎組64例和克羅恩病組81例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）IBD符合診斷和治療共識［8］。（2）臨床資料完整。（3）年齡＜18歲。（4）患兒近3個月未服用抗菌藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近3個月有他汀類、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素治療史。（2）有其他腸道相關(guān)疾病或手術(shù)史。（3）合并器質(zhì)疾病或腫瘤。納入同期于本院進(jìn)行健康體檢的兒童140例為對照組，其中男76例，女64例，年齡1～15歲，平均（7.30±2.25）歲。本研究符合倫理標(biāo)準(zhǔn)，已通過西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：20220113），患兒及監(jiān)護(hù)人配合樣本采集和治療，監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 血清AGR2、TMAO水平檢測 患兒就診當(dāng)天或次日采集空腹靜脈血2 mL，分離血清后，3 500 r/min離心15 min（半徑14.7 cm），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測AGR2、TMAO水平。ELISA試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司和武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司。

1.3 IBD疾病活動度評估 分別采用改良梅奧（Mayo）評分和克羅恩病活動指數(shù)（CDAI）評分評估潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的疾病活動度。其中Mayo評分包括4個項目（各項0—3分），總分0—12分，總Mayo評分≤2分且所有項目均≤1分為緩解期，否則為活動期；CDAI評分包括腹瀉、腹部包塊、腹痛、主觀狀態(tài)、并發(fā)癥數(shù)、服用腹瀉藥、血細(xì)胞比容、體質(zhì)量共8個項目，觀察1周計分，各項乘以規(guī)定權(quán)重為各自分值，總CDAI評分＜150分為緩解期，否則為活動期。145例中活動期組75例，緩解期組70例。

1.4 腸道菌群檢測 患兒就診當(dāng)天或次日采集10 g新鮮糞便，進(jìn)行10倍數(shù)稀釋后取10 μL，在不同固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，之后通過法國梅里埃的ATB Expression鑒定儀進(jìn)行菌群鑒定，腸道菌群數(shù)量以菌落培養(yǎng)對數(shù)lgN表示，單位為lgCFU/g。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以[[x] ±s

]表示，2組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析血清AGR2、TMAO水平對潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病的診斷價值，采用Z檢驗比較曲線下面積（AUC）；Pearson檢驗分析血清AGR2、TMAO水平與腸道菌群的相關(guān)性；采用Logistic回歸分析血清AGR2、TMAO水平與IBD患兒疾病分期的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和觀察組血清AGR2、TMAO水平比 較

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的臨床表現(xiàn)具有一定差異，但發(fā)病機(jī)制均涉及免疫系統(tǒng)和腸道微生物群的異常相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致腸道免疫失調(diào)，造成腸道黏膜局部破壞，引發(fā)眾多系統(tǒng)性并發(fā)癥［9-10］。腸道菌群失調(diào)與IBD疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)［11］。近年來，血清生物標(biāo)志物在IBD中的應(yīng)用受到臨床廣泛關(guān)注，其優(yōu)勢包括簡便易測、無創(chuàng)等［12］。因此，尋找IBD腸道菌群失調(diào)相關(guān)的血清生物標(biāo)志物可能對疾病的臨床輔助診斷、病情評估和治療均有重要意義。

在腸腔和身體之間建立物理屏障是腸道上皮層的關(guān)鍵功能，在胃腸道上皮用來阻止細(xì)菌進(jìn)入的眾多機(jī)制中，黏液屏障的形成至關(guān)重要［13］。AGR2普遍存在于哺乳動物胃、小腸、結(jié)腸、闌尾等消化道黏膜上皮的上皮細(xì)胞中，在杯狀腸細(xì)胞和潘氏細(xì)胞中均有高表達(dá)，且在回腸和結(jié)腸中的表達(dá)水平最高［14］。在杯狀腸細(xì)胞中，AGR2與黏蛋白2（MUC2）形成混合二硫鍵，AGR2調(diào)節(jié)MUC2的折疊和分泌，其中MUC2是胃腸道黏液的重要組成部分，覆蓋在胃腸道上皮表面［15］。Al-Shaibi等［16］研究認(rèn)為，人類AGR2缺乏導(dǎo)致黏液屏障功能障礙和嬰兒IBD。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，IBD患兒血清AGR2表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與有益菌乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量呈正相關(guān)，與有害菌幽門螺桿菌、大腸桿菌、腸球菌的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。分析原因可能是由于AGR2表達(dá)降低會抑制腸道細(xì)胞分泌MUC2，從而減少腸道黏液量，腸道無法抵御有害菌的入侵，導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)異常及炎癥水平增加，進(jìn)一步推動IBD疾病發(fā)生和發(fā)展。Logistic回歸分析進(jìn)一步驗證了血清AGR2表達(dá)降低是IBD進(jìn)展為活動期的危險因素。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，AGR2在診斷潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病中的AUC均大于0.8，且診斷克羅恩病的敏感度可達(dá)88.93%，提示AGR2是一種效果較優(yōu)的IBD輔助診斷血清生物指標(biāo)，且在臨床中有作為病情分期輔助評估指標(biāo)的潛力。

腸道微生物三甲胺（TMA）裂解酶將膽堿進(jìn)行代謝產(chǎn)生TMA，TMA經(jīng)宿主腸道吸收后運(yùn)輸至肝臟，并在宿主黃素單加氧酶作用下代謝轉(zhuǎn)化為TMAO，之后TMAO進(jìn)入到不同器官，在相應(yīng)部位被清除或是累積［17-19］。本研究中TMAO在IBD患兒中高表達(dá)，且與乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌等的數(shù)量均相關(guān)。究其原因，腸道微生物參與宿主的免疫系統(tǒng)，腸道菌群保持動態(tài)平衡可保護(hù)機(jī)體腸道免受侵害，當(dāng)菌群失衡時腸道微生物將膽堿代謝生成大量TMA，TMA被吸收到腸道上皮，隨后通過門靜脈循環(huán)傳遞到肝臟，進(jìn)而被宿主黃素單加氧酶代謝成TMAO，TMAO隨血液分布于全身，因此血清檢測水平顯著升高。Safwat El-Deeb等［20］研究發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖和/或雷公藤紅素可調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎中的腸道菌群失調(diào)和線粒體功能障礙，降低TMAO水平。此外，本研究發(fā)現(xiàn)活動期患兒血清TMAO水平更高，回歸分析顯示TMAO升高為IBD患兒疾病進(jìn)展為活動期的危險因素，提示血清TMAO檢測水平越高，腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡越嚴(yán)重，IBD患兒的疾病活動度越高，由此推測TMAO可能在IBD的病情分期中具有輔助評估價值。ROC曲線分析顯示TMAO對潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的診斷價值較佳，且TMAO與AGR2聯(lián)合診斷克羅恩病的敏感度和特異度均較高，對臨床輔助診斷具有較高參考價值。

綜上所述，IBD患兒血清AGR2低表達(dá)、TMAO高表達(dá)均與部分腸道菌群失調(diào)有關(guān)，且對輔助診斷潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病具有一定價值。臨床通過監(jiān)測血清AGR2、TMAO表達(dá)變化可能有利于病情程度評估，進(jìn)而為調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、腸道黏膜屏障功能、抑制病情進(jìn)展提供參考。然而，本研究僅為傳統(tǒng)的觀察性研究，容易受到混雜因素的影響，AGR2、TMAO對IBD的影響僅為本研究的推測，今后仍需要設(shè)置前瞻性隨機(jī)對照試驗驗證因果關(guān)系。此外，本研究中對照組未進(jìn)行糞便的菌群檢測，未能對同一患兒不同時期的菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行動態(tài)比較，今后將通過前瞻性研究納入相關(guān)兒童對比檢測。

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（2024-11-21收稿 2024-12-17修回）

（本文編輯 李志蕓）