茶樹BZR1基因家族的鑒定及CsBZR1-5響應干旱脅迫的分子機理研究

摘要：BZR1轉錄因子是油菜素內酯（Brassinosteroid，BR）信號轉導途徑中的關鍵轉錄因子，在植物生長發育以及脅迫響應過程中發揮重要的調節作用。基于茶樹基因組數據，鑒定并克隆了6個茶樹BZR1家族成員，分析了它們的基因結構、編碼蛋白的亞細胞定位和轉錄激活活性，并探究了它們在不同組織和干旱脅迫下的表達模式。結果表明，6個茶樹BZR1成員的內含子個數為2或3，其編碼蛋白都包含典型的bHLH特征結構域；亞細胞定位結果顯示，除了CsBZR1-1定位于細胞質和細胞核，其余CsBZR1s均定位于細胞核；轉錄激活活性分析表明，CsBZR1s在酵母中均具有轉錄激活活性；不同組織中的表達模式分析顯示，CsBZR1s在茶樹不同組織中的表達具有特異性，其中CsBZR1-1和CsBZR1-6的表達模式較為相似；干旱脅迫下的表達模式分析表明，6個CsBZR1基因均響應干旱脅迫，其中CsBZR1-5的表達持續被PEG模擬的干旱脅迫誘導。此外，ABA合成途徑中的關鍵酶基因CsNCED1在干旱脅迫下與CsBZR1-5的表達模式高度相似，凝膠電泳遷移試驗（Electrophoretic mobility shift azssay，EMSA）分析發現，CsBZR1-5能夠與CsNCED1啟動子上的E-box元件結合，說明CsBZR1-5可能參與調控了CsNCED1對干旱脅迫的響應過程。本研究系統分析了6個CsBZR1的基本特征和功能，為進一步闡明CsBZR1成員在茶樹生長發育和干旱脅迫響應中的調控作用奠定了基礎。

關鍵詞：茶樹；CsBZR1s基因；亞細胞定位；轉錄自激活；凝膠電泳遷移試驗

中圖分類號：S571.1；Q946" " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " "文章編號：1000-369X（2025）01-0015-14

Cloning of BZR1 Gene Family in Tea Plants and Molecular Mechanism Study of CsBZR1-5 Response to Drought Stress

DONG Yuan1， ZHANG Yongheng2， XIAO Yezi3， YU Youben3*

1. Yangling Vocational amp; Technical College， Yangling 712100， China; 2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China; 3. Northwest Aamp;F University， Yangling 712100， China

Abstract： The BZR1 transcription factor is a key transcription factor in the brassinosteroid （BR） signaling pathway， playing an important regulatory role in plant growth， development， and stress response. This study identified and cloned six members of the BZR1 family in tea plants based on genomic data. Their gene structures， subcellular localization of encoded proteins， and transcriptional activation activities were analyzed， and their expression patterns under different tissues and drought stress were explored. The results show that the number of introns in the 6 BZR1 members of tea plants was 2 or 3， and their encoded proteins all contained typical bHLH characteristic structural domains. Subcellular localization analysis shows that except for CsBZR1-1， which was localized in the cytoplasm and nucleus， all other CsBZR1s were localized in the nucleus. Transcriptional activation activity analysis shows that CsBZR1s exhibited transcriptional activation activity in yeast. The analysis of expression patterns in different tissues shows that CsBZR1s had specificity in expression in different tissues of tea plants， among which the expression patterns of CsBZR1-1 and CsBZR1-6 were relatively similar. The expression pattern analysis under drought stress shows that all six CsBZR1 genes were responsive to drought stress. The expression of CsBZR1-5 was continuously induced by drought stress simulated by PEG. In addition， the expression pattern of the key enzyme gene CsNCED1 in ABA synthesis pathway was highly similar to that of CsBZR1-5 under drought stress. The analysis of Electrophoretic Mobility Shift Assay （EMSA） found that CsBZR1-5 can bind to the E-box element on the CsNCED1 promoter， indicating that CsBZR1-5 may be involved in regulating the response of CsNCED1 to drought stress. This study systematically analyzed the basic characteristics and functions of six CsBZR1 members， laying the foundation for further elucidating the regulatory roles of CsBZR1 members in tea plant growth and development and drought stress response.

Keywords： tea plant， CsBZR1s gene， subcellular localization， transcriptional self-activation， EMSA

BZR1是油菜素內酯（Brassinosteroid，BR）信號轉導中的關鍵轉錄因子，其編碼蛋白含有典型的bHLH結構域，能夠與啟動子區域的BRRE（CGTGTG或CGTGCG）或E-box（CANNTG）順式作用元件結合并調控一系列靶基因的表達[1]，從而廣泛參與植物對干旱脅迫[2]、鹽脅迫[3]、冷脅迫以及高溫脅迫等非生物逆境的響應[4-5]，調控植物株型[6]、細胞伸長與分裂[7]、光形態建成[8]、氣孔發育和運動[9]、花期和育性[10]、種子大小和形狀等[11]。

目前，多種植物中的BZR1轉錄因子家族成員都已明確。比如，在擬南芥中鑒定出8個[12]、番茄中9個[13]、玉米中11個[14]、黃瓜中6個[15]、南瓜中8個[16]。不同物種的BZR1轉錄因子家族成員在植物生長發育和逆境響應的調控網絡中發揮功能。擬南芥中關于BZR1家族基因功能的研究較為豐富，研究發現，BZR1通過直接靶向MKK9和FAMA這兩個與氣孔發育有關的基因來調控擬南芥黃化子葉的氣孔發育[17]；BZR1蛋白可以和其他蛋白互作調控植物生長發育，例如，BZR1、ARF6和PIF4組成的BAP模塊是植物生長發育的分子樞紐，BAP模塊的組件相互作用形成一個整合了光、油菜素內酯和生長素信號的復雜系統[18]。另一項研究發現，在水稻中的磷供應充足或缺磷條件下，OsSPX1/2與OsBZR1相互作用從而平衡植物生長和免疫[19]。在番茄中的研究發現，BZR1參與BR誘導的自噬，過表達BZR1的番茄植株中，BR處理促進了自噬小體的形成和自噬相關基因（ATGs）的轉錄，而在沉默BZR1的植株中，BR的作用被削弱[20]。

干旱脅迫是影響植物生長的重要因素。研究表明，BZR1轉錄因子在植物干旱脅迫響應中發揮重要作用。研究發現，葡萄、紫花苜蓿等植物中的BZR1家族基因在干旱脅迫下的表達水平均發生顯著變化[21-22]。擬南芥BES1蛋白能夠直接負調控干旱響應基因RD26的表達[2]。玉米中的研究表明[23]，ZmBES1/BZR1-5通過調節多種脅迫相關基因的表達，降低了轉基因擬南芥對植物激素脫落酸（ABA）的敏感性，增強了滲透脅迫耐受性。此外，NCED是ABA合成過程的關鍵限速酶基因，其表達水平的快速升高導致ABA積累，是植物應對干旱脅迫的重要策略。例如，在129B08/nced3擬南芥突變體中異源表達水稻OsNCED4能夠增強其耐旱性[24]；西葫蘆CpNCED1～6在干旱脅迫下均上調表達[25]。

茶樹是我國重要的多年生經濟作物。近年來，隨著茶樹基因組的不斷完善，有學者對不同茶樹品種中的BZR1家族成員進行了生物信息學分析和比較，并且對該基因家族成員在激素和非生物脅迫處理下的表達量進行了分析[26]。然而，CsBZR1s基因參與干旱脅迫響應的分子機理相關的研究尚未深入。為進一步探究CsBZR1s響應干旱脅迫的分子機制，本研究在對6個CsBZR1s基因進行克隆、表達模式分析、亞細胞定位和轉錄活性分析的基礎上，開展了CsBZR1-5和ABA合成過程關鍵限速酶基因CsNCED1啟動子互作的研究，從而為CsBZR1s基因參與茶樹響應干旱脅迫的分子調控網絡研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

以一年生‘陜茶1號’茶樹水培苗為試驗材料（適應水培40 d后），取其新梢的第一葉、第二葉、第三葉、第一莖段、第二莖段、側根及根尖7個組織的樣品，用于分析CsBZR1s基因在不同組織中的表達水平。取其一芽二葉的樣品，用于合成基因克隆所需的cDNA。使用15% PEG-6000對一年生‘陜茶1號’茶樹水培苗進行干旱處理，分別于0、4、12、24 h取一芽二葉用于分析CsBZR1s基因在干旱脅迫下的表達模式。將采集的樣品立即冷凍在液氮中，并于﹣80 ℃保存，用于后續分析。每個樣品取3個獨立的生物學重復。

1.2 茶樹BZR1家族成員的克隆與生物信息學分析

從茶樹基因組中提取CsBZR1s基因的CDS序列[27]，在Primer Primer 5軟件中設計引物，以‘陜茶1號’茶樹一芽二葉cDNA為模板進行PCR擴增，將測序后和基因組報道序列比對一致的菌液保存至﹣80 ℃冰箱，用于后續研究。克隆所用引物序列見表1。在MEGA X軟件中采用鄰接法構建系統進化樹（Bootstrap=1 000），其余參數為默認值；利用GSDS 2.0在線網站（https：//gsds.gao-lab.org/index.php）對CsBZR1s基因結構進行分析；利用DNAMAN軟件進行氨基酸多序列比對；在MEME在線網站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）上進行Motif分析；利用EXpasy在線網站（https：//web.expasy.org/protscale）分析CsBZR1s蛋白的理化性質。

1.3 RNA提取、cDNA合成與RT-qPCR分析

茶樹樣品的總RNA提取使用植物總RNA提取試劑盒（天根，北京），使用NanoDrop 2000超微量紫外-可見分光光度計（賽默飛，美國）檢測RNA質量和濃度。參照cDNA第一鏈試劑盒（諾唯贊，南京）說明書合成cDNA，并將用于RT-qPCR分析的cDNA稀釋至相同濃度。通過RT-qPCR分析CsBZR1s基因在茶樹不同組織中的表達模式以及CsBZR1s和CsNCED1基因在干旱脅迫下的表達模式。在Primer Primer 5軟件中設計特異性定量引物，以茶樹GADPH為內參基因，根據ChamQ SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊，南京）的說明書配制反應體系，利用LightCycler? 480熒光定量系統進行RT-qPCR分析。每個時間點設置3個生物學重復，每個生物學重復進行兩次技術重復。RT-qPCR引物見表1。Ct值取平均值，在Excel軟件中采用 算法分析數據，利用IBM SPSS軟件分析顯著性。

1.4 茶樹BZR1的亞細胞定位與轉錄激活活性分析

為了研究CsBZR1s在細胞中的定位，將去掉終止密碼子的CsBZR1s基因CDS序列構建到pCAMBIA-2300-GFP載體上，獲得pCAMBIA-2300-CsBZR1s-GFP重組質粒。構建熒光過表達載體所用引物見表1。參考GV3101感受態說明書（上海唯地生物技術有限公司），將上述重組質粒導入農桿菌中。按照以下配方配制煙草浸染液：在100 mL ddH2O中加入0.213 g 2-嗎啉乙磺酸（2-Morpholinoethanesulfonic acid）、0.203 g MgCl2·6H2O和15 μL 1 mmol·L-1乙酰丁香酮（Acetosyringone）后，用KOH調節浸染液的pH至5.7。將擴繁的農桿菌菌液培養至OD600=0.5后5 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后用浸染液重懸菌液沉淀，使OD600=0.5，于28 ℃搖床200 r·min-1避光活化2～3 h。用1 mL注射器（去掉針頭）將浸染液緩慢打入4周齡煙草葉片中，做好注射區域的標記。暗處理72 h后，參考原生質體制備及轉化試劑盒使用說明書（酷萊搏，北京），提取煙草葉片注射區域的原生質體，并通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察GFP熒光信號。

為探究CsBZR1s的轉錄活性，將其構建到pGBKT7酵母表達載體中，獲得pGBKT7- CsBZR1s重組質粒。構建酵母表達載體所用引物見表1。參考Y2H感受態細胞說明書（上海唯地生物技術有限公司），將重組質粒、陽性對照和陰性對照質粒轉進Y2H-Gold細胞中進行培養，并在SD/-Trp平板上培養細胞。3 d后，用10 μL無菌水稀釋單個酵母菌落，并將5 μL菌液接種到SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade+X-a-Gal平板上，在30 ℃下觀察酵母生長情況3～4 d。

1.5 凝膠遷移電泳（EMSA）試驗

將CsBZR1-5構建到蛋白表達載體pGEX-4T-1（GST）上以獲得重組質粒GST- CsBZR1-5，并將重組質粒轉化到蛋白表達菌株Rosetta 2（DE3）pLysS中，在帶有氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中擴繁至OD600約為0.6時，加入1 mmol·L-1 IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-thiogalactoside）誘導目的蛋白表達。參考GST標簽蛋白純化試劑盒說明書對成功誘導后的蛋白進行純化，并采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白純化效果，純化后的GST-CsBZR1-5蛋白用于EMSA試驗。構建蛋白表達載體所用引物序列見表1。根據目的基因CsNCED1啟動子序列設計帶有生物素標記的特異性探針，參照化學發光法EMSA試劑盒說明書檢驗GST-CsBZR1-5蛋白與特異性探針的結合情況。

2 結果與分析

2.1 CsBZR1s基因克隆及結構分析

本研究以‘陜茶1號’茶樹一芽二葉的cDNA為模板，克隆獲得6個CsBZR1s基因，分別命名為CsBZR1-1、CsBZR1-2、CsBZR1-3、CsBZR1-4、CsBZR1-5、CsBZR1-6。將測序獲得序列用于進化分析、基因結構和理化性質分析。與擬南芥、水稻、棗樹和葡萄BZR1家族的系統進化分析結果顯示（圖1），CsBZR1-1和CsBZR1-3與VvBZR1-5聚為一支，CsBZR1-2與VvBZR1-2聚為一支，CsBZR1-4、CsBZR1-5、CsBZR1-6與ZjBZR1、ZjBZR2、VvBZR1-3聚為一支。對CsBZR1s基因的結構分析顯示（圖2），只有CsBZR1-1包含3個外顯子，其余CsBZR1基因都只含有2個外顯子。對CsBZR1蛋白進行理化性質分析，如表2所示，CsBZR1蛋白的氨基酸數目為311～377；6個CsBZR1蛋白的等電點為7.61～9.25，均大于7，呈堿性；分子量在33.97～40.58 kDa。

2.2 CsBZR1s蛋白多序列比對及保守基序分析

多序列比對結果表明（圖3A），CsBZR1蛋白具有BES1/BZR1蛋白結合靶基因的關鍵部分，即典型的bHLH結構[28-29]。為進一步探究CsBZR1蛋白的保守性，對CsBZR1s的蛋白保守基序進行分析，結果如圖3B、C所示，共鑒定到8個基序，依次命名為基序1至基序8。所有CsBZR1蛋白都包含基序1、基序2、基序3、基序4和基序5，其中基序1和基序2為bHLH結構域保守基序。此外，CsBZR1-1、CsBZR1-2和CsBZR1-3缺失了基序6和基序8，CsBZR1-4、CsBZR1-5和CsBZR1-6缺失了基序7。

2.3 CsBZR1蛋白在細胞中的定位及在酵母中的轉錄激活活性分析

為探究CsBZR1s蛋白的亞細胞定位情況，在煙草葉片原生質體中表達了CsBZR1s-GFP融合蛋白。結果顯示（圖4A），CsBZR1-1在細胞核和細胞質中均觀察到熒光，其余CsBZR1蛋白均只能在細胞核觀察到熒光，說明CsBZR1-1定位于細胞質和細胞核，而其余CsBZR1成員均定位于細胞核。為探究CsBZR1轉錄因子在酵母中是否具有轉錄激活活性，將pGBKT7-CsBZR1s重組質粒轉入酵母細胞中。通過觀察酵母生長情況發現（圖4B），只有陰性對照在SD/-Trp-His-Ade +X-α-Gal固體培養基上沒有顯藍色，陽性對照以及6個pGBKT7-CsBZR1s均能夠正常生長并顯藍色，說明6個CsBZR1s蛋白在酵母細胞中均具有轉錄激活活性。

2.4 CsBZR1s基因在不同組織中的表達模式分析

利用qRT-PCR檢測了CsBZR1s在不同成熟度葉片（第一葉、第二葉和第三葉）、莖段（第一莖段和第二莖段）和根（側根和根尖）中的表達情況（圖5A）。7個組織中的CsBZR1s的表達模式顯示，6個CsBZR1s基因在茶樹不同組織中的表達具有差異性（圖5B）。CsBZR1-1和CsBZR1-3在莖中的表達量較高，CsBZR1-2在葉片中的表達量較高，CsBZR1-4在各個組織中廣泛表達，CsBZR1-5在根中的表達量較高，而CsBZR1-6在第三葉和莖中的表達量較高，在根中的表達量較低。CsBZR1s基因表達量的差異暗示著它們分別參與茶樹不同組織的發育過程。

2.5 CsBZR1基因在干旱脅迫下的表達模式分析

為了分析CsBZR1在PEG模擬的干旱脅迫下的表達模式，進行了qRT-PCR分析，結果表明，CsBZR1-2和CsBZR1-3在處理后的變化趨勢相反，CsBZR1-2在處理4 h時顯著下調，CsBZR1-3在處理4 h時顯著上調（圖6）。CsBZR1-4和CsBZR1-5在處理后的變化趨勢基本一致，值得注意的是，CsBZR1-5的表達量在處理后的24 h內持續顯著上調。CsBZR1-6在受到脅迫后始終處于下調水平。CsBZR1-1無顯著性變化。

2.6 CsBZR1-5與干旱響應基因CsNCED1啟動子結合

PEG處理結果表明（圖7A），脅迫處理4 h開始，CsNCED1的表達量與0 h相比一直顯著上調，12 h時的表達量與0 h相比上升了約60倍，說明CsNCED1響應干旱脅迫。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果說明成功純化出了GST-CsBZR1-5重組蛋白（圖7B）。EMSA試驗結果顯示（圖7C），含有GST-CsBZR1-5純化重組蛋白的泳道檢測到其與CsNCED1啟動子G-box元件結合，而GST對照則不能；并且信號隨著蛋白濃度增加而增強，而隨著競爭探針濃度的增加而減弱。這一結果說明，CsBZR1-5能與CsNCED1啟動子上的G-box元件結合。先前研究表明，BR信號能影響ABA積累來調控茶樹的干旱脅迫響應過程[30]，本研究發現，CsNCED1的表達受到PEG處理誘導，且CsNCED1的啟動子上包含BZR1轉錄因子能夠特異性結合的G-box（CACGTG）元件，因此推測CsBZR1-5通過調控ABA合成限速酶基因NCED以應對干旱脅迫。

3 討論

BZR1轉錄因子是當前植物抗逆分子機制研究領域的熱點，許多物種中的BZR1家族成員已得到鑒定和克隆。本研究以在陜西推廣的優良茶樹品種‘陜茶1號’為材料，成功克隆出6條CsBZR1s基因，并對其基因序列、蛋白序列進行分析以初步預測其基因功能。基因結構分析表明，6個CsBZR1s基因的結構較為相似，都只包含2個或3個外顯子，這與其他植物中的BZR1相同[31-33]。與擬南芥和水稻BZR1s的多序列比對發現，6個CsBZR1s的N端都具有BZR1蛋白典型的bHLH結構域，該結構域在擬南芥和水稻中高度保守。

蛋白質在細胞中的定位為預測其功能提供參考。轉錄因子通常定位于細胞核，也有一些轉錄因子同時定位于細胞質和細胞核中，例如，轉錄因子KNOX在細胞質和細胞核中均有分布[34]。大豆中的研究發現，GmBZR1.11同時定位于細胞膜和細胞核[32]。本研究結果顯示，只有CsBZR1-1定位于細胞質和細胞核中，其余CsBZR1s定位于細胞核。本研究通過轉錄激活活性分析進一步推測CsBZR1s的功能，結果表明，6個CsBZR1s在酵母中均有轉錄激活活性，說明其可以通過激活下游靶基因參與轉錄調控。

據研究報道，BZR1轉錄因子參與植物不同器官發育過程。擬南芥中的研究發現，BEH1和BEH3分別在蓮座葉和根中表達最強，推測BEH1和BEH3蛋白分別參與蓮座葉和根的發育[35]。本研究結果顯示，6個CsBZR1s基因在茶樹不同器官中的表達模式也存在差異，說明不同的CsBZR1成員可能各自在不同組織中發揮作用。此外，CsBZR1-1和CsBZR1-6有相似的組織特異性，說明表達模式類似的CsBZR1成員之間可能存在功能冗余，這與芹菜中的研究一致[36]。在不同植物中的研究表明，BZR1轉錄因子參與響應干旱脅迫。玉米中的研究發現[37]，16% PEG-6000脅迫處理下，葉片和根中ZmBES1/BZR1-7的表達量發生顯著上調或下調。本研究對茶樹進行PEG脅迫處理后，發現CsBZR1-2/3/4/5/6的表達水平受到干旱脅迫誘導，其中CsBZR1-5的表達水平隨著脅迫時間增加逐漸上升，暗示其在茶樹干旱脅迫響應中發揮重要作用。此外，CsBZR1-1的表達水平在干旱脅迫下未發生顯著變化，在馬鈴薯中發現類似的現象[38]，說明這些基因可能不參與響應干旱脅迫。

轉錄因子通過與靶基因啟動子上的元件結合調控其表達，或與轉錄因子相互作用，參與植物響應脅迫后的轉錄調控網絡。擬南芥中，BES1直接與WRKY轉錄因子互作，負調控擬南芥的抗旱性[39]。小麥中的研究發現，TaBZR2通過激活TaGST1轉錄正向調控小麥的耐旱性[40]。類似的，在油菜中的研究發現，AtDWF4正調控植物對干旱的抗性，過表達AtDWF4的甘藍型油菜中BZR1/BES1表達上調，說明BZR1/BES1可能參與植物干旱應答[41]。ABA是植物響應干旱的重要激素，NCED是ABA合成途徑關鍵酶。研究表明，BR和ABA在茶樹應對干旱脅迫時發揮協同作用[42]。然而，在茶樹中關于BR信號通路下游關鍵轉錄因子BZR1和ABA信號通路相關基因的調控網絡參與干旱脅迫響應的研究尚未報道。谷子中的研究發現，NCED家族中Seita. 2G035400基因的表達量在干旱脅迫下顯著升高[43]。本研究結果與水稻中OsNCED4相似[24]，CsNCED1在干旱處理下顯著上調表達。本研究發現CsBZR1-5能夠與CsNCED1啟動子上的G-box（CACGTG）元件結合，因此推測CsBZR1-5通過調控CsNCED1表達促進ABA合成從而提高茶樹抗旱性。

綜上所述，本研究進一步明確了CsBZR1s轉錄因子在茶樹生長發育過程及脅迫響應中的作用，明確了CsBZR1-5能夠響應干旱脅迫并調控ABA合成關鍵基因CsNCED1的表達，但CsBZR1-5響應干旱的調控網絡和分子機制還需要深入研究。本研究結果為探究茶樹BZR1轉錄因子家族的生物學功能奠定了基礎，并為研究茶樹響應干旱脅迫的機制提供了科學依據。

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